本研究通过离体诱导的方式进行茅苍术同源四倍体新种质的创制,采用正交设计法优化茅苍术无菌快繁体系,以茎尖为外植体进行四倍体的离体诱导,采用形态鉴别、根尖染色体鉴定和流式细胞仪分析相结合的方法进行同源四倍体的鉴定。结果表明:茅苍术最适增殖培养基为MS+6-BA 2.0mg·L-1+ NAA 0.20mg·L-1;用0.20%的秋水仙素处理12h 为诱导茅苍术同源四倍体的理想条件,四倍体诱导率高达36%。本试验共诱导鉴定获得了23个茅苍术同源四倍体株系,为进一步开展优质高产茅苍术同源四倍体新品种的选育奠定了基础。
全 文 ：核 农 学 报!"##,# (#,
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收稿日期!"#)*#%*"!接受日期!"#)*#*"
基金项目!中央高校基本科研业务费基金项目"be"#"##
作者简介!王红娟!女!主要从事药用植物生物技术育种研究% 0*1234"#"#)"#;852=>XP=>:8
通讯作者!向增旭!副教授!主要从事药用植生物技术育种研究% 0*1234d^ 3^289;852=>XP=>:8 文章编号!###*A%%""#%##*#,#*#+ 茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定 王红娟!杨!岚!李雅婷!向增旭 "南京农业大学H中药材研究所!江苏 南京!"##&%#
摘!要!本研究通过离体诱导的方式进行茅苍术同源四倍体新种质的创制!采用正交设计法优化茅苍术
无菌快繁体系!以茎尖为外植体进行四倍体的离体诱导!采用形态鉴别"根尖染色体鉴定和流式细胞仪
分析相结合的方法进行同源四倍体的鉴定# 结果表明%茅苍术最适增殖培养基为 ZI h B-."G#19&
`B hM..#G"#19&` B用 #G"#Q的秋水仙素处理 "6 为诱导茅苍术同源四倍体的理想条件!四倍体
诱导率高达 ,Q# 本试验共诱导鉴定获得了 ", 个茅苍术同源四倍体株系!为进一步开展优质高产茅
苍术同源四倍体新品种的选育奠定了基础#
关键词!茅苍术快繁体系秋水仙素同源四倍体 /EF#GA&H5>3@@8>##*A%%G"#%G#>#,# ! ! 中药茅苍术又称南苍术)茅术!来源于菊科 "K71S7@3T2X#苍术属".T?2:T<47PX@#多年生草本植物茅 苍术,/&*/9"3+1&%*+& "U6=8]>#/K>(的干燥根茎!
与北苍术,/&*/9"3+1*5.%+%1.1"/K># i73Pd>(一起作 苍术入药 ( !主产江苏)湖北)河南 , 省!其中产于江苏
句容茅山一带的质量最优!茅苍术之名由此而来% 江
苏茅山是药材茅苍术的传统道地产区 "( % 近年来!由
于山地开垦及过度采挖!致使茅苍术野生资源濒临灭
绝!受到广泛关注!被列为江苏省珍稀保护植物 , B)( %
人工栽培是实现资源保护和可持续利用的有效手段%
茅苍术虽然品质优良!但是与北苍术相比!块茎较小!
产量低!栽培效益不高% 如何通过品种改良提高茅苍
术产量是目前人工栽培急需解决的关键问题%
染色体组倍性的变化导致植物产生较大遗传变
异% 药用植物多倍体一般具有根)茎)叶)花)果的巨型
性!抗逆性强!药用成份含量高等特性!因此药用植物
的多倍体育种具有较高的应用价值和增产潜力 %( %
目前!国内外关于茅苍术的研究主要集中在资源 B+( )
栽培 A B&( )药理 # B( )化学 " B,(等方面!关于茅苍术 倍性育种方面的研究鲜见报道% 本研究以秋水仙素作 为诱导剂!在建立茅苍术无菌高频快繁体系的基础上! 进行同源四倍体新种质的创制!旨在为进一步开展优 质高产多倍体育种奠定基础% !"材料与方法 !#!"材料 茅苍术,/&*/9"3+1&%*+& "U6=8]># /K>(种子
采于江苏省金坛市茅山%
!#"茅苍术无菌快繁体系的建立和优化 茅苍术种子流水冲洗 ,#138! +%Q的酒精消毒,# @ 后转入 #GQ的 Y9K4" 中灭菌 )138!无菌水清洗 ) (%
次!接入 ZI"1=?2@839X28P @N779,@1XP3=1#基本培养
基!建立无菌系% 采用正交设计进行增殖及生根培养基
的优化!试验设计见表 和表 "% 每个处理 % 瓶重复!培 养 "#P 后分别统计增殖系数和生根率% 培养温度为 "% j O!光照强度 %## (" ###4^!光照时间为 "6*P B% 数据处理均采用 IJII &G# 进行差异显著性分析%
!#%"同源四倍体离体诱导
