全 文 ：核 农 学 报!"#$%!"&"# $$#,# ($#,
!"#$%&"()#*+&$,-$.*#/#$&0*.+%*+1
收稿日期!"#$)*#%*"!接受日期!"#$)*$#*"$
基金项目!中央高校基本科研业务费基金项目"be"#$"$##
作者简介!王红娟!女!主要从事药用植物生物技术育种研究% 0*1234$"#$"$#)"#$;852=>XP=>:8
通讯作者!向增旭!副教授!主要从事药用植生物技术育种研究% 0*1234$d^ 3^289;852=>XP=>:8
文章编号!$###*A%%$""#$%##*$#,#*#+
茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定
王红娟!杨!岚!李雅婷!向增旭
"南京农业大学H中药材研究所!江苏 南京!"$##&%#
摘!要!本研究通过离体诱导的方式进行茅苍术同源四倍体新种质的创制!采用正交设计法优化茅苍术
无菌快繁体系!以茎尖为外植体进行四倍体的离体诱导!采用形态鉴别"根尖染色体鉴定和流式细胞仪
分析相结合的方法进行同源四倍体的鉴定# 结果表明%茅苍术最适增殖培养基为 ZI h B-."G#19&
`B$ hM..#G"#19&` B$$用 #G"#Q的秋水仙素处理 $"6 为诱导茅苍术同源四倍体的理想条件!四倍体
诱导率高达 ,Q# 本试验共诱导鉴定获得了 ", 个茅苍术同源四倍体株系!为进一步开展优质高产茅
苍术同源四倍体新品种的选育奠定了基础#
关键词!茅苍术$快繁体系$秋水仙素$同源四倍体
/EF$$#G$$A&H5>3@@8>$##*A%%$G"#$%G#>$#,#
! ! 中药茅苍术又称南苍术)茅术!来源于菊科
"K71S7@3T2X#苍术属".T?2:T<47PX@#多年生草本植物茅
苍术,/$&*/9"3+1&%*+& "U6=8]>#/K>(的干燥根茎!
与北苍术,/$&*/9"3+1*5.%+%1.1"/K># i73Pd>(一起作
苍术入药 $( !主产江苏)湖北)河南 , 省!其中产于江苏
句容茅山一带的质量最优!茅苍术之名由此而来% 江
苏茅山是药材茅苍术的传统道地产区 "( % 近年来!由
于山地开垦及过度采挖!致使茅苍术野生资源濒临灭
绝!受到广泛关注!被列为江苏省珍稀保护植物 , B)( %
人工栽培是实现资源保护和可持续利用的有效手段%
茅苍术虽然品质优良!但是与北苍术相比!块茎较小!
产量低!栽培效益不高% 如何通过品种改良提高茅苍
术产量是目前人工栽培急需解决的关键问题%
染色体组倍性的变化导致植物产生较大遗传变
异% 药用植物多倍体一般具有根)茎)叶)花)果的巨型
性!抗逆性强!药用成份含量高等特性!因此药用植物
的多倍体育种具有较高的应用价值和增产潜力 %( %
目前!国内外关于茅苍术的研究主要集中在资源 B+( )
栽培 A B&( )药理 $# B$$( )化学 $" B$,(等方面!关于茅苍术
倍性育种方面的研究鲜见报道% 本研究以秋水仙素作
为诱导剂!在建立茅苍术无菌高频快繁体系的基础上!
进行同源四倍体新种质的创制!旨在为进一步开展优
质高产多倍体育种奠定基础%
!"材料与方法
!#!"材料
茅苍术,/$&*/9"3+1&%*+& "U6=8]># /K>(种子
采于江苏省金坛市茅山%
!#$"茅苍术无菌快繁体系的建立和优化
茅苍术种子流水冲洗 ,#138! +%Q的酒精消毒,# @
后转入 #G$Q的 Y9K4" 中灭菌 )138!无菌水清洗 ) (%
次!接入 ZI"1=?2@839X28P @N779,@1XP3=1#基本培养
基!建立无菌系% 采用正交设计进行增殖及生根培养基
的优化!试验设计见表 $ 和表 "% 每个处理 % 瓶重复!培
养 "#P 后分别统计增殖系数和生根率% 培养温度为 "%
j$ O!光照强度$ %## (" ###4^!光照时间为 $"6*P B$%
数据处理均采用 IJII $&G# 进行差异显著性分析%
!#%"同源四倍体离体诱导
秋水仙素采用 #G"""1的水系滤头和 "#1` 的注射
器抽滤灭菌% 将增殖培养 $# ($%P 的茅苍术无菌小芽
"#G% ($:1#浸泡在表 % 所列的秋水仙素溶液中!处理相
应时间!用无菌水清洗 , () 次后接入ZI 培养基% 共设
计 $A 个处理!每处理 "# 个幼芽!作 , 次重复%
#,#$
! 期 茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定
表 !"增殖培养基正交设计因素和水平
L6),4!"LM4;6I.-5:698,434,:-;-5.M-0-96,
84:*09;-5+5-,*;456.*-9A48*GA
水平
X`aX4
因素 D2:T7?
