全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 9期，第 2453-2459页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.9, 2453-2459
研究报告
Research Report
珍稀濒危植物距瓣尾囊草(Urophysa rockii Ulbr) SCoT-PCR分析体系的
建立与优化
张波 1 陆世家 1 石力 1 邹大方 1 王德怀 1 徐双燕 1 龙治坚 1* 韩国辉 2*
1西南科技大学生命科学与工程学院,绵阳, 621010; 2重庆市农业科学院果树研究所,重庆, 401329
*通讯作者, long20053182@126.com; hghui2007@126.com
摘 要 为研究距瓣尾囊草种质资源遗传背景和系统进化提供理论依据和技术支持，本研究利用 L16(45)正
交设计，研究 Mg2+等 5个因素对 PCR扩增结果的影响。研究结果表明，在距瓣尾囊草 SCoT-PCR的最优
反应体系(20 μL)中，Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物以及模板 DNA 等 5 个因素的最优浓度分别是
2.188 mmol/L、0.113 mmol/L、1.0 U、0.625 μmol/L和 30 ng。在此基础之上，从 18条引物中初步筛选出 12条
扩增结果稳定、条带清晰的 SCoT引物。建立了距瓣尾囊草 SCoT-PCR反应体系，经过 18条引物和 13份种
质资源的验证，证明体系稳定性好、可靠性高，能满足距瓣尾囊草分子水平上的研究。
关键词 距瓣尾囊草, SCoT标记,正交设计,遗传背景
Establishment and Optimization of SCoT-PCRSystem of an Endangered and
Rare Species Urophysa rockii Ulbr
Zhang Bo 1 Lu Shijian 1 Shi Li 1 Zou Dafang1 Wang Dehuai 1 Xu Shuangyan1 Long Zhijian1* Han Guo-
hui 2*
1 College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, 621010; 2 Fruit Research Institute of
Chongqing Agriculture Science Academy, Chongqing, 401329
* Corresponding authors, long20053182@126.com; hghui2007@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.002453
Abstract Orthogonal design of L16(45) was applied to optimize SCoT-PCR amplification system of Urophysa rockii
Ulbr in five factors such as Mg2+, dNTPs, primer, Taq DNA polymerase and template DNA. An optimal reaction
system of Urophysa rockii Ulbr was established. PCR reaction mixtures contained Mg2+ 2.188 mmol/L, dNTPs
0.113 mmol/L, Taq DNA polymerase 1.0 U, primer 0.625 μmol/L and template DNA 30 ng. 18 SCoT primers and13
different Urophysa rockii Ulbr populations were used to test the optimized reaction system. Ideal results with high
stability and clear polymorphic bands were obtained. The SCoT system established in this reportis useful for genetic
diversity analysis ofUrophysa rockiiUlbr, which possesses considerable potential forUrophysa rockiiUlbr breeding.
Keywords Urophysa rockiiUlbr.,Start codon targetedpolymorphism,Orthogonaldesign,Geneticanalysis
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31400333)、西南科技大学实验室开放基金(15xnkf02)、西南科技大学大学生创新基
金(CX16-066)和重庆市科委重大项目(cstc2013yykfc80002)共同资助
距瓣尾囊草(Urophysa rockii Ulbr.)是毛茛科(Ra-
nunculaceae)耧斗菜亚族(Aquilegiinae)尾囊草属(Uro-
physa Ulbr.)植物，全球仅在中国的四川省江油市涪