秋水仙素采用 #G"""1的水系滤头和 "#1` 的注射
器抽滤灭菌% 将增殖培养 # (%P 的茅苍术无菌小芽
"#G% (:1#浸泡在表 % 所列的秋水仙素溶液中!处理相 应时间!用无菌水清洗 , () 次后接入ZI 培养基% 共设 计 A 个处理!每处理 "# 个幼芽!作 , 次重复%
#,# ! 期 茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定 表 !"增殖培养基正交设计因素和水平 L6),4!"LM4;6I.-5:698,434,:-;-5.M-0-96, 84:*09;-5+5-,*;456.*-9A48*GA 水平 X`aX4 因素 D2:T7? B-.H "19*` B #
M..H
"19*` B # "!) B/H "19*` B #
G# , #G "G#
"G# #G, G#
,G# " #G" #G#
!!注 B-. B苄基腺嘌呤&M..萘乙酸&"!)/"!) B二氯苯氧乙
酸% 下同%
!!M7TX B-. B]X8d<421387S=?38X>M.. #B82S6T624X:XT3:2:3P> "!)! B/ "!) BP3:647?S6X87^<2:XT3:2:3P>U6X@21X2@[747\389>
表 "生根培养基正交设计因素和水平 L6),4"LM4;6I.-5:698,434,:-;-5.M-0-96,
84:*09;-55--.*90 A48*GA
水平
X`aX4
因素 D2:T7?
蔗糖 I=:?7@XH9 M..H"19*` B # F-.H"19*` B #
,% #G#% "G% " "% #G"# G%
, "# #G# #G# !!F-.吲哚乙酸%
M7TX F- F8P74X*, 2:TX3:2:3P>
!#<"同源四倍体鉴定
经秋水仙素诱导后的茅苍术经过生根培养后!采
用形态鉴别)气孔观察)根尖染色体鉴定和流式细胞仪
分析相结合的方法!进行同源四倍体株系的确立%
G)G!形态观察和气孔鉴定!观察生根苗的形态!把
根)茎)叶发生明显变异的株系分瓶单株培养% 早上 A
(& 点取二倍体和外形变异较显著的叶片!进行气孔
观察!具体方法参考李红等 )( % 取同一位置!大小相 近的二倍体和疑似多倍体试管苗叶片!撕取下表皮!采 用卡宝品红染色压片!并在 E4<1S=@显微镜 "奥林巴 斯!日本#下镜检拍照!观察气孔大小和密度% 选取外 形变异较大的植株与二倍体相同生长部位的叶片各 "% 片!利用叶面积仪" ` B,###K!北京鸿苑鑫仪科技
有限公司#测量叶片的叶面积指数)叶长)叶宽及叶
厚!每次测量 % 次重复%
G)G"!染色体鉴定!具体方法参考董娟等 %( !并做
适当修改% 切取经过形态和气孔初步判定的茅苍术变
异植株根尖 G# (G%:1!置于离心管中加入 #GQ的 秋水仙素溶液!常温下处理 "6!在卡诺固定液"乙醇H
冰醋酸 k,l#中常温固定 "6!在 174*`B的盐酸
#O下解离 %# (#@!卡宝品红染色 (A138!然后压
片)镜检%
G)G,!流式细胞仪鉴定!具体方法参照李红等 )(和
张俊娥等 ( !并作适当修改% 取茅苍术组培苗叶片 " (, 片!用吸水纸吸干水分!置干燥的培养皿中!加入 #G%1` 预冷组织解离液 #GQ "aHa# U?3T78cB##! %1174*`B U?3@!"#1174*`B M2"0/U.!A#1174*`
B iK4!"#1174*`BM2K4!#G+Q $B巯基乙醇 "aHa#! SY值 +G%(!用锋利的刀片将叶片迅速切碎!"## 目尼 龙网过滤后 $ ###?*138 B$离心 %138!漂洗 , () 次!加 入 "14/.JF染色液 "$##89*1` B$ #!室温反应 $#138 后即可上样测定% $"结果与分析 $#!"快繁及生根培养基的优化 试验结果见表 ,% 方差分析表明 B-.和 M.. 的浓度对茅苍术无菌苗的增殖具有显著影响!最适浓 度分别为 "G#19*`B$和 #G"19*`B$!其相应处理的增 殖系数平均达 &G" j,G$!显著优于其他处理!而且苗 长势最好"图 $ B.#% "!) B/虽然可以影响茅苍术试 管苗的生长!但对增殖系数的提高作用并不明显% 因 此!茅苍术无菌苗增殖的最适培养基为 ZI h B-. "G#19*` B$ hM..