B-.H
"19*` B$ #
M..H
"19*` B$ #
"!) B/H
"19*` B$ #
$G# , #G$ "G#
"G# $ #G, $G#
,G# " #G" #G#
!!注$ B-.$ B苄基腺嘌呤&M..$萘乙酸&"!)/$"!) B二氯苯氧乙
酸% 下同%
!!M7TX$ B-.$ B]X8d<421387S=?38X>M..$ #B82S6T624X:XT3:2:3P>
"!)! B/$ "!) BP3:647?S6X87^<2:XT3:2:3P>U6X@21X2@[747\389>
表 $"生根培养基正交设计因素和水平
L6),4$"LM4;6I.-5:698,434,:-;-5.M-0-96,
84:*09;-55--.*90 A48*GA
水平
X`aX4
因素 D2:T7?
蔗糖 I=:?7@XH9 M..H"19*` B$ # F-.H"19*` B$ #
$ ,% #G#% "G%
" "% #G"# $G%
, "# #G$# #G#
!!F-.$吲哚乙酸%
M7TX$ F-$ F8P74X*, 2:TX3:2:3P>
!#<"同源四倍体鉴定
经秋水仙素诱导后的茅苍术经过生根培养后!采
用形态鉴别)气孔观察)根尖染色体鉴定和流式细胞仪
分析相结合的方法!进行同源四倍体株系的确立%
$G)G$!形态观察和气孔鉴定!观察生根苗的形态!把
根)茎)叶发生明显变异的株系分瓶单株培养% 早上 A
(& 点取二倍体和外形变异较显著的叶片!进行气孔
观察!具体方法参考李红等 $)( % 取同一位置!大小相
近的二倍体和疑似多倍体试管苗叶片!撕取下表皮!采
用卡宝品红染色压片!并在 E4<1S=@显微镜 "奥林巴
斯!日本#下镜检拍照!观察气孔大小和密度% 选取外
形变异较大的植株与二倍体相同生长部位的叶片各
"% 片!利用叶面积仪" $` B,###K!北京鸿苑鑫仪科技
有限公司#测量叶片的叶面积指数)叶长)叶宽及叶
厚!每次测量 % 次重复%
$G)G"!染色体鉴定!具体方法参考董娟等 $%( !并做
适当修改% 切取经过形态和气孔初步判定的茅苍术变
异植株根尖 $G# ($G%:1!置于离心管中加入 #G$Q的
秋水仙素溶液!常温下处理 $"6!在卡诺固定液"乙醇H
冰醋酸 k,l$#中常温固定 $"6!在 $174*`B$的盐酸
#O下解离 %# (#@!卡宝品红染色 (A138!然后压
片)镜检%
$G)G,!流式细胞仪鉴定!具体方法参照李红等 $)(和
张俊娥等 $( !并作适当修改% 取茅苍术组培苗叶片 "
(, 片!用吸水纸吸干水分!置干燥的培养皿中!加入
#G%1` 预冷组织解离液 #G$Q "aHa# U?3T78cB$##!
$%1174*`B$ U?3@!"#1174*`B$ M2"0/U.!A#1174*`
B$
iK4!"#1174*`B$M2K4!#G$$+Q $B巯基乙醇 "aHa#!
SY值 +G%(!用锋利的刀片将叶片迅速切碎!"## 目尼
龙网过滤后 $ ###?*138 B$离心 %138!漂洗 , () 次!加
入 "14/.JF染色液 "$##89*1` B$ #!室温反应 $#138
后即可上样测定%
$"结果与分析
$#!"快繁及生根培养基的优化
试验结果见表 ,% 方差分析表明 B-.和 M..
的浓度对茅苍术无菌苗的增殖具有显著影响!最适浓
度分别为 "G#19*`B$和 #G"19*`B$!其相应处理的增
殖系数平均达 &G" j,G$!显著优于其他处理!而且苗
长势最好"图 $ B.#% "!) B/虽然可以影响茅苍术试
管苗的生长!但对增殖系数的提高作用并不明显% 因
此!茅苍术无菌苗增殖的最适培养基为 ZI h B-.