江上游区段有少量的自然分布，是我国特有的珍稀
濒危植物(Du and Yang, 2010)。除尾囊草属外，耧斗
菜亚族还包括耧斗菜属(Aquilegia)和天葵属(Semi-
aquilegia) (李春雨, 2006)。在该亚族中，耧斗菜属植
物主要含黄酮类、三萜皂苷和少量生物碱，具有抗氧
化、抗菌、保护肝脏等药用功能；而天葵属植物具有
清热解毒，利水渗湿，治疗痈疽疮毒等药用功能，是
重要的药用植物之一(彭勇等, 2006)。同时，距瓣尾囊
草因其花瓣有囊状的距而在系统演化上处于较为独
特的地位，有研究认为天葵属可能起源于耧斗菜属
和尾囊草属杂交的祖先(李春雨, 2006)。据此，笔者推测
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
距瓣尾囊草可能具有相近的药用功能，极具研究价值。
目前，关于距瓣尾囊草的研究主要集中于系统
进化、形态学、文献考证、生存现状、保护措施、生物生
态学特性等方面(李春雨, 2006; Du and Yang, 2010;
赵亮, 2011;张云香等, 2013a)；而在遗传多样性、群居
结构和亲缘关系方面研究甚少。这不利于该物种遗
传背景的评估、种群复壮和保护策略的制定、药用价
值的开发等方面的研究。
SCoT是一种可以产生与性状相联系的新型分
子标记(Collard and Mackill, 2009)。较其它分子标记
而言，该标记具有独特的优势(熊发前等, 2009; Luo
et al., 2010, Luo et al., 2011; Jiang et al., 2011; Amir-
moradi et al., 2012)。目前，已经成功应用于铁皮石
斛、益母草、玄参以及桃儿七等药用植物的研究(徐旭
栋等, 2012;陈大霞等, 2012;张维瑞等, 2013;陈大霞
等, 2013)。本研究建立并优化其反应体系，对建立的
技术体系进行验证，并初步筛选引物，以期为 SCoT
标记在距瓣尾囊草遗传背景研究，天葵属与耧斗菜
属、尾囊草属之间亲缘关系的探讨等方面的应用提
供参考。
1结果与分析
1.1 DNA提取与检测
距瓣尾囊草基因组 DNA的提取采用 CTAB法。
所得 DNA在 0.8%琼脂糖凝胶电泳上检测。电泳结
果表明，基因组 DNA的条带明亮而清晰，各泳道的
加样孔无白色杂质残留，表明所得 DNA浓度较高、
纯度好。条带略有拖尾，但对试验无影响。这表明，所
得的距瓣尾囊草基因组 DNA能满足试验的需要。
1.2 SCoT-PCR正交设计试验结果的直观分析
根据 L16(45)正交设计试验结果(图 2)，由于反应
体系里每个因素的水平不同，导致扩增结果也存在
图 2距瓣尾囊草 SCoT-PCR正交试验分析
注: M: DL2000 marker; 1~16:表 4的处理组合编号
Figure 2 Analysis of Urophysa rockii Ulbr SCoT-PCR orthogonal
test
Note: M: DL2000 marker; 1~16: The codes of orthoronical de-
sign in table 4
图 1 DNA琼脂糖电泳
注: M: DL 2000 marker; 1~6:样品 DNA
Figure 1 Genomic DNA electrophoresis
Note: M: DL 2000 marker; 1~6: Refers to DNA samples
着明显的差异。尽管每个组合均能扩增出条带，但条
带数量、清晰度有所不同。组合 1至 4，虽然条带少而
模糊，但其亮度和清晰度逐渐增加；组合 5、9、10和
13的条带模糊不清；组合 6和 14的条带分散性较
好，但清晰度低，丰度性差；只有组合 7、8、11、12、15
以及 16的扩增效果最好，尤其是 12和 16，其条带不
仅丰富，且清晰度高、亮度适中、分散性好。参考秦国
新(2012)的分析方法，对试验结果进行直观性评分，
并对评分结果进行统计分析。
极差 R值是反映该试验因素对反应体系影响程
度的大小。R值越大，代表该因素对试验反应体系影
响越大；反之，则越小。据 L16(45)正交设计直观分析
(表 1) 可以得出，5个因素对距瓣尾囊草 SCoT-PCR
反应体系影响程度大小依次为：dNTPs>Taq DNA聚
合酶>引物>Mg2+>模板 DNA。结合 k值分析，可以确
定 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物以及模板
DNA等 5个因素的最适浓度分别是 2.188 mmol/L、
0.113 mmol/L、1.0 U、0.625 μmol/L、20 ng。进一步分
析发现，L16(45)正交设计表的任一个组合均未将这为
接近。前者在酶和 DNA模板浓度上与之存在差异；
而后者表现在Mg2+和引物方面。
由曲线效应图(图 3)可知，在本试验中，随着Mg2+
浓度的提高，每个水平的得分均值呈现先增后减的趋
势，其浓度为 2.188 mmol/L效果最佳；TaqDNA聚合
酶在 1.0 U和 1.5 U水平间表现差异显著，从经济角度
考虑，因此 TaqDNA聚合酶的最适用量为 1.0 U；而引
物在 0.625 μmol/L和 0.875 μmol/L两个水平的得分
呈下降趋势，也结合经济考虑，选择前者为最优水平；
至于模板 DNA，其对反应体系的影响最小，各水平
之间的差异不显著，最终以 30 ng为最适用量。故而，