#G"#19*` B$% 表 %"正交试验的丛生芽分化平均数 L6),4%"LM463456049GA)45-;)G8:*98GI48 C*.M.M4-5.M-0-96,84:*09 试验处理 U?X2T1X8T 因素 D2:T7? B-.H "19*` B$ # M..H "19*` B$ # "!) B/H "19*` B$ # 丛生芽分化平均数 U6X2aX?29X8=1]X? 7[]=P@P3[X?X8T32T378 $ $G# #G#% #G# %G" j$G): " $G# #G$# $G% ,G j#GPX , $G# #G"# "G% $G) j#G,9 ) "G# #G$# "G% $G j#G)[9 % "G# #G"# #G# &G" j$G$2 "G# #G#% $G% ,GA j"G+P + ,G# #G"# $G% $G# j#G#9 A ,G# #G#% "G% "G j$G"X[ & ,G# #G$# #G# +G) j#G"] !!注$小写字母表示在 #G#% 水平上差异显著% 下同% M7TX$ I1244XTX?@@T28P [7?@3983[3:28:X2T#G#% 4XaX4@38 T6XT2]4X> U6X@21X2@[747\389> $,#$ ! 期 茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定 表 ="不同浓度秋水仙素对茅苍术同源四倍体诱导的影响 L6),4="LM44;;4I.:-;8*;;4549.I-,IM*I*94I-9I49.56.*-9-96G.-.4.56+,-*8*98GI.*-9-;!"#$%"&()*+$,%*$ "LMG9)1# @N1 秋水仙素浓度 K74:63:38X:78:X8T?2T378HQ 处理时间 I72N389T31XH6 诱导结果 U6X?X@=4T@7[T6X38P=:T378 诱导率 L2TX7[38P=:T378HQ 嵌合率 L2TX7[:631X?3:HQ 死亡率 L2TX7[PX2T6HQ #>#% $" #># j#>#3 #># j#>#6 #># j#>#4 ") )>" j$>"6 ))>" j$%>&] #># j#>#4 , "%>A j>$: $,>) j,>%X ,>) j,>+N )A "> j#>"6 )%>" j$)>+] $)>) j,>$35 # #># j#>#3 >, j$>"[9 A">" j$>&: +" #># j#>#3 #># j#>#6 $##># j#>#2 #>$# $" #># j#>#3 $&>A j">"P #># j#>#4 ") &># j">"[ ,> j>+2 )>A j>N , "A> j">,] ">A j,>AX >" j>,N )A #># j#>#3 "#>) j">P "+>) j)>6 # #># j#>#3 #># j#>#6 ##># j#>#2
+" #># j#>#3 #># j#>#6 ##># j#>#2 #>"# " ,># j">)2 )># j#>%[96 +># j">+3 ") >) j)>%X ,#>, j+>): >A j">)5 , A> j,>"P )>" j">)X ,A># j>9
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# #># j#>#3 #># j#>#6 ##># j#>#2 +" #># j#>#3 #># j#>#6 ##># j#>#2
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)A #># j#>#3 #># j#>#6 ## j#>#2 # #># j#>#3 ">) j#>,96 &#> j#>]
+" #># j#>#3 #># j#>#6 ##># j#>#2 表 >"二倍体和同源四倍体茅苍术叶片比较 L6),4>"LM4I-A+65*:-9-;8*+,-*86986G.-.4.56+,-*8,4634:-;!"#%"&()*+,%* "LMG9)1# @N1
植株类型
U
X`2[2?X238PX^
叶长
X`89T6H:1
叶宽
_3PT6H:1
叶厚
X`2[T63:N8X@@H11
二倍体 /3S473P G) j#G" G j#G"+ G, j#G# GA j#GA