"G#19*` B$ hM..#G"#19*` B$%
表 %"正交试验的丛生芽分化平均数
L6),4%"LM463456049GA)45-;)G8:*98GI48
C*.M.M4-5.M-0-96,84:*09
试验处理
U?X2T1X8T
因素 D2:T7?
B-.H
"19*` B$ #
M..H
"19*` B$ #
"!) B/H
"19*` B$ #
丛生芽分化平均数
U6X2aX?29X8=1]X?
7[]=P@P3[X?X8T32T378
$ $G# #G#% #G# %G" j$G):
" $G# #G$# $G% ,G j#GPX
, $G# #G"# "G% $G) j#G,9
) "G# #G$# "G% $G j#G)[9
% "G# #G"# #G# &G" j$G$2
"G# #G#% $G% ,GA j"G+P
+ ,G# #G"# $G% $G# j#G#9
A ,G# #G#% "G% "G j$G"X[
& ,G# #G$# #G# +G) j#G"]
!!注$小写字母表示在 #G#% 水平上差异显著% 下同%
M7TX$ I1244XTX?@@T28P [7?@3983[3:28:X2T#G#% 4XaX4@38 T6XT2]4X>
U6X@21X2@[747\389>
$,#$
! 期 茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定
表 ="不同浓度秋水仙素对茅苍术同源四倍体诱导的影响
L6),4="LM44;;4I.:-;8*;;4549.I-,IM*I*94I-9I49.56.*-9-96G.-.4.56+,-*8*98GI.*-9-;!"#$%"&()*+$,%*$ "LMG9)1# @N1
秋水仙素浓度
K74:63:38X:78:X8T?2T378HQ
处理时间
I72N389T31XH6
诱导结果 U6X?X@=4T@7[T6X38P=:T378
诱导率
L2TX7[38P=:T378HQ
嵌合率
L2TX7[:631X?3:HQ
死亡率
L2TX7[PX2T6HQ
#>#% $" #># j#>#3 #># j#>#6 #># j#>#4
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# #># j#>#3 ">) j#>,96 &#>$ j#>]
+" #># j#>#3 #># j#>#6 $##># j#>#2
表 >"二倍体和同源四倍体茅苍术叶片比较
L6),4>"LM4I-A+65*:-9-;8*+,-*86986G.-.4.56+,-*8,4634:-;!"#$%"&()*+$,%*$ "LMG9)1# @N1
植株类型
U叶面积指数
X`2[2?X238PX^
叶长
X`89T6H:1
叶宽
_3PT6H:1
叶厚
X`2[T63:N8X@@H11
二倍体 /3S473P $G) j#G" $G j#G"+ $G, j#G# $GA j#GA
变异植株 Z=T28TS428T "G+ j#G+!! "G$ j#G%! $GA j#G"! G) j$G#!!
!!注$!表示在 #G#% 水平上差异显著!!!表示在 #G#$ 水平上差异显著% 下同%
M7TX$!@3983[3:28:X2T#G#% 4XaX4! !!@3983[3:28:X2T#G#$ 4XaX4>U6X@21X2@[747\389>
%"讨论
%#!"茅苍术快繁培养基的优化
茅苍术丛生芽的分化和苗的长势与 B-.和
M..的浓度密切相关!在继代初期"" (, 代#!" 者所
需浓度较高!以 B-."G#19*` B$ hM..#G"#19*` B$
的组合较好!随着继代次数的增加!浓度应逐渐降低!
以避免培养过程中发生激素累积现象!从而影响下一
代的分化% 本结论与李西腾等 $+(的研究结果一致!但
,,#$
! 期 茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定
以前相关文献中芽增殖系数最高的培养基 B-.和
M..的浓度较高!这可能与试验材料的来源)继代培
养的阶段)培养基的配置等因素有关 $+ B$A( %
%#$"茅苍术诱导方法的选择
文献报道的用于多倍体诱导的化学药剂有秋水仙
素)安磺灵)富民隆等!其中秋水仙素应用最为广
泛 $&( % 由于不同植物对秋水仙素的敏感程度不同!适
合诱导的秋水仙素浓度和处理时间也不同% 以芽为材
料诱导后的存活植株中通常含有较多的嵌合体!遗传
物质的多样会引起后代植株遗传的不稳定 "#( % 因此!
对于诱变条件的选择必须要综合考虑诱导率)嵌合体
形成率)死亡率等各个因素% 本试验中!用 #G#%Q和
#G$#Q的秋水仙素溶液处理 ,6 及 #G"#Q的秋水仙
素溶液处理 $"6 的茅苍术幼芽死亡率均较低!且能不
同程度的诱导出四倍体!诱导率为 "%GAQ (,G#Q!
