全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员员袁圆缘渊远冤院员员圆怨 耀 员员猿源允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员员鄄园圆鄄员园摇 接受日期院圆园员员鄄园怨鄄员猿
基金项目院国家自然科学基金项目渊晕燥援 猿园源猿园源缘园 和 晕燥援 猿园猿苑园怨员园冤袁浙江省自然科学基金项目渊晕燥援 再猿园缘圆缘员冤
作者简介院王伏林渊员怨苑源鄄冤袁女袁湖北荆州人袁硕士研究生袁在职博士生袁研究方向为植物生物技术遥 耘鄄皂葬蚤造院 澡扎憎凿赠苑源岳 员远猿郾 糟燥皂
通讯作者院石春海渊员怨缘远鄄冤袁男袁浙江新昌人袁博士袁教授袁研究方向为水稻遗传育种遥 耘鄄皂葬蚤造院 糟澡澡泽澡蚤岳 扎躁怎援 藻凿怎援 糟灶
陈锦清渊员怨缘猿鄄冤袁男袁浙江瑞安人袁博士袁研究员袁研究方向为植物代谢基因工程遥 耘鄄皂葬蚤造院 躁援 择援 糟澡藻灶圆愿岳 员远猿郾 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员员冤园远鄄员员圆怨鄄园远
大肠杆菌乙酰辅酶 粤羧化酶 葬糟糟阅亚基表达
载体的构建及遗传转化研究
王伏林员袁 圆 摇 郎春秀圆 摇 刘仁虎圆 摇 吴关庭圆 摇 冯都华圆袁猿 摇 陈锦清圆 摇 石春海员
渊员郾 浙江大学农学系袁浙江 杭州摇 猿员园园圆怨曰圆郾 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所袁浙江 杭州摇 猿员园园圆员曰
猿郾 浙江师范大学化学与生命科学学院袁浙江 金华摇 猿圆员园园源冤
摘摇 要院为探索大肠杆菌异质型乙酰辅酶 粤羧化酶渊粤悦悦葬泽藻冤的 茁鄄悦栽 亚基 葬糟糟阅 基因对油料作物含油量
的影响袁将目的基因 耘援 糟燥造蚤 葬糟糟阅渊藻葬糟糟阅冤与拟南芥 砸怎遭蚤泽糟燥 小亚基渊 则遭糟杂冤转运肽基因融合袁构建以油菜
晕葬责蚤灶启动子驱动的种子特异表达载体遥 本试验应用农杆菌介导法袁将该表达载体转入油菜袁通过 孕悦砸
检测获得了 苑 个阳性转基因株系袁砸栽鄄孕悦砸检测其中 猿 株袁证明 藻葬糟糟阅基因在转基因株系的种子中转录袁
在转基因植株叶片中不转录袁说明该表达载体转入油菜中能引起植株种子 藻葬糟糟阅 基因的特异表达遥 同
时分析还表明转基因株系的含油量与对照植株相比提高约 怨豫 遥
关键词院油菜曰粤悦悦葬泽藻曰藻葬糟糟阅曰超量表达曰含油量
耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 粤悦耘栽再蕴鄄悦燥粤 悦粤砸月韵载再蕴粤杂耘 渊粤悦悦葬泽藻冤 葬糟糟阅 杂哉月哉晕陨栽
郧耘晕耘 耘载孕砸耘杂杂陨韵晕 灾耘悦栽韵砸 悦韵晕杂栽砸哉悦栽陨韵晕 粤晕阅 郧耘晕耘栽陨悦 栽砸粤晕杂云韵砸酝粤栽陨韵晕
宰粤晕郧 云怎鄄造蚤灶员袁 圆 摇 蕴粤晕郧 悦澡怎灶鄄曾蚤怎圆 摇 蕴陨哉 砸藻灶鄄澡怎圆 摇 宰哉 郧怎葬灶鄄贼蚤灶早圆
云耘晕郧 阅怎鄄澡怎葬圆袁 猿 摇 悦匀耘晕 允蚤灶鄄择蚤灶早圆 摇 杂匀陨 悦澡怎灶鄄澡葬蚤员
渊员郾 阅藻责葬则贼皂藻灶贼 燥枣 粤早则燥灶燥皂赠袁 在澡藻躁蚤葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员园园圆怨曰
圆郾 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 灾蚤则燥造燥早赠 葬灶凿 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 在澡藻躁蚤葬灶早 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟藻灶糟藻泽袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员园园圆员曰
猿援 悦燥造造藻早藻 燥枣 悦澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 在澡藻躁蚤葬灶早 晕燥则皂葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 允蚤灶澡怎葬袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿圆员园园源冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽燥 蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻 贼澡藻 蚤灶枣造怎藻灶糟藻 燥枣 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 葬糟糟阅 渊 藻葬糟糟阅冤 早藻灶藻 燥灶 月则葬泽泽蚤糟葬 枣葬贼贼赠 葬糟蚤凿 糟燥灶贼藻灶贼袁 葬灶
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 憎葬泽 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿 遭赠 枣怎泽蚤灶早 贼澡藻 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 则怎遭蚤泽糟燥 泽皂葬造造 泽怎遭怎灶蚤贼 渊则遭糟杂冤 贼则葬灶泽蚤贼 责藻责贼蚤凿藻 葬灶凿 贼澡藻 月则葬泽泽蚤糟葬
