全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１４，２８（１）：００２９ ～ ００３５
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０１⁃２１　 接受日期：２０１３⁃０３⁃２８
基金项目：广东省科技厅项目 （ ２００９Ｂ０６０６００００８ ），北京市科技计划课题 （ Ｚ１２１１００００１２１２００２ ），北京市农林科学院科技创新基金
（ＫＪＣＸ２０１１０１００１）
作者简介：叶慧敏，女，主要从事生物活性物质的分离纯化研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｅｈｕｉｍｉｎ０６０４＠ １６３． ｃｏｍ
通讯作者：于莉，女，教授，主要从事植物病理学教学和科研。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｕｌｉ２３６２＠ ｈｏｔｍａｉｌ． ｃｏｍ
刘伟成，男，研究员，主要从事植物病害及其生防微生物研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｕｗｉｃｈ＠ １６３． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）１⁃００２９⁃０７
类芽孢杆菌 Ｂｇ１ 抗真菌蛋白的分离及其特性分析
叶慧敏１，２ 　 张殿朋２ 　 刘　 霞１ 　 于　 莉１ 　 刘伟成２
（ １ 广东海洋大学农学院，广东 湛江　 ５２４０８８； ２北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京　 １０００９７）
摘　 要：为了明确类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ）Ｂｇ１ 的主要抗真菌物质及其特性，本文利用抑菌圈法测
定了 Ｂｇ１ 抗菌蛋白在各种处理条件下抑菌活性的稳定性；通过 ６０％硫酸铵沉淀、ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 离
子交换层析及 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 凝胶过滤层析进行了抗菌蛋白的分离纯化，以 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ进行了其纯度检
测。 结果表明，２８ ～ １００℃处理 ３０ ｍｉｎ、４℃存放 ５５ ｄ及在 ｐＨ值 ３ ～ ７ 范围内菌株 Ｂｇ１ 抗菌蛋白抑菌活
性均无显著性变化，但 ｐＨ值>８ 显著影响其抑菌活性，蛋白酶处理则使其抑菌活性完全丧失；纯化后所
得抗菌蛋白分子量约 １０ ＫＤ。 据此可知，类芽孢杆菌 Ｂｇ１ 主要抗菌活性物质为低分子量蛋白，其对热和
酸性条件及贮存时间稳定性好，具有进一步开发应用的潜能。
关键词：类芽孢杆菌；抗真菌蛋白；分离纯化；稳定性分析
ＤＯＩ：１０：１１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１． ２０１４． ０１． ００２９
　 　 尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）是重要的植物
维管束系统性侵染的土传病害病原菌，其多个专化型
分别能引起甘蓝、香蕉、番茄和瓜类枯萎病，在生产上
的危害十分严重［１ － ５］。 如尖孢镰刀菌粘团专化型（Ｆ．
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ）引起的甘蓝枯萎病近年
来在我国山西、河北、北京等甘蓝产区迅速蔓延，造成
甘蓝产量的急速下降，已成为甘蓝生产的重要限制因
素［６ － ７］；尖孢镰刀菌古巴专化型（Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ．
ｃｕｂｅｎｓｅ）引起的香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害［２］，
已经蔓延到全世界，在国内以广东、海南等省较为严
重，极大地阻碍了香蕉产业的发展［８］。 对镰刀菌枯萎
病的防治已经成为农业生产中急需解决的一大难题。
由于此类病原在土壤中的存活繁殖能力极强，传统的
化学防治常需加大农药用量方能达到一定的效果；而
化学农药无限制的大量应用对生态环境和农产品质量
的负面影响已十分突出，作为化学防治的替代和补充，
