筛选和鉴定水稻卷叶突变体是研究叶片形态建成机理的前提.本研究利用甲基磺酸乙酯对常规粳稻秀水09进行诱变, 获得了一个稳定遗传的类感干尖线虫卷叶突变体(nematode infestation mimic rolling leaf mutant, nir).与野生型相比, nir全生育期叶尖卷曲、枯萎, 表型与干尖线虫侵染症状相似.此外, 突变体植株矮小, 叶片表面较光滑, 有效分蘖数少.采用nir与秀水09杂交的F2群体进行遗传分析, 结果表明nir的类感干尖线虫卷叶性状受一对隐性核基因控制.利用nir与籼稻93-11杂交获得的F2群体, 采用分子标记技术将目的基因最终定位在水稻第二染色体2~88w和2~82w之间, 遗传距离为1.1 cM, 物理距离245 kb.研究结果表明, nir很可能是一个尚未报道的新基因, 进一步克隆nir基因有可能揭示与现有报道的卷叶基因不同的卷叶调控机理, 为筛选理想株型、培育高产水稻品种提供理论基础和供试材料.
全 文 ：书!核 农 学 报!"#$%!"&"’# $#($) *#(""
!"#$%&’"()#*’+&$,-$.*#’/#$&’0*.+%*+1
收稿日期!"#$’+#’+#,!接受日期!"#$’+#&+"#
基金项目!国家自然科学基金"-$$#$’",# !核农学产业科技创新团队""#$#.%##--# !浙江省植物有害生物防控重点实验室+省部共建国家重点实
验室培育基地!浙江省农业科学院提升工程项目!浙江省 &’$# 计划""#$"/$"&#$+"#
作者简介!陈!蕾!女!主要从事植物分子生物学研究% 0+1234$ 5678473$&,"954:$(-;5<1
李小华!女!主要从事植物发育与基因工程研究% 0+1234$ 473=>,)##:$(-;5<1% 同为第一作者%
通讯作者!金庆生!男!研究员!主要从事水稻育种研究% 0+1234$ ?38@A:1234;6B;B?;58
文章编号!$###+,%%$""#$%##’+#($)+#(
一个水稻类感干尖线虫卷叶突变体的
遗传分析与基因定位
陈!蕾$!"!李小华-!叶胜海$!张小明$!翟荣荣$!金庆生
" $ 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所!浙江 杭州!-$##"$&" 南京野生植物综合利用研究院!
江苏 南京!"$##’"&- 杭州师范大学生命与环境科学学院!浙江 杭州!-$##-(#
摘!要!筛选和鉴定水稻卷叶突变体是研究叶片形态建成机理的前提! 本研究利用甲基磺酸乙酯对常规
粳稻秀水 #& 进行诱变"获得了一个稳定遗传的类感干尖线虫卷叶突变体 # 8712C
此外"突变体植株矮小"叶片表面较光滑"有效分蘖数少! 采用 %.$与秀水 #& 杂交的 H" 群体进行遗传分
析"结果表明 %.$的类感干尖线虫卷叶性状受一对隐性核基因控制! 利用 %.$与籼稻 &-+$$ 杂交获得的
H" 群体"采用分子标记技术将目的基因最终定位在水稻第二染色体 " *,,I和 " *,"I之间"遗传距离
为 $J$ 5K"物理距离 "’% LM! 研究结果表明"%.$很可能是一个尚未报道的新基因"进一步克隆 %.$基因
有可能揭示与现有报道的卷叶基因不同的卷叶调控机理"为筛选理想株型%培育高产水稻品种提供理论
基础和供试材料!