泽藻藻凿 泽责藻糟蚤枣蚤糟 责则燥皂燥贼藻则 晕葬责蚤灶 贼燥 藻葬糟糟阅 早藻灶藻援 栽澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 憎葬泽 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 蚤灶贼燥 月则葬泽泽蚤糟葬 灶葬责怎泽 增蚤葬 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂
鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿 泽藻增藻灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 憎藻则藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿援 栽澡藻 藻葬糟糟阅 贼则葬灶泽糟则蚤责贼 憎葬泽 糟燥灶枣蚤则皂藻凿 遭赠 砸栽鄄孕悦砸
葬灶葬造赠泽蚤泽援 栽澡藻 凿葬贼葬 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 藻葬糟糟阅 憎葬泽 贼则葬灶泽糟则蚤责贼藻凿 蚤灶 泽藻藻凿泽 遭怎贼 灶燥贼 蚤灶 造藻葬增藻泽援 栽澡蚤泽 凿藻皂燥灶泽贼则葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
增藻糟贼燥则 糟葬灶 则藻泽怎造贼 蚤灶 贼澡藻 泽责藻糟蚤枣蚤糟 燥增藻则 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 藻葬糟糟阅 蚤灶 蚤皂皂葬贼怎则葬造 泽藻藻凿泽 燥枣 月则葬泽泽蚤糟葬援 杂藻藻凿 燥蚤造 糟燥灶贼藻灶贼泽 憎藻则藻 凿藻贼藻糟贼藻凿
遭赠 杂燥曾澡造藻贼 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶援 栽澡藻 贼燥贼葬造 燥蚤造 糟燥灶贼藻灶贼 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽藻藻凿泽 憎葬泽 葬责责则燥曾蚤皂葬贼藻造赠 怨豫 澡蚤早澡藻则 贼澡葬灶 贼澡葬贼 燥枣 贼澡藻 憎蚤造凿 责造葬灶贼援
栽澡藻则藻枣燥则藻袁 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 藻葬糟糟阅 蚤灶 月则葬泽泽蚤糟葬 糟燥怎造凿 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 蚤灶糟则藻葬泽藻 贼澡藻 枣葬贼贼赠 葬糟蚤凿 糟燥灶贼藻灶贼援
运藻赠 憎燥则凿泽院月则葬泽泽蚤糟葬 灶葬责怎泽曰 粤糟藻贼赠造鄄悦燥粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻曰 藻葬糟糟阅曰 燥增藻则藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰 枣葬贼贼赠 葬糟蚤凿 糟燥灶贼藻灶贼
摇 摇 油菜是世界主要的油料作物之一遥 长期以来袁我 国油菜生产中存在的主要问题之一是菜籽含油量整体
怨圆员员
核摇 农摇 学摇 报 圆缘 卷
不高袁与国外进口菜籽相比有较大差距遥 虽然近几年
油菜育种取得了较大进展袁已有一些含油量较高的新
品种在生产上推广应用袁但提高种子含油量依然是我
国油菜育种的重要目标遥 目前许多科学家通过正向遗
传学手段调控油菜籽脂肪酸合成途径中的关键酶乙酰
辅酶 粤羧化酶 渊粤悦悦葬泽藻冤基因来提高脂肪酸含量遥 在
生物体中 粤悦悦葬泽藻 有两种类型袁 一种是异质型
渊澡藻贼藻则燥皂藻则蚤糟冤袁也称多亚基或原核型 粤悦悦葬泽藻袁存在于
细菌及双子叶植物和非禾本科单子叶植物的质体
中咱员袁 圆暂 遥 异质型 粤悦悦葬泽藻包含 源 个亚基袁即生物素羧化
酶 渊 遭蚤燥贼蚤灶 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻袁 月悦冤尧生物素羧基载体蛋白
渊遭蚤燥贼蚤灶 糟葬则遭燥曾赠造 糟葬则则蚤藻则 责则燥贼藻蚤灶袁月悦悦孕冤以及羧基转移酶
渊糟葬则遭燥曾赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻袁悦栽冤的 圆 个亚基 琢鄄悦栽 和 茁鄄悦栽遥
另一类 粤悦悦葬泽藻称为同质型渊澡燥皂燥皂藻则蚤糟冤袁亦称多功能
或真核型袁存在于动物咱猿暂 尧酵母咱源袁 缘暂 尧藻类咱远暂 及植
物咱苑袁 愿暂的胞质溶胶中袁它的一条多肽链包含着原核型
粤悦悦葬泽藻所有的 源 个亚基渊月悦尧月悦悦孕尧悦栽琢 和 悦栽茁冤袁形
成了 猿 个功能域渊悦栽琢 和 悦栽茁 为一个功能域冤遥 在生
物体中袁质体和胞质溶胶中的 粤悦悦葬泽藻催化乙酰辅酶 粤
产生丙二酰辅酶 粤的反应袁但它们在植物体中的功能
并不完全相同遥 质体 粤悦悦葬泽藻 催化产生的丙二酰辅酶
粤用于脂肪酸的从头生物合成袁而胞质溶胶中 粤悦悦葬泽藻