生物防治日益受到关注［９ － １０］。 目前， 芽孢杆菌
（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）、 土壤杆菌 （ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、 假单胞菌
　 　 　 　
（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）、 欧 文 氏 菌 （ Ｅｒｗｉｎｉａ ）、 黄 单 胞 菌
（ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ） 等细菌， 念珠菌 （ Ｃａｎｄｉｄａ ）、 木霉
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等真菌，以及链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等放
线菌均已成功应用于植物病害生物防治［１１ － １２］。 类芽
孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ． ）由于能产生丰富的抗菌物
质，是防治植物病害理想的生防材料［１３］。 但是，利用
类芽孢杆菌来控制甘蓝和香蕉镰刀菌枯萎病的系统研
究却鲜为报道。
类芽孢杆菌菌株 Ｂｇ１ 是从柬埔寨磅清扬郊区杂草
地土样中分离获得的拮抗菌，该菌株及其培养滤液对
香蕉枯萎病菌和甘蓝枯萎病菌均具有很好的拮抗活
性，初步确定其主要抗菌活性产物为蛋白类物质［１４］。
本试验以甘蓝和香蕉枯萎病菌为指示菌，对 Ｂｇ１ 产生
的主要抗菌物质进行了分离纯化，并对其与应用相关
的主要理化特性进行了研究，旨在为其生物农药产品
的进一步开发研究奠定基础。
９２
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
１　 材料与方法
１􀆰 １　 供试菌株
类芽孢杆菌菌株 Ｂｇ１ 和香蕉枯萎病菌 （ Ｆ．
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ）４ 号生理小种由广东海洋大
学农学院植保中心实验室分别分离自柬埔寨磅清扬郊
区杂草地土样和湛江硇洲岛香蕉品种巴西蕉（Ｍｕｓａ
ＡＡＡ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ）病株；甘蓝枯萎病菌（Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．
ｓｐ． ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ）由北京市农林科学院植保环保所生
防微生物室分离自北京延庆县甘蓝生产区中甘 ２１ 号
甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ｃａｐｉｔａｔａ）病株。
１􀆰 ２　 培养基
病原菌活化和对峙培养采用 ＰＤＡ 培养基［１５］；种
子培养基为 ＮＢ 培养基［１６］；液体发酵培养基：牛肉膏
４􀆰 ０ ｇ，葡萄糖 ２􀆰 ５ ｇ，硝酸钠 ２􀆰 ５ ｇ，水 １０００ ｍＬ，初始
ｐＨ值为 ７􀆰 ０；病原菌孢子悬浮液的制备采用 Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ
培养基［１７］。
１􀆰 ３　 Ｂｇ１ 粗蛋白提取
将 Ｂｇ１ 接种于 ＮＢ培养基，２８℃、２００ ｒ·ｍｉｎ － １振荡
培养 ２４ ｈ后，以 ２％的接种量将种子液接种于液体发
酵培养基中，同样条件振荡培养 ７２ ｈ［１４］。 发酵液 ４℃、
８０００ ｒ·ｍｉｎ － １离心 ３０ ｍｉｎ，弃菌体，上清液用 ６０％饱和
度的硫酸铵盐析，４℃放置过夜，４℃、１２０００ ｒ·ｍｉｎ － １离
心 ４０ ｍｉｎ，沉淀溶解在 ０􀆰 ０３ ｍｏｌ·Ｌ － １，ｐＨ值 ７􀆰 ２ 的 ＰＢ
缓冲液［１８］中，装入透析袋，用相同浓度的 ＰＢ缓冲液流
动透析过夜得粗蛋白液。
１􀆰 ４　 粗蛋白稳定性试验
热稳定性测定：粗蛋白液置 ４０、６０、８０、９０、１００℃
水浴处理 ３０ ｍｉｎ和 １１０、１２１℃高压灭菌各处理 １０、２０、
３０ ｍｉｎ 后，以香蕉枯萎病菌为指示菌，采用抑菌圈
法［１９］测定抑菌活性，以室温（２８℃）下放置的粗蛋白液
作对照。
酸碱稳定性测定：用 ＨＣｌ 和 ＮａＯＨ 将粗蛋白液的
ｐＨ值分别调至 ２􀆰 ０、３􀆰 ０、４􀆰 ０、５􀆰 ０、６􀆰 ０、７􀆰 ０、８􀆰 ０、９􀆰 ０、