关键词!水稻&类感干尖线虫&卷叶&遗传分析&基因定位
NOP$$#J$$,(&Q?;3AA8;$##+,%%$J"#$%J#’;#($)
!!水稻"2$34& 1&/.5& R;#是世界上最重要的粮食作
物之一!也是研究植物功能基因的模式作物% 提高单
产’实现高产和超高产一直是水稻育种家追求的目
标 ($ S") % 叶片是进行光合作用的主要器官!水稻产量
的 &%T来自于叶片的光合作用!因此叶片形态是水稻
的重要农艺性状之一!与植物株型构成密切相关!能够
影响产量和品质!因而受到育种家的关注 (- S)) % "# 世
纪 ,# 年代以来!叶片形态改良一直是超高产理想株型
育种的重要方面 (,) %
卷叶是水稻叶片形态特征之一!其最直接的效应
是对叶片的直化作用!解决了叶长与叶挺二者之间的
矛盾% 与叶片卷曲度低的组合相比!叶片卷曲度高和
中等的组合具有较小的叶片角度’较高的叶片挺直度
和较低的消光系数 (&) % 陈宗祥等 ($#)研究表明 $’"C#基
因在高肥水平下对高产有利!且在一定条件下有利于
提高杂交稻稻米品质% 近年来!卷叶基因的发掘和研
究成为叶片性状研究的热点之一% 研究者利用不同的
诱变手段创造出一批卷叶突变材料!遗传分析结果显
示!卷叶性状具有多种遗传控制模式!其中多数卷叶性
状受一对隐性基因控制% 如罗伟等 ($$) ’U38
性状的隐性基因&也有表现为单基因显性遗传的卷叶
突变材料如 $$$""C# ($’) ’67-& ($%)和 879," ($()等% 邵元
健等 ($)+$,)对美国 &$VW#(, 品种和日本流岗卷叶粳品
种的研究表明!二者的卷叶性状均表现为不完全显性
遗传% 随着水稻全基因组测序工作的完成和水稻分子
标记技术的发展!利用图位克隆方法鉴定水稻突变基
因越来越普遍%
本研究在 0KV 诱变粳稻秀水 #& 的 K" 群体中发
现一个与干尖线虫侵染症状相似的卷叶突变体!对该
突变体的形态特征和遗传特性进行研究!并利用分子
标记技术对其进行基因定位!以期为该基因的图位克
)$(
核!农!学!报 "& 卷
隆和功能分析提供理论依据%
!"材料与方法
!#!"供试水稻材料
常规材料$粳稻品种秀水 #&!籼稻品种 &-+$$%
突变体材料$粳稻品种秀水 #& 干种子经 0KV 诱
变后获得一个卷叶突变体!由于表型与干尖线虫侵染
水稻植株后的表型相似!定名为类感干尖线虫卷叶突
变体 " 8712C
%.$#% 在杭州’海南两地经过反复自交和选择!%.$突
变性状稳定遗传%
!#$"遗传分析和定位群体的构建
"#$# 年 & 月在浙江省农业科学院杭州试验农场
以突变体 %.$为母本!分别与秀水 #& 和 &-+$$ 杂交"图
$#!"#$$ 年春季将杂种 H$ 种植于海南省陵水县浙江
省农业科学院试验田!收获 H" 种子% "#$$ 年 % 月在
浙江省农业科学院海宁杨渡科研创新基地种植 H"%
对 %.$X秀水 #& 的 H" 群体统计正常表型和突变表型
的植株数!进行突变性状的遗传分析&在 %.$X&-+$$ 的
H" 群体取突变表型单株!用于突变基因的定位%
表 !"类感干尖线虫卷叶突变体的遗传分析
%&’()!"*)+,)+&-./0/10)2&-/3).01)4-&-./02.2.5,/(.0+ ()&126-&0-.07$ 8/86(&-./0/1-9)
5,/44)4’)-:))026-&0-4&03:.(3-;8)8(&0-4
组合类型
/F
Z
H"
正常
[
.<438G472E
!"
"-\$#
!"#;#%
突变体Q秀水 #& -’% "%# &% #;,& -;,’
注$]$%.$遗传分析群体& $^%.$基因定位群体%
[
7.+&0&(;4.4&03+)0)2&88.0+
!#>"水稻 ?@A的提取
用 ZWV 简易提取法 ($&) $取水稻苗期的新鲜叶片
- *% 51放于 $J% 1R离心管中!倒入少量液氮!用灭菌
竹筷捣碎叶片&然后加入 (## !R的 ZWV 提取液 "$##
11<4*RS$ ZF3A+_/4!$# 11<4*RS$ 0NZ]!Y_值 ,J#!$
1<4*RS$ U/4!灭菌#!(%‘温浴 -# 138!$" ### F*138 S$
离心 $% 138!转移上清液 ’## !R到另一 $J% 1R离心
管&加入 S"#‘预冷的异丙醇 ’## !R!盖好离心管!