催化产生的丙二酰辅酶 粤 则用于脂肪酸链的延伸及
类黄酮等次生代谢产物的合成遥
粤悦悦葬泽藻为脂肪酸生物合成限速酶袁在基因工程提
高油料作物油脂含量研究中具有重要地位遥 但迄今为
止在这方面的研究成效并不大袁主要原因是由于异质
型 粤悦悦葬泽藻由 源 个亚基组成袁这些亚基分别由 猿 个核基
因和 员 个叶绿体基因编码遥 通过基因工程使这些基因
在目标生物中同时表达尧定位于质体并组装成一种有
活性的结构具有很大的难度遥 同质型 粤悦悦葬泽藻 属于单
亚基酶袁虽然遗传操纵相对简单袁但可能存在的反馈抑
制作用会限制油脂含量的提高遥 本试验将大肠杆菌异
质型 粤悦悦葬泽藻亚基基因 藻葬糟糟阅 定位于油菜种子细胞质
质体中袁目的是增加脂肪酸的从头生物合成能力袁以研
究该亚基基因在提高油菜籽含油量中的作用遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
员郾 员郾 员摇 供试植物材料尧菌株和载体摇 用于遗传转化的
受体材料为本实验室育成的甘蓝型油菜 渊 月则葬泽泽蚤糟葬
灶葬责怎泽 蕴援 冤 野超油 圆 号冶遥 大肠杆菌 阅匀缘琢尧农杆菌
耘匀粤员园缘 及植物表达载体 责云郧悦鄄缘怨源员 由浙江省农业科
学院病毒学与生物技术研究所保存袁克隆载体 责酝阅员愿鄄
栽购自 栽葬运葬砸葬公司遥
员郾 员郾 圆摇 酶和化学试剂摇 限制性内切酶尧栽源 阅晕粤 连接
酶尧耘曾栽葬择尧凿晕栽孕尧酝葬则噪藻则 等均购自 栽葬运葬砸葬 公司袁逆转
录试剂盒购自 孕则燥皂藻早葬 公司曰琼脂糖凝胶电泳回收试
剂盒购自上海生工生物工程公司遥 其他试剂均为国产
分析纯遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 引物设计摇 用于载体构建的引物根据 耘援 糟燥造蚤
粤悦悦葬泽藻 的 茁鄄悦栽 亚基基因 藻葬糟糟阅 基因 渊登录号
酝远愿怨猿源冤全长序列设计袁以 耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢 的基因组
阅晕粤为模板扩增 藻葬糟糟阅 基因全长袁扩增 藻葬糟糟阅 的条件
为院怨源益 缘皂蚤灶曰怨源益 员皂蚤灶袁缘缘益 员皂蚤灶袁苑圆益 圆皂蚤灶袁猿园 个
循环曰苑圆益 员园皂蚤灶遥 本试验所用的启动子为种子特异
表达启动子 晕葬责蚤灶袁以油菜叶片总 阅晕粤为模板袁扩增条
件为 怨源益 缘皂蚤灶曰怨源益 员皂蚤灶袁缘园益 员皂蚤灶袁苑圆益 圆皂蚤灶袁猿园
个循环曰苑圆益 员园皂蚤灶遥 以已发表的拟南芥 砸遭糟泽 小亚基
渊登录号 粤再园远缘员园员冤序列设计引物 砸遭糟泽贼责鄄云 辕 砸遭糟泽贼责鄄
砸袁拟南芥叶片 砸晕粤 的提取采用 栽则蚤扎燥造 试剂盒的方法
进行袁取 园郾 员早幼嫩的植物叶片袁 液氮迅速研磨后加入
员皂造 栽则蚤扎燥造试剂充分摇匀袁最后溶于 缘园滋造 阅耘孕悦处理水
中遥 取 圆滋早总 砸晕粤袁 以 燥造蚤早燥 渊凿栽冤员愿和 远 碱基随机引
物为引物合成 糟阅晕粤 第一链遥 随后采用两步 孕悦砸 法
扩增 砸遭糟泽 转运肽袁扩增条件院怨源益 缘皂蚤灶曰怨源益 员皂蚤灶袁
苑圆益 员郾 缘皂蚤灶袁猿园 个循环曰苑圆益 员园皂蚤灶渊表 员冤遥
员郾 圆郾 圆摇 植物表达载体的构建 摇 将克隆到的启动子
晕葬责蚤灶尧转运肽 砸遭糟泽 小亚基基因尧藻葬糟糟阅 分别克隆到载
体 责酝阅员愿鄄栽中袁将 责酝阅鄄晕葬责蚤灶 用 酝造怎玉辕 载遭葬玉酶切袁
与相同双酶切的 责酝阅鄄砸遭糟泽 连接袁组成中间载体 责酝阅鄄
晕葬责蚤灶鄄砸遭糟泽袁中间载体用 粤责葬玉辕 载遭葬玉酶切袁与相同酶
切的 责酝阅鄄藻葬糟糟阅 链接袁形成 责酝阅鄄晕葬责蚤灶鄄砸遭糟泽鄄藻葬糟糟阅袁命
名为 责酝阅鄄晕栽阅遥 由于 酝怎灶玉与 耘糟燥砸玉是同尾酶袁所
以将 责酝阅鄄晕栽阅 用 酝怎灶玉辕 载遭葬玉双酶切回收小片段袁
将 责云郧悦鄄缘怨源员 用 耘糟燥砸玉辕 载遭葬玉酶切链接袁构建成
责云郧悦鄄晕葬责蚤灶鄄砸遭糟泽鄄葬糟糟阅袁命名为 责云郧悦鄄晕栽阅遥 将该重组
质粒转化根癌农杆菌 耘匀粤员园缘 菌株袁于鄄苑园益下保存用
于油菜的转化遥 其表达载体的结构图和相关酶切位点
如图 员 所示遥
员郾 圆郾 猿摇 农杆菌介导的遗传转化摇 用牙签挑取农杆菌
新鲜菌落在含 运皂 缘园皂早 辕 蕴 及 砸蚤枣 缘园皂早 辕 蕴的 再耘月 液
体培养基中 圆愿益振荡培养袁至对数分裂中期渊韵阅远园园 越园郾 猿冤遥 取菌液于 员圆 园园园则 辕 皂蚤灶 离心 员皂蚤灶袁用 酝杂 培养
基离心洗涤一次后稀释 员园 倍遥 将培养好的油菜下胚
轴剪成约 员糟皂浸入上述菌液 员皂蚤灶袁灭菌滤纸吸干后平
园猿员员
摇 远 期 大肠杆菌乙酰辅酶 粤羧化酶 葬糟糟阅亚基表达载体的构建及遗传转化研究
铺于 酝杂 培养基上暗培养 圆凿袁待下胚轴切口处被农杆
菌感染后取出袁在 酝杂 液体培养基中洗净后培养在含
羧苄青霉素渊悦遭冤缘园园皂早 辕 蕴的 酝杂 培养基上遥 员 周后转
入含 悦遭 缘园园皂早 辕 蕴 及 月葬泽贼葬 缘皂早 辕 蕴 的 酝杂 分化培养基
上袁每 圆 周重复 员 次袁直到抗性愈伤出现并且芽分化袁
计算转化频率遥 待芽长至 圆 耀 猿糟皂 高时袁转入含相同
抗生素的生根培养基诱导生根袁圆 周后出根长成完整
小植株袁即可移入土中进行常规管理遥