１０􀆰 ０、１１􀆰 ０，平衡一段时间后测抑菌活性，以不作处理
的粗蛋白液作对照。
存放时间稳定性测定：粗蛋白液存放于 ４℃下，分
别放置 ０、１、３、７、１０、１５、２５、３５、４５、５５ ｄ 后，采用抑菌
圈法测定各处理的抑菌活性，以存放 ０ ｈ 的粗蛋白液
为对照。
蛋白酶稳定性测定：分别将分析纯级蛋白酶 Ｋ、胃
蛋白酶、胰蛋白酶配成浓度为 １０ ｍｇ·ｍＬ － １的水溶液。
取粗蛋白液 ０􀆰 ５ ｍＬ，分别加入 ３ 种酶的水溶液 ５０ μＬ，
摇匀，３７℃水浴 ２ ｈ。 每个处理 ３ 次重复，以不经酶处
理的粗蛋白液为空白对照，抑菌圈法测定各处理样品
的抑菌活性。
１􀆰 ５　 抗菌蛋白的纯化
１􀆰 ５􀆰 １　 ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 离子交换层析分离 　 利
用北京慧德易公司的中高压柱层析系统，纯化过程用
ＱｕｉｋＳｅｐ ＵＶ ５０ 型全波长紫外分光检测器在 ２８０ ｎｍ下
检测。 ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 经沸水浴溶胀 ２ ～ ３ ｈ 后
装柱（２􀆰 ２ × ３０ ｃｍ），用 ０􀆰 ０３ ｍｏｌ·Ｌ － １、ｐＨ值 ７􀆰 ２ 的 ＰＢ
缓冲液充分平衡至 ＯＤ２８０值近于基线，将粗蛋白提取液
上样，依次用含 ０􀆰 １、０􀆰 ３、０􀆰 ５、０􀆰 ７、０􀆰 ９ ｍｏｌ·Ｌ － １ ＮａＣｌ
的 ＰＢ 缓冲液进行线性浓度梯度洗脱，流速为 ０􀆰 ５
ｍＬ·ｍｉｎ － １，分部收集各个洗脱峰。 各洗脱峰样品经冷
冻干燥浓缩后进行抑菌活性检测，有活性的洗脱峰进
行 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ。
１􀆰 ５􀆰 ２ 　 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 凝胶过滤层析分离 　 将
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 装柱（１􀆰 ６ × ６０ ｃｍ）并用 ０􀆰 ０３ ｍｏｌ·Ｌ － １、
ｐＨ值 ７􀆰 ２ 的 ＰＢ缓冲液充分平衡至 ＯＤ２８０值近于基线。
取 ４ ｍＬ经 ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 柱层析后有活性的抗
菌蛋白液上样，用相同缓冲液洗脱，流速为 ０􀆰 ５ ｍＬ·
ｍｉｎ － １，收集洗脱峰，经冷冻干燥浓缩后进行抑菌活性
检测，将有活性的洗脱峰样品于 ４℃保存备用。
１􀆰 ６　 抗菌蛋白浓度的测定
采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法［２０］，将牛血清白蛋白粉末用去离
子水稀释成不同的浓度，分别在 ２８０ ｎｍ波长下测紫外
吸收值。 将所测得的数据在 ｏｒｉｇｉｎＰｒｏ８ 中绘制蛋白的
标准曲线，并进行线性回归得其回归方程为 ｙ ＝
８􀆰 ４６０５ｘ ＋ ０􀆰 ０７４５（Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９１８）。
利用相同的方法依次测定发酵上清液、粗蛋白液、
ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 层析所得到的 Ｐ１ 峰液、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ１００ 层析所得到的 Ｐ１ － １ 峰液中抗菌蛋白的浓度。
１􀆰 ７　 抗菌蛋白抑菌活性测定
将甘蓝枯萎病菌接种于装有 １００ ｍＬ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ 培
养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，２８℃、１８０ ｒ·ｍｉｎ － １恒温振荡
培养 ４ ｄ，菌悬液用双层纱布过滤，滤液 ３０００ ｒ·ｍｉｎ － １
离心 １０ ｍｉｎ［２１］，倒掉上清液，将沉淀的孢子重新用无
菌水配成 １ × １０６ ｃｆｕ·ｍＬ － １的孢子悬浮液。 取 ４ ｍＬ病
原菌的孢子悬浮液加入 ２００ ｍＬ熔化后冷却至 ４５℃左
右的的 ＰＤＡ培养基中，充分混匀后制成带菌平板。 在
带菌平板的左右两侧各打一个直径为 ７ ｍｍ 的孔，依
次加入 ５０ μＬ菌株 Ｂｇ１ 的无菌发酵上清液、粗蛋白液、
Ｐ１ 峰液、Ｐ１ － １ 峰液，前者以无菌的液体发酵培养基
为对照，后三者以灭过菌的 ＰＢ 缓冲液为对照，每个处