在距瓣尾囊草 SCoT-PCR 的最优反应体系(20 μL)
中，Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物以及模板
2454
表 1正交设计直观分析
Table 1 Intuitive analysis for orthogonal design
结果
Result
k1
k2
k3
k4
R
Mg2+
6.50
8.00
8.75
8.50
2.25
dNTPs
2.75
6.00
10.00
13.00
10.25
Taq DNA聚合酶
Taq DNA polymerase
9.75
8.75
7.50
5.75
4.00
引物
Primer
9.50
8.00
7.00
7.25
2.50
模板 DNA
Template DNA
8.25
8.50
7.75
7.25
1.25
图 3 Mg2+, dNTPs, Taq DNA聚合酶,引物和模板 DNA等 5个
因素的效应分析
Figure 3 Curve effect of Mg2+, dNTPs, Taq DNA polymerase,
primer and template DNA
DNA等 5个因素的最优浓度分别是 2.188 mmol/L、
0.113 mmol/L、1.0 U、0.625μmol/L和 30 ng。
1.3最佳反应体系的验证和引物的筛选
1.3.1不同引物对反应体系验证和引物的筛选
以 2号材料的 DNA为模板，选用不同 SCoT引
物对试验所建立的 SCoT-PCR最佳反应体系的稳定
性和可靠性进行验证。由图 4可以看出，绝大多数
SCoT引物都能在 2号材料中扩增出条带。每个引物所
得的条带数介于 2~8条，片段大小介于 200~2 200 bp
之间，而且分散良好，便于统计分析。这表明试验所
得的 SCoT-PCR最佳反应体系扩增效果好，适用于
不同引物的扩增。
进一步分析发现，绝大多数的引物均能扩增出
条带，且条带丰富，但有些引物所得的条带清晰较
低，无法满足统计分析的需要。通过初步筛选，选出
13条条带清晰、分散性好、多态性丰富的引物，为后
续的研究提供参考。
1.3.2不同材料对反应体系的验证
利用 13份距瓣尾囊草种质资源对所得的最优
反应体系进一步验证。结果表明(图 4)，引物 SP17在
13份供试材料中扩增效果良好，其条带丰富、清晰度
高、分散性好、亮度适中，且条带具有多态性。这说明
所得的 SCoT-PCR反应体系稳定性好、可靠性高、扩
增效果好，能满足距瓣尾囊草种质资源遗传多样性
分析和亲缘关系等研究的需要。
2讨论
DNA分子标记是一种以 PCR为基础的技术。其
扩增效果受到分子标记的类型、材料的种类以及反
应体系各因子的浓度等的影响。吴生等(2011)利用
ISSR标记分析翼梗五味子时发现 Mg2+对反应体系
的影响最大，而唐辉等(2013)优化地枫皮 ISSR-PCR
反应体系的结果表明 Taq DNA聚合酶起主要的作
用，且两个反应体系的各因素的水平均不相同。SCoT
作为一种基于 PCR技术的新型目的基因分子标记。
它应用于不同材料时，各因素对体系影响的程度也
有所差异。徐旭栋等(2012)优化铁皮石斛的 SCoT反
应体系得出 Taq DNA聚合酶在体系中起主要的作
用；而秦国新等(2012)和龙治坚等(2013)研究表明，影
响草莓属植物和芥菜的 SCoT-PCR反应体系程度最
大的因素是Mg2+。然而，本试验结果表明，dNTPs浓
度是影响体系最大的因素，与韩国辉等(2011)、张君
玉等(2011)在多倍体枇杷、葡萄中的研究结果相同。
这表明在利用 SCoT标记研究不同材料时，优化其反
应体系十分必要。
正交设计是对多因素多水平组合的有效筛选，
较单因素设计和完全组合设计减少处理组合，其结
果更为科学和完善(唐辉等, 2013)。dNTPs作为原料，
浓度过低时会影响扩展的效率，导致条带较弱。本研
究发现，随着 dNTPs浓度增大，条带数量和清晰度均
明显提高。而 Taq DNA聚合酶浓度过高时，条带弥
散性增强，不利于条带的统计和分析。此外，Mg2+、引
物以及模板 DNA三个因素对体系影响较小，各个水
平的扩增效果均未达到差异显著。
距瓣尾囊草极其珍贵稀少，属极小种群，自然更
珍稀濒危植物距瓣尾囊草(Urophysa rockii Ulbr) SCoT-PCR分析体系的建立与优化
Establishment and Optimization of SCoT-PCRSystem of an Endangered and Rare Species Urophysa rockii Ulbr
2455
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
新缓慢，居群数量和个体数量均较少。与该植物同属
一个亚族的耧斗菜属和天葵属植物均是重要的药用
植物；而距瓣尾囊草因其花瓣有囊状的距而在系统
演化上处于较为独特的地位(李春雨, 2006)，该作者
根据对耧斗菜亚族内植物的核核糖体 ITS区和叶绿
体 rbcL-atpB区段的分析结果，推测天葵属可能起源
于耧斗菜属和尾囊草属杂交的祖先。这表明距瓣尾
囊草具有重要的研究价值。然而，该植物至今仍未作
为国家级重点保护植物列入红色保护名录，究其原
因，是其重新发现的时间较短，各方面研究甚少(张
云香等 , 2013b)。本试验通过对距瓣尾囊草
SCoT-PCR反应体系各个因素的优化，建立了距瓣尾
表 2供试材料
Table 2 Test material
材料编号
Material No.