但把诱导率以及嵌合率这 " 个因素考虑其中!筛选到
最合适的诱导条件为 #G"#Q的秋水仙素处理 $"6!诱
导率为 ,Q!嵌合率为 )Q!且在该浓度得到的多倍体
大多为纯合体%
表 ?"二倍体和同源四倍体茅苍术气孔比较
L6),4?"LM4I-A+65*:-9-;8*+,-*86986G.-.4.56+,-*8
:.-A6.6,:-;!"#$%"&()*+$,%*$ "LMG9)1# @N1
植株类型
U气孔横径
IT712T2
\3PT6H"1
气孔纵径
IT712T2
4X89T6H"1
每视野气
孔数
U6X8=1]X?7[
@T712T2@SX?[3X4PH个
二倍体 /3S473P $$G+ j#G% $%G% j#G+ +,G j$G+
变异植株 Z=T28TS428T $&G% j#G! "%G+ j#G&! ,AG j"G#!!
%#%"茅苍术鉴定方法的选择
如何从大量的诱导材料中筛选到四倍体植株是本
试验的关键环节% 多倍体的鉴定有很多种方法!包括
传统的形态学)气孔观察)根尖染色体鉴定以及流式细
胞仪分析法 "$( % 经秋水仙素处理后的茅苍术芽苗从
外部形态上发生了明显的变异!部分植株表现出茎干
加粗)叶片增厚)叶色加深等性状!这些性状在迎阳报
春 :$.8#& "$+"3";& "D?28:6 # ""( )杂交兰 <98=.3.#8
.%/+$1>+*.(.*" 6<]?3P@# ",( 以 及 杜 鹃 ?5"3"3+%3$"%
"6<]?3P@# ")(等植株多倍体的诱导中也有相似的结论!
但是这种形态表征只能作为多倍体植株筛选的辅助指
标% 本试验采用形态鉴别)根尖染色体鉴定和流式细
胞仪分析相结合的方法进行茅苍术同源四倍体的鉴
定!确保鉴定结果的准确可靠%
诱导成功的药用植物四倍体很多!但迄今在生产
中得到应用的却很少% 究其原因主要是虽然诱导成
功!但由于获得的多倍体个体数量较少!不能通过大群
体选择育种提高遗传增益
"%( &获得的多倍体株系之间
在生长速度与有效成分含量有较大的差别!染色体倍
性的增加与化学成分含量的变化并不成正比关系 $&( %
因此!多倍体诱导成功!仅仅是多倍体育种的第一步!
同源四倍体的选育需要更大的群体和更多的世代!以
便能在多种变异中!选出所要求的类型% 对经过鉴定
的倍性材料进行扩繁移栽)进行生物学和农艺性状及
药材质量评价!进而选育出优质高产的茅苍术同源四
倍体新品种是本研究下一步将要进行的工作%
<"结论
本试验采用 #G"#Q的秋水仙素处理茅苍术茎尖
$"6!成功获得了 ", 个茅苍术同源四倍体株系!此方法
诱导率高!不受自然条件的限制!诱导条件易于控制!
可以大大缩短诱导时间!同时鉴定和筛选出来的多倍
体植株可以立即应用组织培养技术在短期内迅速繁殖
出大量的试管苗!为选育优质)高产)抗逆性强的茅苍
术新品种提供充足的材料%
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-37TX:687479$$(!e627Z! _289WW! E=<289e! Y28 -c! _289_-! _X3b! _=
b! b289->IX4X:T3aX[?2:T378 7[,/$&*/9"3+1&%*+& "U6=8]># /K>
28P 3T@9?7\T6 3863]3T7?
%,#$
!"#$%&"()#*+&$,-$.*#/#$&0*.+%*+1
"#$%!"&"# $$#,# ($#,
K$"(!LX8 KR! /23KK>V2@1783:2:3P 3@38a74aXP 38 T6X@39824389
S2T6\2<[7?[=8924X8P7S6,/$&*/9"3+1&%*+& S428T4XT@V(>-ZKJ428T-37479")# $ )+ B%)
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,/$&*/9"3+1&%*+& S428T@S?7S292TXP 38 a3T?728P ]?63d71XV(>J428TKX4LXS7?T@! $&&#! &"# $ ,," B,,)
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究与实践! "##%! $&"%# $ $$ B$,
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Z7?S674793:24:62?2:TX?3@T3:@! :6?717@71X8=1]X?28P [47\:
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