S"# ‘冰箱中搁置 $# 138&$$ ### F*138 S$离心 $#
138!弃掉上清液!加入 )#T乙醇!, ### F*138 S$离心
% 138!完全弃掉上清后将离心管倒置过夜晾干&每管
加入 $## *$%# !R高温灭菌 DD_"O! S"# ‘保存%
!#B"!"#基因定位
依照 /<>A4<8 等 ("#)提出的图位克隆法筛选与目的
基因连锁的标记方法!找到突变基因所在染色体的大
致位置!初步定位构建突变位点的遗传连锁图谱&然后
进行精细定位构建突变位点物理图谱!再通过染色体
步移逐渐找到目的基因%
采用 K356741
组!每组随机挑选 $" 株植株提取 N[]!形成显性表型
N[]混合池和隐性表型 N[]混合池% 选取均匀分布
在 $" 条染色体上的 %#) 对 VV.引物进行扩增!筛选在
秀水 #& 和 &-+$$ 间有多态性的引物 ""’ 对% 继续利
用 ""’ 对引物对显池’隐池 N[]扩增!找到可能与目
的基因连锁的标记% 最后用分离后代的所有单株对标
记进行验证!确定连锁关系后根据连锁距离的大小进
行初定位%
!#C"连锁分析
依据 %.$初定位结果!利用 K]WK]U0.Q0aW
b7FA3<8 -J# 作图软件构建目标基因所在区域的分子标
记连锁图谱%
$"结果与分析
$#!"!"#表型分析
从分蘖期开始!%.$表现为叶尖卷曲并且枯萎’植株
矮小’分蘖数少’叶表面光滑"图 " S]’图 " S^ #% 成熟
,$(
!’ 期 一个水稻类感干尖线虫卷叶突变体的遗传分析与基因定位
注$]$分蘖期野生型秀水 #&"左#和类感干尖线虫卷叶突变体"右#
的表型& $^类感干尖线虫卷叶突变体叶片表型&/$成熟期野生型秀
水 #&"左#和类感干尖线虫卷叶突变体"右#的表型&N$野生型秀水
! #&"左#和类感干尖线虫卷叶突变体"右#的穗子%
[
8712C
$^ R72c7A
Y678
W283547A
图 $"类感干尖线虫突变体表型
7.+<$"D9)0/-;8)/1-9)0)2&-/3).01)5-./02.2.5
,/(.0+ ()&126-&0-
期!%.$植株与分蘖期表型相似"图 " S/#% 对穗部性状调
查发现!穗部一次枝梗少!穗长短!穗粒数少"图 " SN#%
$#$"!"#的遗传分析
注$K>$%.(突变体混合池&d$&-+$$ 混合池&H$ $&-+$$ 与 %.(杂交 H$ 正常株混合池&!$交换单株%
[
图 >"分子标记 EF$GB! 在两亲本之间"杂合体 7! 及部分具有突变型的 7$ 单株的分离带型
7.+<>"%9)4)+),&+&-./0/1**E2&,H),EF$GB! .0’/-98&,)0-4# 7! &034/2)26-&0-G-;8)7$ 8(&0-4
%.$与野生型秀水 #& 杂交的 H$ 表型与野生型无
差别!表明突变性状受隐性基因控制&H" 表型分离!在
获得的 -’% 个单株中!突变表型 &% 株!正常表型 "%#
株% 卡平方适合性测验表明类感干尖线虫卷叶突变性
状在 H" 中正常表型植株与突变表型植株的分离比符
合理论值 -\$!表明控制突变性状的基因由一对隐性
基因控制%
$#>"引起类感干尖线虫卷叶表型的基因分子标记定位
用 %#) 对 VV.微卫星分子标记对秀水 #& 和 &-+$$
进行多态性检测!筛选获得 ""’ 对多态性标记!用 H"
群体进行基因定位试验!发现 %.$的突变位点与第二
染色体上的 VV.标记 .K"+’$ 连锁 "图 - #!定位在
.K"+,)I与 .K"+’$ 之间的 $-J’5K遗传距离内% 利
用 [/^ P水稻数据库收录的粳’籼稻 N[]数据!经过
M42AC比对工具设计了 % 对有效的 P8D74引物!将控制
突变性状的目的基因定位在标记 " *,,I和 " *,"I
之间的 "’% LM 以内!包含 ]W##’$$$ 和 ]W##(’-, " 个
]^/片段"图 ’#%
>"讨论
利用水稻叶片形态突变体开展研究可以为构建理
想株型’培育高产优质水稻提供依据% 在水稻中已获
…………
图 B"!"#基因在水稻第二染色体上的分子定位
7.+
核!农!学!报 "& 卷
表 $"本研究开发的多态性 J0?)(标记$部分%
%&’()$"*/2)8/(;2/,89.5J0?)(2&,H),43)K)(/8)3.0-9.44-63;
引物名称
WF317F8217
正向序列
H
.7c7FA7YF317F"%fS-f#
所在 ]^/
OF3G382C7D ]^/
" *,"I Z]ggg]gZ]]ZZ//ZZZggZ ]]]g]]g]]g]ZgggZ/Z// ]W##(’-,
" *,(I gZggZ/Zg]ZgZ//Z/]]Z/ Zgg/]//ZZ/ZZZ]]Z/]]/ ]W##(’-,
" *,,I ]g/ZZg]ZggZZZZ/Z]gZ// ]Z/]]]]/Zgg/]gZ/]ZZ/ ]W##’$$$
" *&(I ]]Z]g/]Zg/]Z/]///Z]/ ]g/]/]]gZZZgZgZZZgZg ]W##’$"’
" *$#’I /ZZ/ZZgg/]Z]/Z//]]Z]gZ Z]/]/]/]/]//Z//ZZ]ZZ ]W##(’-,
得了多个叶片形态突变体!针对卷叶相关性状已经有
"# 多个基因的定位研究被相继报道% 除了 , 号和 $$
号染色体以外!在水稻其他 $# 条染色体上!均分布有
卷叶相关基因&其中!以第 $!-!’!&!$" 号染色体上居
多!第 $# 号染色体上最少% $’$’$’’’#$’"/#都分布在 $
号染色体 ($#) &$’% ($#) ’$’$# "/# ($#) ’21,;2) ("’ S"%)位于 -
号染色体&$’" ($#) ’<87+’+$ ("") ’$’$$"/#+" ("()位于 ’ 号染
色体&8’$# "/# (&) ’$’& "/# ($") ’077$ ($")被定位在 & 号染
色体&$’- ($#) ’%&’- (-#) ’%$’$ (-$)被定位在 $" 号染色体&
$’$""/# ($’)位于 $# 号染色体&此外!.$’$ ($$+$") ’$’"/# ($,) ’
$’) ("") ’$’, ("-) ’1=91’(")) ’$’$- (",) ’$’("/# ($#) ’$’$$"/# ("&) !