表 员摇 扩增各片段所用引物序列
栽葬遭造藻 员摇 孕则蚤皂藻则 泽藻择怎藻灶糟藻
引物名称
责则蚤皂藻则 灶葬皂藻
引物序列渊缘忆鄄猿忆冤
责则蚤皂藻则 泽藻择怎藻灶糟藻 渊缘忆鄄猿忆冤
酶切位点
藻灶扎赠皂藻
泽蚤贼藻
郧藻灶月葬灶噪登录号
郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶
灶怎皂遭藻则
砸遭糟泽贼责鄄云 粤悦郧悦郧栽粤悦粤悦粤粤粤郧粤郧栽粤粤粤郧粤粤郧 酝造怎玉 粤再园远缘员园员
砸遭糟泽贼责鄄砸 郧郧郧悦悦悦郧郧粤粤栽悦郧郧栽粤粤郧郧栽悦粤郧郧 粤责葬玉
耘葬糟糟阅鄄云 郧郧郧悦悦悦粤栽郧粤郧悦栽郧郧粤栽栽郧粤粤悦郧粤粤栽栽 粤责葬玉 酝远愿怨猿源
耘葬糟糟阅鄄砸 悦栽悦郧粤郧栽悦粤郧郧悦悦栽悦粤郧郧栽栽悦悦栽郧粤栽悦悦郧郧 载澡燥玉
晕葬责蚤灶鄄云 悦粤粤栽栽郧粤粤郧悦栽栽栽悦栽栽悦粤栽悦郧郧栽郧粤栽栽 酝怎灶玉 允园圆苑怨愿
晕葬责蚤灶鄄砸 粤悦郧悦郧栽郧郧粤栽悦悦栽郧栽粤栽郧栽栽栽栽栽粤粤栽悦 酝造怎玉
图 员摇 重组质粒 责云郧悦鄄晕栽阅结构图
云蚤早援 员摇 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 增藻糟贼燥则 燥枣 责云郧悦鄄晕栽阅
员郾 圆郾 源摇 转基因油菜的 孕悦砸 和 砸栽鄄孕悦砸 检测 摇 利用
藻葬糟糟阅鄄云左端引物和载体上终止子 韵悦杂鄄砸右端引物对
待测转基因油菜植株进行 孕悦砸扩增验证袁扩增引物为
藻葬糟糟阅鄄云院 郧郧郧悦悦悦粤栽郧粤郧悦栽郧郧粤栽栽郧粤粤 悦郧粤粤栽栽袁
韵悦杂鄄砸院郧栽郧郧悦郧悦栽悦栽粤栽悦粤栽粤郧粤栽郧遥 对 孕悦砸 检测阳
性株系使用 栽则蚤扎燥造 砸藻葬早藻灶贼渊陨灶增蚤贼则燥早藻灶冤分别提取油菜叶
片和 员愿凿幼嫩荚果 砸晕粤袁为进一步明确目标基因在转
基因植株中的表达袁对转基因株系进行验证袁目标基因
藻葬糟糟阅 扩 增 引 物 为 藻葬糟糟阅鄄云院
粤栽郧粤郧悦栽郧郧粤栽栽郧粤粤悦郧粤粤栽栽袁 藻葬糟糟阅鄄砸院 栽悦粤郧郧悦悦
栽悦粤郧郧栽栽悦悦栽郧粤栽悦悦郧郧遥 内标基因为油菜 粤糟贼蚤灶袁粤糟贼蚤灶
引物为 粤糟贼蚤灶鄄云院 粤栽郧郧悦悦郧粤栽郧郧栽郧粤郧郧粤悦粤栽袁 粤糟贼蚤灶鄄
砸院栽栽粤郧粤粤郧悦粤栽栽栽悦悦栽郧栽郧郧粤遥 为验证外源基因对
油菜内源 葬糟糟阅基因是否产生影响袁故对油菜内源 葬糟糟阅
基因进行 砸栽鄄孕悦砸 验证遥 油菜内源 葬糟糟阅 基因引物为
月灶葬糟糟阅鄄云院 粤栽郧粤郧悦栽郧郧粤栽栽郧粤粤悦郧粤粤栽栽袁 月灶葬糟糟阅鄄砸院
栽悦粤郧郧悦悦栽悦粤郧郧栽栽悦悦栽郧粤栽悦悦郧郧遥
员郾 圆郾 缘摇 转基因油菜含油量测定摇 采用索氏抽提法测
定转基因油菜种子含油量袁约 圆早 种子在 愿园益烘烤后
磨样袁装入预先烘好的滤纸包中袁员园缘益烘烤 猿澡称量纸
包重渊酝员冤袁准确称取约 圆早种子袁放入 愿园益烘箱 猿园皂蚤灶
后拿出研磨尧包好袁并置于 员园缘益烘烤 猿澡袁称重渊酝圆冤袁
然后置于石油醚中浸泡过夜袁后置于索氏提取器中
缘园益回流约 员凿遥 油脂完全浸出后袁干燥残渣尧员园缘益烘
烤 猿澡并称重渊酝猿冤遥 按下式计算种子油脂含量院种子
含油量 越 渊酝圆鄄酝猿冤 辕 渊酝圆鄄酝员冤 伊 员园园豫 遥 每个样品测
定 猿 次袁求其平均值遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 启动子尧拟南芥 砸遭糟泽转运肽尧大肠杆菌 藻葬糟糟阅的
克隆
根据所设计的引物 耘葬糟糟阅鄄云 辕 耘葬糟糟阅鄄砸 扩增 耘援
糟燥造蚤基因组 阅晕粤袁获得 耘援 糟燥造蚤 粤悦悦葬泽藻 基因 藻葬糟糟阅长度
为 怨员缘遭责袁用 晕葬责蚤灶鄄云 辕 晕葬责蚤灶鄄砸引物从油菜叶片基因组
中扩增得到种子特异表达启动子 晕葬责蚤灶袁长度为
员员源苑遭责曰提取拟南芥幼嫩叶片的 砸晕粤袁逆转录后以
糟阅晕粤为模板袁利用 砸遭糟泽贼责鄄云 辕 砸遭糟泽贼责鄄砸 引物进行 砸栽鄄
孕悦砸扩增袁获得 砸遭糟泽 长度为 圆猿源遭责遥 分析测序结果表
明扩增片段与 郧藻灶月葬灶噪中对应序列同源率 员园园豫 遥 获
得质粒载体 责酝阅鄄藻葬糟糟阅尧责酝阅鄄晕葬责蚤灶和 责酝阅鄄砸遭糟泽贼责遥
圆郾 圆摇 植物表达载体 责云郧悦鄄葬糟糟阅的构建
酝造怎玉辕 载遭葬玉分别对载体 责酝阅鄄晕葬责蚤灶 及 责酝阅鄄
砸遭糟泽贼责进行双酶切袁回收 猿愿源缘遭责 的大片段与长度为
圆源远遭责的 砸遭糟泽 片段连接袁获得中间载体 责酝阅鄄晕葬责蚤灶鄄
则遭糟泽贼责遥 再将中间载体用 粤责葬玉辕 载遭葬玉双酶切袁回收大
员猿员员
核摇 农摇 学摇 报 圆缘 卷
片段 源园愿缘遭责袁与相同双酶切的 责酝阅鄄藻葬糟糟阅 回收的
藻葬糟糟阅片段渊长度为 怨圆苑遭责冤连接袁得到载体 责酝阅鄄晕栽阅曰
由于目标基因 藻葬糟糟阅 中有 耘糟燥砸玉酶切位点袁因 酝怎灶玉
和 耘糟燥砸玉是同尾酶袁所以将 晕葬责蚤灶 前带上 酝怎灶玉酶切
位点袁将 责酝阅鄄晕栽阅 用 酝怎灶玉辕 载遭葬玉酶切袁与 耘糟燥砸玉辕
载遭葬玉双酶切的 责云郧悦鄄缘怨源员 相连接袁获得 责云郧悦鄄晕栽阅遥
由于 晕葬责蚤灶片段在 源远苑遭责的位置有 载澡燥玉酶切位点袁而
在转运肽 砸遭糟泽贼责和 葬糟糟阅中没有该酶切位点袁所以本试
验选用 载澡燥玉辕 载遭葬玉双酶切对 责酝阅鄄晕栽阅 和 责云郧悦鄄