变异植株 Z=T28TS428T "G+ j#G+!! "G j#G%! GA j#G"! G) jG#!! !!注!表示在 #G#% 水平上差异显著!!!表示在 #G# 水平上差异显著% 下同% M7TX!@3983[3:28:X2T#G#% 4XaX4! !!@3983[3:28:X2T#G# 4XaX4>U6X@21X2@[747\389> %"讨论 %#!"茅苍术快繁培养基的优化 茅苍术丛生芽的分化和苗的长势与 B-.和 M..的浓度密切相关!在继代初期"" (, 代#!" 者所 需浓度较高!以 B-."G#19*` B hM..#G"#19*` B 的组合较好!随着继代次数的增加!浓度应逐渐降低! 以避免培养过程中发生激素累积现象!从而影响下一 代的分化% 本结论与李西腾等 +(的研究结果一致!但
,,# ! 期 茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定 以前相关文献中芽增殖系数最高的培养基 B-.和 M..的浓度较高!这可能与试验材料的来源)继代培 养的阶段)培养基的配置等因素有关 + BA( % %#"茅苍术诱导方法的选择
文献报道的用于多倍体诱导的化学药剂有秋水仙
素)安磺灵)富民隆等!其中秋水仙素应用最为广
泛 &( % 由于不同植物对秋水仙素的敏感程度不同!适 合诱导的秋水仙素浓度和处理时间也不同% 以芽为材 料诱导后的存活植株中通常含有较多的嵌合体!遗传 物质的多样会引起后代植株遗传的不稳定 "#( % 因此! 对于诱变条件的选择必须要综合考虑诱导率)嵌合体 形成率)死亡率等各个因素% 本试验中!用 #G#%Q和 #G#Q的秋水仙素溶液处理 ,6 及 #G"#Q的秋水仙
素溶液处理 "6 的茅苍术幼芽死亡率均较低!且能不 同程度的诱导出四倍体!诱导率为 "%GAQ (,G#Q! 但把诱导率以及嵌合率这 " 个因素考虑其中!筛选到 最合适的诱导条件为 #G"#Q的秋水仙素处理 "6!诱
导率为 ,Q!嵌合率为 )Q!且在该浓度得到的多倍体
大多为纯合体%
表 ?"二倍体和同源四倍体茅苍术气孔比较
L6),4?"LM4I-A+65*:-9-;8*+,-*86986G.-.4.56+,-*8
:.-A6.6,:-;!"#%"&()*+,%*$ "LMG9)1# @N1
植株类型
U
IT712T2
\3PT6H"1
气孔纵径
IT712T2
4X89T6H"1
每视野气
孔数
U6X8=1]X?7[
@T712T2@SX?[3X4PH个
二倍体 /3S473P G+ j#G% $%G% j#G+ +,G j$G+ 变异植株 Z=T28TS428T $&G% j#G! "%G+ j#G&! ,AG j"G#!! %#%"茅苍术鉴定方法的选择 如何从大量的诱导材料中筛选到四倍体植株是本 试验的关键环节% 多倍体的鉴定有很多种方法!包括 传统的形态学)气孔观察)根尖染色体鉴定以及流式细 胞仪分析法 "$( % 经秋水仙素处理后的茅苍术芽苗从 外部形态上发生了明显的变异!部分植株表现出茎干 加粗)叶片增厚)叶色加深等性状!这些性状在迎阳报 春 :$.8#& "$+"3";& "D?28:6 # ""( )杂交兰 <98=.3.#8 .%/+$1>+*.(.*" 6<]?3P@# ",( 以 及 杜 鹃 ?5"3"3+%3$"% "6<]?3P@# ")(等植株多倍体的诱导中也有相似的结论! 但是这种形态表征只能作为多倍体植株筛选的辅助指 标% 本试验采用形态鉴别)根尖染色体鉴定和流式细 胞仪分析相结合的方法进行茅苍术同源四倍体的鉴 定!确保鉴定结果的准确可靠% 诱导成功的药用植物四倍体很多!但迄今在生产 中得到应用的却很少% 究其原因主要是虽然诱导成 功!但由于获得的多倍体个体数量较少!不能通过大群 体选择育种提高遗传增益 "%( &获得的多倍体株系之间 在生长速度与有效成分含量有较大的差别!染色体倍 性的增加与化学成分含量的变化并不成正比关系 $&( % 因此!多倍体诱导成功!仅仅是多倍体育种的第一步! 同源四倍体的选育需要更大的群体和更多的世代!以 便能在多种变异中!选出所要求的类型% 对经过鉴定 的倍性材料进行扩繁移栽)进行生物学和农艺性状及 药材质量评价!进而选育出优质高产的茅苍术同源四 倍体新品种是本研究下一步将要进行的工作% <"结论 本试验采用 #G"#Q的秋水仙素处理茅苍术茎尖 $"6!成功获得了 ", 个茅苍术同源四倍体株系!此方法 诱导率高!不受自然条件的限制!诱导条件易于控制! 可以大大缩短诱导时间!同时鉴定和筛选出来的多倍 体植株可以立即应用组织培养技术在短期内迅速繁殖 出大量的试管苗!为选育优质)高产)抗逆性强的茅苍 术新品种提供充足的材料% 参考文献! $ (!中华人民共和国药典>"#$# 年一部 I(>北京$中国医药科技出 版社! "#$#$ $%# " (!许梦云>道地药材茅苍术的遗传多样性分析/(>镇江$江苏大 学! "##& B,