分别被定位在 "’"’%’%’(’(’) 和 ) 号染色体上%
植物叶片发育是一个复杂的过程!要得出水稻卷
叶发育现象的正确解释!还需进一步对突变体叶片发
育的早期阶段进行扫描电镜观察’克隆基因!并对基因
的结构和功能进行研究% 目前!对卷叶基因的分子调
控机制也已见报道% h628G等 (-") 的研究证实 $’& 与
0>,772?976@A$"077$#为同一基因!编码一个 Ki^ 家
族的 V_]jUiH转录因子!调控叶片近远轴的极性%
V63等 (--)研究结果表明水稻的 21,;2) 编码一个具有
W]h和 WPdP结构域的 ]FG<82>C7"]gO#家族蛋白!参
与 13.[]或 A3.[]的靶 1.[]的切割!该基因的过
量表达与基因沉默植株均表现为叶片正卷% 因此!小
分子 .[]也参与植物对叶片发育的调控%
对基因进行精细定位是图位克隆最为重要的一
步!分子标记和遗传图谱是跟踪’定位和克隆相关基因
的一种有效方法% 本研究将类感干尖线虫卷叶基因
%.$定位在第 " 号染色体上!位于 " *,,I与 " *,"I之
间!遗传距离为 $J$ 5K!物理距离为 "’% LM% 将 %.$与
同样定位在 " 号染色体上的 .$’$ ($$ S$")和 $’"/# ($,)进行
比对!存在较大差异% 其中!.$’$ 突变体表现为反卷
叶!而 $’"/#的表型由一对不完全隐性主基因控制% 通
过文献检索未发现与 %.$表型完全相同的突变体!因
此!%.$很可能是一个尚未报道的新基因% 对定位区间
中的基因进行分析!没有发现 13.[]基因!也没有发
现与叶片近轴化Q远轴化发育相关的编码 _N+hPWPPP
转录因子的基因以及 ]gO蛋白的同源基因!这暗示着
%.$可能与现有报道的基因有不同的调控卷曲的机理%
当然!未来要揭示真相还需要进一步基因克隆及功能
分析%
B"结论
本研究在甲基磺酸乙酯诱变常规粳稻秀水 #& 的
后代中获得 $ 个稳定遗传的类感干尖线虫卷叶突变体
%.$!该性状受一对隐性核基因控制!利用分子标记技
术最终将目的基因定位在水稻第二染色体 " *,,I和
" *,"I之间!遗传距离为 $J$5K!物理距离为 "’% LM%
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F7G>42C38G472E2M2e324574D7c74
(--)!V63h i! d28Gk! d28 a! V678 g! d28Ga! h628Gk;
Oc7F7eYF7AA3<8
"$# $&& S$#,
$"(
!"#$%&’"()#*’+&$,-$.*#’/#$&’0*.+%*+1
"#$%!"&"’# $#($) *#(""
L)0)-.5A0&(;4.4&03F/()56(&,F&88.0+ /1& @)2&-/3)
J01)4-&-./0F.2.5E/(.0+ I)&1F6-&0-.0E.5)
/_0[R73$!"!RPa32<6>2-!i0V678G623$!h_][ga32<138G$!h_]P.<8GF<8G$!kP[j38GA678G$
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A’4-,&5-$V5F77838G28D 3D78C3E352C3<8
28712C
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