理 ３ 次重复，３ ｄ后观察并测量抑菌圈大小。
０３
　 １ 期 类芽孢杆菌 Ｂｇ１ 抗真菌蛋白的分离及其特性分析
１􀆰 ８　 抗菌蛋白纯度和分子量的测定
通过 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ［２２］对粗蛋白液、Ｐ１ 峰液、Ｐ１ － １
峰液进行纯度检测，并与标准蛋白 Ｍａｋｅｒ 比较确定各
蛋白组分的分子量。 分离胶浓度为 １２％ ，浓缩胶浓度
为 ５％ 。 样品在浓缩胶时恒压 １００ Ｖ 电泳，待样品进
入分离胶后，恒压 １５０ Ｖ电泳。 以考马斯亮蓝 Ｇ２５０ 染
色。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 Ｂｇ１ 抗菌蛋白粗提液的稳定性
２􀆰 １􀆰 １　 粗蛋白液对热的稳定性　 经过 １１ 个不同的温
度和时间处理结果表明（表 １），菌株 Ｂｇ１ 的粗蛋白在
２８ ～ １００℃条件下处理 ３０ ｍｉｎ，其抑菌活性与对照比较
在 ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平上均无显著性差异；１１０℃和 １２１℃
处理 １０ ｍｉｎ 其抑菌活性与对照的差异显著，但仅分别
下降了 ２３􀆰 ９４％和 ２９􀆰 ５８％ ，其中 １２１℃处理 １０ ｍｉｎ 的
抑菌圈仍可维持在 １５􀆰 ０ ｍｍ。 由此可见 Ｂｇ１ 的抗菌蛋
白对热具有较好的稳定性，尤其在 １００℃以下抗菌活
性受温度变化的影响不明显。
图 １　 不同 ｐＨ（ａ）和不同存放时间（ｂ）对 Ｂｇ１ 粗蛋白抗菌活性的影响
Ｆｉｇ． １　 Ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｎ Ｂｇ１ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅ（ａ） ａｎｄ ｓｔｏｒｅｄ ｔｉｍｅ（ｂ）
２􀆰 １􀆰 ２　 粗蛋白液对酸碱的稳定性 　 试验结果如
图 １ － Ａ所示，Ｂｇ１ 粗蛋白液在 ｐＨ 值 ７􀆰 ０ 时抑菌活性
最高，抑菌圈直径达最大值 ２１􀆰 ７ ｍｍ；在 ｐＨ 值 ３ ～ ６
时的抑菌圈直径与 ｐＨ 值 ７􀆰 ０ 时无显著性差异，ｐＨ 值
８􀆰 ０ 时则抑菌活性有显著的下降。 此后随着 ｐＨ 值的
升高，抑菌活性逐渐降低，当 ｐＨ值 ＝ １０ 时完全丧失抑
菌活性。 说明菌株的抗菌蛋白在酸性条件下抑菌活性
稳定，而对碱性条件较敏感，过强的碱性会导致其抑菌
活性的丧失。
２􀆰 １􀆰 ３　 粗蛋白液对存放时间的稳定性　 由图 １ － ｂ 可
知，Ｂｇ１ 的粗蛋白液随着存放时间的延长，抑菌活性呈
缓慢的下降趋势，在 ４℃存放 ５５ ｄ时，抑菌圈直径约为
１９ ｍｍ，与对照（存放 ０ ｈ）相比仅降低了 １１􀆰 ２％ ，在 ｐ
＜ ０􀆰 ０５ 水平上差异不显著，说明 Ｂｇ１ 的抗菌蛋白对存
放时间相对稳定，可以在低温下存放较长时间而保持
表 １　 Ｂｇ１ 粗蛋白的热稳定性
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｈｅａｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｎ Ｂｇ１
处理温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ／ ℃
处理时间
Ｔｉｍｅ ／ ｍｉｎ
抑菌直径
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ
ｄｉａｍｅｔｅｒ ／ ｍｍ
活性下降率
ｄｅｓｃｅｎｔ ｒａｔｅ ｏｆ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ／ ％
４０ ３０ ２１． ２ａ ０． ４７
６０ ３０ １９． ３ａ ９． ３９
８０ ３０ １８． ０ａｂ １５． ４９
９０ ３０ １７． ２ａｂ １９． ２５
１００ ３０ １６． ４ａｂ ２３． ００
１１０ １０ １６． ２ｂ ２３． ９４
１１０ ２０ １５． ７ｂ ２６． ２９
１１０ ３０ １５． ３ｂ ２８． １７
１２１ １０ １５． ０ｂ ２９． ５８
１２１ ２０ ０ｃ １００
１２１ ３０ ０ｃ １００
ＣＫ（２８） ３０ ２１． ３ａ ０
　 　 注：抑菌圈直径均值后的小写字母示差异显著性分析结果，具有相
同字母的均值在 ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平上无显著性差异。 下同。