, (!黄璐琦! 肖培根! 王永炎>中国珍稀濒危药用植物资源调查
Z(>上海 上海科学技术出版社! "#" ,&A ) (!贺善安! 贺慧生! 吕晔! 冈田穗! 武田修己! 三木荣二>茅苍术 资源的保护和利用V(>植物资源与环境! &&,! ""# B % (!向增旭!高山林>忍冬组织培养体系的建立和优化>中国中药杂 志!"##+!,""")# "" B",
(!孙宇章! 郭兰萍!朱文泉! 黄璐琦! 顾晓鹤! 韩立剑! 潘耀忠>道
地药材茅苍术的资源遥感监测 V(>中国中药杂志! "##A! ,,
")# ,%, + (!孙宇章! 郭兰萍! 黄璐琦! 朱文泉! 潘耀忠! 高伟>茅山地区苍 术的分布现状分析V(>中药材! "##A! ,"%# )
A (!谷巍! 巢建国! 张莹! 李德运>濒危药用植物茅苍术野生抚育技
术研究V(>南京中医药大学学报! "##A! ")")# ")A B"%# & (!Y3?27N2M! b212P2M! i7P212U! U713T2b>F8 a3T?7S?7S292T378 7[,/&*/9"3+1&%*+&V(>J428T:X4?XS7?T@! &A)! ,",# A% BA+
$#(!_289b! /23KK! K27V` ! c= /I>K71S2?3@78 7[T6XX[X:T@7[
[=8924X8P7S6
28P 3T@9?7\T6 3863]3T7?
%,# !"#%&"()#*+&,-.*#/#&0*.+%*+1 "#%!"&"# $$#,# ($#,
K
S2T6\2<[7?[=8924X8P7S6
,(!Y3?27N2M! U713T2 b> -7T283:2428P :6X13:24Xa24=2T378 7[ ,/&*/9"3+1&%*+& S428T@S?7S292TXP 38 a3T?728P ]
)(!李红! 杨岚! 向增旭>甜叶菊同源四倍体离体诱导及鉴定 V(> 西北植物学报! "#"! ,""A# &" B&+ %(!董娟! 杨娜! 吴玉香! 赵晓明>大叶铁线莲四倍体的诱导及初步
鉴定V(>核农学报! "#"! "",# ) B)% (!张俊娥! 邓秀新>采用流式细胞仪分析柑橘愈伤组织的细胞周
期V(>果树学报! "##! """# +) B+),
+(!李西腾! 吴沿友>茅苍术的组织培养和快速繁殖V(>广西热带 农业! "##! #,""# ,, B,) A(!刘海萍!巢建国>药用植物茅苍术的组织培养V(>现代中药研
究与实践! "##%! &"%# $$ B$,
$&(!武振华! 牛炳韬! 王新宇>药用植物染色体加倍的研究进展
V(>西北植物学报!"##%!"%"$"# $ "%& B"%+)
"#(!张亚楠! 毕丽伟! 黄秀梅! 王雅英>四倍体鸡蛋参的诱导与鉴定
V(>内蒙古中医药! "#$)! ,,"%# $ %% B%+
"$(!乔永刚! 马璐琳! 赵晓明! 赵晓明! 吴玉香! 宋芸>秋水仙素诱
导党参四倍体V(>核农学报! "##&! ",")# $ % B%+$
""(!余道平! 李策宏>迎阳报春四倍体诱导及鉴定V(>核农学报!
"#$)! "A"# $ &$ B&
",(!尹翠翠! 张燕! 张景华! 陈瑶瑶! 王广东>秋水仙素诱导杂交兰
四倍体及倍性鉴定V(>核农学报! "#$#! ")",# $ %$A B%"$
")(!mn38o4n.>J74
V(>中医药导报!"##!"""# A, BA%
-,./"#( O98GI.*-9698O849.*;*I6.*-9-;2G.-.4.56+,-*8-;
!"#%"&()*+,%* "LMG9)1# @N1 _.MRY7895=28!b.MR 2`8! F`b2T389!cF.MReX89^= "<"+-+"(4"/.*#/#+@)&%7.%- ,-.*#/#+A%.B+1./9! )&%7.%-! !.&%-1#!"##&%# 2):.56I.F8 7?PX?T7:?X2TX8X\2=T7TXT?2S473P 9X?1S42@17[,/&*/9"3+1&%*+& "U6=8]># /K>]<.% B./"38P=:T378!
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