晕栽阅 两种质粒分别进行酶切鉴定验证袁可以出现
员愿源员遭责大小的片段袁与预期结果相符遥
图 圆摇 根癌农杆菌介导的油菜遗传转化
云蚤早援 圆摇 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶 皂藻凿蚤葬贼藻凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 燥蚤造泽藻藻凿 则葬责藻
粤院预培养曰月院共培养曰悦院再生曰阅院生根
粤院责则藻鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶曰 月院 糟燥鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶曰悦院 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶曰 阅院 则燥燥贼蚤灶早
圆郾 猿摇 根癌农杆菌介导的油菜转化及抗除草剂再生苗
的获得
按照 员郾 缘 方法袁油菜种子萌发 缘 耀 远凿后袁剪取离生
长点约 员糟皂的无菌苗下胚轴作为转化逐级体进行预
培养袁本试验中袁共接种外植体约 缘园园 个袁出芽数约为
员园园 个袁出芽率为 圆园豫 遥 当绿色抗性芽长至 圆糟皂 左右
时袁将其切下转入生根培养基中进行一根袁共接种再生
芽 远园 个袁生根频率为 员园园豫 遥 待转化苗根系发育完备
后袁打开组培瓶盖炼苗 圆凿袁然后移栽于温室中进行常
规管理渊图 圆冤遥
圆郾 源摇 转基因油菜检测
对经过 月葬泽贼葬 筛选获得的抗性植株利用 藻葬糟糟阅鄄云
左端引物和 韵悦杂鄄砸右端引物进行 孕悦砸检测袁共检测出
苑 株 栽园 油菜具有特异扩增带渊图 猿冤遥 初步表明目的基
因 葬糟糟阅已转入到油菜基因组中遥 为检测 孕悦砸 阳性株
目的基因转录水平的表达情况袁分别以野超油 圆 号冶和
转基因株系的叶片和 员愿凿未成熟种子进行 砸栽鄄孕悦砸 分
析遥 当以对照和转基因株系的幼嫩种子 糟阅晕粤为模板
时袁利用大肠杆菌 藻葬糟糟阅基因引物 耘葬糟糟阅鄄云 辕 耘葬糟糟阅鄄砸袁
对照未扩增出带袁而 猿 个转基因株系都出现了目标带袁
利用油菜内源的 月灶葬糟糟阅基因片段引物袁对照和转基因
株系都出现了内源目标带渊图 源冤曰而以对照和转基因
株系的叶片 糟阅晕粤 为模板时袁利用大肠杆菌 藻葬糟糟阅 基
因引物袁在 猿 个转基因株系和对照的叶片中都未扩增
出目标带袁说明转基因 藻葬糟糟阅 基因在油菜叶片中不转
录袁而在转基因株系种子中转录表达袁而内源油菜
月灶葬糟糟阅既可在油菜种子中表达袁又能在叶片中表达
渊图 源冤遥 该结果表明本试验所构建的载体转入油菜中
可实现 藻葬糟糟阅基因在籽粒中的特异表达遥
圆郾 缘摇 转基因油菜的含油量测定
利用索氏提取法测定转基因植株和对照植株的
圆猿员员
摇 远 期 大肠杆菌乙酰辅酶 粤羧化酶 葬糟糟阅亚基表达载体的构建及遗传转化研究
图 猿摇 转基因株系的 孕悦砸检测
云蚤早援 猿摇 孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 造蚤灶藻泽
酝院 员噪遭 酝葬则噪藻则曰员院对照株系曰圆 耀 苑院转基因株系
酝院 员噪遭 酝葬则噪藻则曰 员院 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 造蚤灶藻 曰 圆 耀 苑院 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 造蚤灶藻泽
图 源摇 转基因植株的 砸栽鄄孕悦砸检测
云蚤早援 源摇 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶
遭葬泽藻凿 燥灶 砸栽鄄孕悦砸
酝院员噪遭 皂葬则噪藻则曰员院 野超油 圆 号冶对照材料幼嫩种子曰
圆 耀 源院转基因株系幼嫩种子曰缘院野超油 圆 号冶
对照材料叶片曰远 耀 愿院转基因株系叶片
酝院员噪遭 酝葬则噪藻则曰 员院 野糟澡葬燥赠燥怎 圆冶 糟燥灶贼则燥造 蚤皂皂葬贼怎则藻 泽藻藻凿泽曰
圆 耀 源院 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 造蚤灶藻泽爷 蚤皂皂葬贼怎则藻 泽藻藻凿泽曰 缘院 野糟澡葬燥赠燥怎 圆冶
糟燥灶贼则燥造 造藻葬增藻泽曰 远 耀 愿院贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 造蚤灶藻泽袁 造藻葬增藻泽
栽员 代种子含油量袁结果表明袁猿 个转基因株系种子含油
量都显著渊孕 约 园郾 园缘冤高于对照植株袁说明通过超量表
达 耘援 糟燥造蚤 藻葬糟糟阅基因能够提高转基因植株种子的含油
量袁猿 个转基因株系的平均含油量渊以干基计冤比对照
高约 怨豫 渊图 缘冤遥
图 缘摇 转基因 栽员 代植株种子含油量测定结果
云蚤早援 缘摇 杂藻藻凿 燥蚤造 糟燥灶贼藻灶贼 燥枣 栽员 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 燥蚤造泽藻藻凿 则葬责藻
悦运院 野超油 圆 号 冶 曰阅源尧阅远尧阅苑院转基因植株
悦运院 野糟澡葬燥赠燥怎 圆冶 糟燥灶贼则燥造 曰 阅源袁 阅远袁 阅苑院 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽
猿摇 讨论
本试验在构建 藻葬糟糟阅 表达载体过程中袁利用油菜
种子特异表达启动子 晕葬责蚤灶袁并且利用拟南芥 砸怎遭蚤泽糟燥
小亚基 砸遭糟泽转运肽片段与目标基因 藻葬糟糟阅 融合袁以期
将目标基因蛋白进一步定位到油菜籽粒的质体中袁从
而提高油菜含油量遥 通过 砸栽鄄孕悦砸袁证明目标基因
藻葬糟糟阅在转基因株系未成熟种子中表达袁而在转基因植
株和对照植株的叶片中都不表达袁说明 晕葬责蚤灶 启动子
是种子特异表达启动子遥 晕葬责蚤灶 是芸薹属植物种子主
要贮藏蛋白之一袁其编码基因有在种子中特异表达的
特性遥 熊新华等咱怨暂应用 晕葬责蚤灶 启动子反向调控 云葬凿圆
基因袁获得了高油酸含量转基因油菜遥 砸燥藻泽造藻则 等咱员园暂
利用 晕葬责蚤灶启动子构建拟南芥同质型 粤悦悦葬泽藻 基因的
超量表达载体转化油菜袁油菜含油量增加了约 缘豫 遥
本试验根据 蕴蚤 等咱员员暂 尧在澡燥灶早等咱员圆暂方法袁采用 砸遭糟泽小亚
基的转运肽外加该成熟蛋白的前 圆源 个氨基酸作为转
运肽与目标基因融合袁将目标基因蛋白转运到转基因
植株种子质体中袁起到了很好的效果袁证明所用转运肽
对 藻葬糟糟阅功能的发挥有促进作用遥
利用基因工程手段提高种子含油量已成为国际上
植物基因工程研究的热点遥 由于 粤悦悦葬泽藻 是脂肪酸生
物合成的限速酶袁人们期望通过超量表达 粤悦悦葬泽藻 基
因袁提高其活性来调节种子含油量袁并将这一设想在油
菜尧大豆尧芝麻尧向日葵等油料作物上运用遥 砸燥藻泽造藻则
等咱员园暂将油菜种子贮藏蛋白 晕葬责蚤灶 特异表达启动子与
拟南芥同质型 粤悦悦葬泽藻 基因 粤悦悦员 融合袁在大豆
砸怎遭蚤泽糟燥 杂杂哉转移肽的转运下袁成功实现了胞质溶胶
粤悦悦葬泽藻在油菜叶绿体上的亚细胞定位袁获得的转基因
猿猿员员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员员袁圆缘渊远冤院员员圆怨 耀 员员猿源
油菜 栽员 代成熟种子中 粤悦悦葬泽藻 活性比对照提高 员园 耀圆园 倍袁含油量增加 缘豫并改变了脂肪酸组成遥 阅葬增蚤泽
等咱员猿暂将噬菌体 栽苑 强启动子与异质型大肠杆菌粤悦悦葬泽藻 源 亚基编码基因连接渊葬糟糟月尧葬糟糟悦尧葬糟糟阅 和 葬糟糟粤
依次排列冤袁构建成一个细菌多顺反子袁用其转化大肠
杆菌后袁脂肪酸含量增加了 远 倍遥 运造葬怎泽 等咱员源暂通过超
量表达拟南芥同质型 粤悦悦员袁转化马铃薯后含油量比对
照增加了 缘 倍遥 由于 粤悦悦葬泽藻是四亚基复合酶袁且分别
由细胞核和叶绿体基因编码袁结构与 员袁缘鄄二磷酸核酮
糖羧化酶 辕加氧酶渊砸怎遭蚤泽糟燥冤类似袁采用基因工程方法
使这些基因在目标生物中同时表达并组装成一种有活
性的结构存在很大的难度遥 科学家们在研究 粤悦悦葬泽藻
的各亚基中发现叶绿体编码的 葬糟糟阅 亚基基因是该复
合酶的限制因子遥 酝葬凿燥噪葬 等咱员缘暂在烟草质体中超量表
达 葬糟糟阅 基因提高了质体中 粤悦悦葬泽藻水平及转基因植株
叶子中脂肪酸的含量袁该结果表明 葬糟糟阅 基因编码的
茁鄄悦栽亚基是 粤悦悦葬泽藻 基因的限制因子袁且 葬糟糟阅亚基对
作物的含油量起着重要调节作用遥 运燥凿藻 等咱员远暂利用同
源重组的方法剔除烟草 葬糟糟阅袁发现剔除 葬糟糟阅 基因的植
株叶片出现白绿色斑点或叶片减少袁证明质体 葬糟糟阅基
因也对植物叶片生长起重要作用遥 月则赠葬灶贼 等咱员苑暂研究
发现拟南芥叶绿体 葬糟糟阅缺失或突变导致胚致死袁而油
菜或玉米中由于核内重复基因的补偿作用袁叶绿体
葬糟糟阅缺失并不会导致胚致死遥 本实验室构建了 耘援
糟燥造蚤的 粤悦悦葬泽藻的各亚基基因的超量表达载体分别进
行油菜转化袁发现 藻葬糟糟阅 基因对转基因油菜含油量的
贡献最大遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 运燥灶凿燥 匀袁 杂澡蚤则葬贼泽怎糟澡蚤 运袁 再燥泽澡蚤皂燥贼燥 栽袁 酝葬泽怎凿葬 栽袁 运蚤贼葬扎燥灶燥 粤袁
栽泽怎则怎 阅袁 粤灶葬蚤 酝袁 杂藻噪蚤早怎糟澡蚤 酝袁 栽葬灶葬遭藻 栽援 粤糟藻贼赠造鄄悦燥粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻
枣则燥皂 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤院 早藻灶藻 燥则早葬灶蚤扎葬贼蚤燥灶 葬灶凿 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣
贼澡藻 遭蚤燥贼蚤灶 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 泽怎遭怎灶蚤贼 咱允暂 援 孕则燥糟 晕葬贼造 粤糟葬凿 杂糟蚤 哉杂粤袁 员怨怨员袁
愿愿院 怨苑猿园 原 怨苑猿猿
咱 圆 暂 摇 蕴蚤 杂 允袁 悦则燥灶葬灶 允 耘援 栽澡藻 早藻灶藻 藻灶糟燥凿蚤灶早 贼澡藻 遭蚤燥贼蚤灶 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻
泽怎遭怎灶蚤贼 燥枣 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 葬糟藻贼赠造鄄悦燥粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 咱 允 暂 援 允 月蚤燥造
悦澡藻皂袁 员怨怨圆袁 圆远苑院 愿缘缘 原 愿远猿
咱 猿 暂 摇 栽葬噪葬蚤 栽袁 再燥噪燥赠葬皂葬 悦袁 宰葬凿葬 运袁 栽葬灶葬遭藻 栽援 孕则蚤皂葬则赠 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣
糟澡蚤糟噪藻灶 造蚤增藻则 葬糟藻贼赠造鄄悦燥粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 凿藻凿怎糟藻凿 枣则燥皂 糟阅晕粤 泽藻择怎藻灶糟藻
咱允暂 援 允 月蚤燥造 悦澡藻皂袁 员怨怨愿袁 圆远猿院 圆远缘员 原 圆远缘苑
咱 源 暂 摇 宰葬造蚤凿 粤 云袁 悦澡蚤则葬造葬 杂 杂袁 宰葬噪蚤造 杂 允援 悦造燥灶蚤灶早 燥枣 贼澡藻 赠藻葬泽贼 云粤杂猿 早藻灶藻
葬灶凿 责则蚤皂葬则赠 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 赠藻葬泽贼 葬糟藻贼赠造鄄悦燥粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 咱允暂 援 孕则燥糟 晕葬贼造
粤糟葬凿 杂糟蚤 哉杂粤袁 员怨怨圆袁 愿怨院 源缘猿源 原 源缘猿愿
咱 缘 暂 摇 匀葬泽泽造葬糟澡藻则 酝袁 陨增藻泽泽葬 粤 杂袁 孕葬造贼葬怎枣 云袁 运燥澡造憎藻蚤灶 杂 阅援 粤糟藻贼赠造鄄悦燥粤
糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 枣则燥皂 赠藻葬泽贼 蚤泽 葬灶 藻泽泽藻灶贼蚤葬造 藻灶扎赠皂藻 葬灶凿 蚤泽 则藻早怎造葬贼藻凿 遭赠
枣葬糟贼燥则泽 贼澡葬贼 糟燥灶贼则燥造 责澡燥泽责澡燥造蚤责蚤凿 皂藻贼葬遭燥造蚤泽皂 咱 允暂 援 允 月蚤燥造 悦澡藻皂袁
员怨怨猿袁 圆远愿院 员园怨源远 原 员园怨缘圆
咱 远 暂摇 砸燥藻泽泽造藻则 孕袁 韵澡造则燥早早藻 允 月援 悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 早藻灶藻
贼澡葬贼 藻灶糟燥凿藻泽 葬糟藻贼赠造鄄糟燥藻灶扎赠皂藻 粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 蚤灶 贼澡藻 粤造早葬 糟赠糟造燥贼藻造造葬
糟则赠责贼蚤糟葬 咱允暂 援 允 月蚤燥造 悦澡藻皂袁 员怨怨猿袁 圆远愿院 员怨圆缘源 原 员怨圆缘怨
咱 苑 暂摇 杂澡燥则则燥泽澡 月 杂袁 阅蚤曾燥灶 砸 粤袁 韵澡造则燥早早藻 允 月援 酝燥造藻糟怎造葬则 糟造燥灶蚤灶早袁
糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶袁 葬灶凿 藻造蚤糟蚤贼葬贼蚤燥灶 燥枣 葬糟藻贼赠造鄄悦燥粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 枣则燥皂
葬造枣葬造枣葬 咱允暂 援 孕则燥糟 晕葬贼造 粤糟葬凿 杂糟蚤 哉杂粤袁 员怨怨源袁 怨员院 源猿圆猿 原 源猿圆苑
咱 愿 暂摇 再葬灶葬蚤 再袁 运葬憎葬泽葬噪蚤 栽袁 杂澡蚤皂葬凿葬 匀袁 宰怎则贼藻造藻 耘 杂袁 晕蚤噪燥造葬怎 月 允袁
陨糟澡蚤噪葬憎葬 晕援 郧藻灶燥皂蚤糟 燥则早葬灶蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 圆缘员 噪阅葬 葬糟藻贼赠造鄄悦燥粤
糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 早藻灶藻泽 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽院 贼葬灶凿藻皂 早藻灶藻 凿怎责造蚤糟葬贼蚤燥灶 澡葬泽 皂葬凿藻
贼憎燥 凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造造赠 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤泽燥扎赠皂藻泽 咱允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造 孕澡赠泽蚤燥造袁 员怨怨缘袁
猿远院 苑苑怨 原 苑愿苑
咱 怨 暂摇 熊兴华袁官春云袁王学军袁周小云袁李家洋援甘蓝型油菜 云葬凿圆 基因
片段的克隆和反义表达载体的构建咱 允暂 援 中国油料作物学报袁
圆园园圆袁圆源渊圆冤院员鄄源
咱员园暂摇 砸燥藻泽造藻则 运袁 杂澡蚤灶贼葬灶蚤 阅袁 杂葬增葬早藻 蕴袁 月燥凿凿怎责葬造造蚤 杂袁 韵澡造则燥早早藻 允援
栽葬则早藻贼蚤灶早 燥枣 贼澡藻 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 澡燥皂燥皂藻则蚤糟 葬糟藻贼赠造鄄糟燥藻灶扎赠皂藻 粤
糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 贼燥 责造葬泽贼蚤凿泽 燥枣 则葬责藻泽藻藻凿泽 咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造袁 员怨怨苑袁 员员猿院