1
2
3
4
5
6
7
采集点海拔(m)
Collecting place altitude (m)
880
880
880
880
880
880
910
材料编号
Material No.
8
9
10
11
12
13
采集点海拔(m)
Collecting place altitude (m)
920
920
940
940
960
960
囊草 SCoT-PCR最佳反应体系，并对建立的技术体
系进行了初步应用，同时也筛选出了一些适用于距
瓣尾囊草遗传分析的 SCoT引物，为利用 SCoT标记
研究距瓣尾囊草遗传多样性和亲缘关系，探讨天葵
属、耧斗菜属与尾囊草属之间的进化关系，揭示距瓣
尾囊草濒危的遗传机制提供可能。
3材料与方法
3.1材料
供试材料均采自于同一个自然居群，该居群分
布于四川省江油市永胜镇象家沟水库上方的山崖，
其海拔介于 88~980 m (表 2)，其中 2号材料用于距
瓣尾囊草 SCoT-PCR 体系的优化。dNTPs、Mg2+、
DL2000 marker、Taq DNA聚合酶及 10× Buffer均购
于天根生化科技(北京)有限公司，SCoT引物序列来
自文献(Collard and Mackill, 2009) (表 3)。
3.2基因组 DNA的提取与检测
利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因
组 DNA 试剂盒方法提取距瓣尾囊草的总基因组
DNA。每个样品取 2μL，并加入 2μL的 10× Loading
Buffer，混匀后于 0.8%的琼脂糖凝胶电泳中检测
DNA的质量。同时，利用紫外分光光度计(U-3900H)检
测其浓度，并稀释为 10 ng/μL，置于-20℃保存备用。
3.3 SCoT-PCR扩增程序
距瓣尾囊草 SCoT-PCR 扩增反应在 BIO-RAD
仪器上进行，扩增程序参考相关文献 (韩国辉等 ,
2011)。扩增产物加入 2 μL的 10× Loading Buffer，混
合均匀，取 10 μL于 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝
胶成像系统摄像并保存。
3.4 SCoT-PCR体系的正交设计
Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板 DNA以及
图 4不同 SCoT引物对体系稳定性的验证
注 : M: DL2000 marker; 1~18: 引物 SP1, SP2, SP3, SP4, SP5,
SP6, SP8, SP9, SP10, SP11, SP12, SP13, SP14, SP15, SP16,
SP17, SP18, SP19
Figure 4 Different SCoT primer validate the stability of system
Note: M: DL2000 marker; 1~18: Primer SP1, SP2, SP3, SP4,
SP5, SP6, SP8, SP9, SP10, SP11, SP12, SP13, SP14, SP15, SP16,
SP17, SP18, SP19
图 5引物 SP17在 13份材料中的 SCoT扩增
注: M: DL2000 marker; 1~13:材料 1~13
Figure 5 SCoT amplification of primer SP17 in thirteen materials
Note: M: DL2000 marker; 1~13: Material 1~13
2456
表 4 SCoT-PCR反应体系的 L16(45)正交设计
Table 4 Orthogonal design for SCoT-PCR reaction system
编号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Mg2+(mmol/L)
1.563
1.563
1.563
1.563
1.875
1.875
1.875
1.875
2.188
2.188
2.188
2.188
2.500
2.500
2.500
2.500
dNTPs (mmol/L)
0.038
0.063
0.088
0.113
0.038
0.063
0.088
0.113
0.038
0.063
0.088
0.113
0.038
0.063
0.088
0.113
Taq DNA聚合酶(U)
Taq DNA polymerase (U)
1.0
1.5
2.0
2.5
1.5
1.0
2.5
2.0
2.0
2.5
1.0
1.5
2.5
2.0
1.5
1.0
引物(μmol/L)
Primer (μmol/L)
0.625
0.750
0.875
1.000
0.875
1.000
0.625
0.750
1.000
0.875
0.750
0.625
0.750
0.625
1.000
0.875
模板 DNA (ng)
Template DNA (ng)
10
20
30
40
40
30
20
10
20
10
40
30
30
40
10
20
引物编号
Primer No.