苑缘 原 愿员
咱员员暂摇 蕴藻藻 运 匀袁 运蚤皂 阅 匀袁 蕴藻藻 杂 宰袁 运蚤皂 在 匀袁 匀憎葬灶早 陨援 陨灶 增蚤增燥 蚤皂责燥则贼
藻曾责藻则蚤皂藻灶贼泽 蚤灶 责则燥贼燥责造葬泽贼泽 则藻增藻葬造 贼澡藻 蚤皂责燥则贼葬灶糟藻 燥枣 贼澡藻 燥增藻则葬造造 糟燥灶贼藻曾贼
遭怎贼 灶燥贼 泽责藻糟蚤枣蚤糟 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 则藻泽蚤凿怎藻泽 燥枣 贼澡藻 贼则葬灶泽蚤贼 责藻责贼蚤凿藻 凿怎则蚤灶早
蚤皂责燥则贼 蚤灶贼燥 糟澡造燥则燥责造葬泽贼泽 咱允暂 援 酝燥造藻糟怎造藻泽 葬灶凿 悦藻造造泽袁 圆园园圆袁 员源 渊猿冤院
猿愿愿 原 猿怨苑
咱员圆暂摇 在澡燥灶早 匀袁 栽藻赠皂燥怎则蚤 云袁 悦澡葬责皂葬灶 月袁 酝葬择遭燥燥造 杂匀袁 杂葬遭扎蚤噪葬则 砸袁 耘造鄄
酝葬早澡则葬遭赠 再袁 阅葬造藻 月袁 杂贼蚤糟噪造藻灶 酝 月援 栽澡藻 责藻葬 渊孕蚤泽怎皂 泽葬贼蚤增怎皂 蕴援 冤
则遭糟杂 贼则葬灶泽蚤贼 责藻责贼蚤凿藻 凿蚤则藻糟贼泽 贼澡藻 粤造糟葬造蚤早藻灶藻泽 藻怎贼则燥责澡怎泽
责燥造赠澡赠凿则燥曾赠遭怎贼赠则葬贼藻 藻灶扎赠皂藻泽 蚤灶贼燥 贼澡藻 皂葬蚤扎藻 渊 在藻葬 皂葬赠泽 蕴援 冤
糟澡造燥则燥责造葬泽贼泽 咱允暂 援 孕造葬灶贼 杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园园猿袁 员远缘院 源缘缘 原 源远圆
咱员猿暂摇 阅葬增蚤泽 酝 杂袁 杂燥造遭蚤葬贼蚤 允袁 悦则燥灶葬灶 允 耘援 韵增藻则责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 粤糟藻贼赠造鄄悦燥粤
糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 蚤灶糟则藻葬泽藻泽 贼澡藻 则葬贼藻 燥枣 枣葬贼贼赠 葬糟蚤凿 遭蚤燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 蚤灶
耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 咱 允暂 援 栽澡藻 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园园袁
圆苑缘袁 猿苑院 圆愿缘怨猿 原 圆愿缘怨愿
咱员源暂摇 运造葬怎泽 阅袁 韵澡造则燥早早藻 允 月袁 晕藻怎澡葬怎泽 匀 耘袁 阅燥则皂葬灶灶 孕援 陨灶糟则藻葬泽藻凿 枣葬贼贼赠
葬糟蚤凿 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 蚤灶 责燥贼葬贼燥 遭赠 藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 燥枣 葬糟藻贼赠造鄄悦燥粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻
咱允暂 援 孕造葬灶贼葬袁 圆园园源袁 圆员怨院 猿愿怨 原 猿怨远
咱员缘暂摇 酝葬凿燥噪葬 再袁 栽燥皂蚤扎葬憎葬 运袁 酝蚤扎燥蚤 允袁 晕蚤泽澡蚤凿葬 陨袁 晕葬早葬灶燥 再袁 杂葬泽葬噪蚤 再援
悦澡造燥则燥责造葬泽贼 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 皂燥凿蚤枣蚤藻凿 葬糟糟阅 燥责藻则燥灶 蚤灶糟则藻葬泽藻泽
葬糟藻贼赠造鄄悦燥粤 糟葬则遭燥曾赠造葬泽藻 葬灶凿 糟葬怎泽藻泽 藻曾贼藻灶泽蚤燥灶 燥枣 造藻葬枣 造燥灶早藻增蚤贼赠 葬灶凿
蚤灶糟则藻葬泽藻 蚤灶 泽藻藻凿 赠蚤藻造凿 蚤灶 贼燥遭葬糟糟燥 咱允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造 孕澡赠泽蚤燥造袁 圆园园圆袁 源猿
渊员圆冤院 员缘员愿 原 员缘圆缘
咱员远暂摇 运燥凿藻 灾袁 酝怎凿凿 耘 粤袁 陨葬皂贼澡葬皂 杂袁 阅葬赠 粤援 栽澡藻 贼燥遭葬糟糟燥 责造葬泽贼蚤凿 葬糟糟阅
早藻灶藻 蚤泽 藻泽泽藻灶贼蚤葬造 葬灶凿 蚤泽 则藻择怎蚤则藻凿 枣燥则 造藻葬枣 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 咱允暂 援 栽澡藻 孕造葬灶贼
允燥怎则灶葬造袁 圆园园缘袁 源源院圆猿苑 原 圆源源
咱员苑暂摇 月则赠葬灶贼 晕袁 蕴造燥赠凿 允袁 杂憎藻藻灶藻赠 悦袁 酝赠燥怎早葬 云袁 酝藻蚤灶噪藻 阅援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶
燥枣 灶怎糟造藻葬则 早藻灶藻泽 藻灶糟燥凿蚤灶早 糟澡造燥则燥责造葬泽贼鄄造燥糟葬造蚤扎藻凿 责则燥贼藻蚤灶泽 则藻择怎蚤则藻凿 枣燥则
藻皂遭则赠燥 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造袁 圆园员员袁 员缘缘院
员远苑愿 原 员远愿怨
渊责任编辑摇 王媛媛冤
源猿员员