SP1
SP2
SP3
SP4
SP5
SP6
SP7
SP8
SP9
SP10
SP11
SP12
SP13
SP14
SP15
表 3 SCoT引物序列
Table 3 SCoT primers sequence
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
CAACAATGGCTACCACCA
CAACAATGGCTACCACCC
CAACAATGGCTACCACCG
CAACAATGGCTACCACCT
CAACAATGGCTACCACGA
CAACAATGGCTACCACGC
CAACAATGGCTACCACGG
CAACAATGGCTACCACGT
CAACAATGGCTACCAGCA
CAACAATGGCTACCAGCC
AAGCAATGGCTACCACCA
ACGACATGGCGACCAACG
ACGACATGGCGACCATCG
ACGACATGGCGACCACGC
ACGACATGGCGACCGCGA
引物编号
Primer No.
SP16
SP17
SP18
SP19
SP20
SP21
SP22
SP23
SP24
SP25
SP26
SP27
SP28
SP29
SP30
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
ACCATGGCTACCACCGAC
ACCATGGCTACCACCGAG
ACCATGGCTACCACCGCC
ACCATGGCTACCACCGGC
ACCATGGCTACCACCGCG
ACGACATGGCGACCCACA
AACCATGGCTACCACCAC
CACCATGGCTACCACCAG
CACCATGGCTACCACCAT
ACCATGGCTACCACCGGG
ACCATGGCTACCACCGTC
ACCATGGCTACCACCGTG
CCATGGCTACCACCGCCA
CCATGGCTACCACCGGCC
CCATGGCTACCACCGGCG
引物等因素的浓度均会影响 PCR体系。本试验利用
L16(45)正交设计试验(表 4)，以 2号材料的 DNA为模
板，SP23为扩增引物，对影响 PCR反应体系(20 μL)
的上述五个因素进行优化。其中 10× buffer用量是
2.0 μL，不足的用 ddH2O补充，且每个组合重复 3次。
3.5最佳反应体系的验证与引物的初步筛选
利用试验所建立的 SCoT-PCR 最佳反应体系，
以 2号材料的 DNA为模板进行扩增，验证不同引物
在该体系的稳定性和可靠性。同时，利用引物 SP17
对 13份种质资源进行扩增，进一步验证所得的距瓣
尾囊草 SCoT-PCR最佳反应体系，并对供试引物进
行初步筛选。
作者贡献
张波、龙治坚和韩国辉是本研究的实验设计和
珍稀濒危植物距瓣尾囊草(Urophysa rockii Ulbr) SCoT-PCR分析体系的建立与优化
Establishment and Optimization of SCoT-PCRSystem of an Endangered and Rare Species Urophysa rockii Ulbr
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分子植物育种
Molecular Plant Breeding
实验研究的执行人；陆世家和石力完成数据分析，论
文初稿的写作；邹大方、王德怀和徐双燕参与实验设
计，试验结果分析；龙治坚是项目的构思者及负责
人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体
作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31400333)、西南科
技大学实验室开放基金(15xnkf02)、西南科技大学大
学生创新基金(CX16-066)和重庆市科委重大项目
(cstc2013yykfc80002)共同资助。感谢徐刚和范理璋
两位老师的支持和帮助。
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珍稀濒危植物距瓣尾囊草(Urophysa rockii Ulbr) SCoT-PCR分析体系的建立与优化
Establishment and Optimization of SCoT-PCRSystem of an Endangered and Rare Species Urophysa rockii Ulbr
Bt Research (BT)
Bt Research (ISSN 1925-1939) is an open access, peer reviewed journal published
online by BioPublisher. The Journal is publishing high quality original research on all
aspects of Bacillus thuringiensis and their toxins affecting the living organisms, as
well as environmental risk and public policy relevant to Bt modified organisms.
Topics include (but are not limited to) Bt strain identification, novel Bt toxin discovery
and bioassay, transgenic Bt plants, insecticidal mechanism of Bt toxin as well as
resistant mechanisms of target-insect to Bt toxin. Bt Research is particularly keen to
publish the original research and review article from authors in countries where the Bt
modified crops are widely used in commerce in order to provide a forum for
advocator, protestor and middle-of-the-roader. Bt Research is archived in Library and
Archive Canada and deposited in CrossRef. The Journal has been indexed by
ProQuest as well.
Email: edit@bt.biopublisher.ca
Web: http://bt.biopublisher.ca
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