Ｎｏｔｅ： Ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓａｍｅ
ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒ ａｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ
ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ．
１３
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
其抗菌活性。
２􀆰 １􀆰 ４　 粗蛋白对蛋白酶的稳定性　 由表 ２ 可知，抗菌
蛋白粗提物加入蛋白酶 Ｋ、胃蛋白酶、胰蛋白酶后完全
丧失了抑菌活性，说明其对三种蛋白酶敏感。
表 ２　 Ｂｇ１ 粗蛋白液经不同酶处理后的拮抗活性
Ｔａｂｌｅ ２　 Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ
Ｂｇ１ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
蛋白酶 Ｋ
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ
胃蛋白酶
Ｐｅｐｓｉｎ
胰蛋白酶
Ｔｒｙｐｓｉｎ
ＣＫ
抑菌圈直径
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ
Ｄｉａｍｅｔｅｒ ／ ｍｍ
０ｂ ０ｂ ０ｂ ２１􀆰 ０ａ
２􀆰 ２　 抗菌蛋白的纯化
２􀆰 ２􀆰 １　 ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 离子交换层析 　 将 ６０％
硫酸铵沉淀和透析后获得的粗蛋白经 ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ａ５０ 离子交换层析后，共出现 ４ 个洗脱峰（图 ２ － Ａ）。
活性检测结果表明，峰 Ｐ１ 洗脱液的抑菌活性最大，抑
菌圈直径为 １３􀆰 ５ ｍｍ（图 ３ － Ｃ），峰 Ｐ２ 和峰 Ｐ３ 洗脱液
无活性，峰 Ｐ４ 洗脱液的抑制作用较弱。 故确定峰 Ｐ１
为主要活性峰，收集其洗脱液，利用 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 凝
胶过滤层析进一步纯化。
２􀆰 ２􀆰 ２　 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 凝胶过滤层析 　 将 ＤＥＡＥ⁃
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０ 离子交换层析后获得的峰 Ｐ１ 溶液经
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 凝胶过滤层析后，仅出现一个洗脱峰
Ｐ１ － １（图 ２ － Ｂ），活性检测表明该峰溶液具有抑菌活
性，抑菌圈直径为 １０􀆰 １ ｍｍ（图 ３ － Ｄ）。
注：Ａ： ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０ 离子交换层析； Ｂ： Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 凝胶过滤层析
Ｎｏｔｅ： Ａ： ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； Ｂ： Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
图 ２　 Ｂｇ１ 抗菌蛋白层析图谱
Ｆｉｇ． ２　 Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ Ｂｇ１ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
２􀆰 ３　 各步分离样品的抗菌蛋白浓度
利用紫外分光光度计依次测得发酵上清液、粗蛋
白液、Ｐ１ 峰液、Ｐ１ － １ 峰液在 ２８０ ｎｍ 下的吸光值的平
均值分别为 ０􀆰 ９１９６、１􀆰 ６９４８、０􀆰 ６２３６、０􀆰 ３５２１，将其代入
标准曲线方程，依次得蛋白样品的浓度为 ０􀆰 ０９９９
ｍｇ·ｍＬ － １、０􀆰 １９１５ ｍｇ·ｍＬ － １、０􀆰 ０６４９ ｍｇ·ｍＬ － １、０􀆰 ０３２８
ｍｇ·ｍＬ － １。
２􀆰 ４　 不同纯度抗菌蛋白的抑菌活性
由图 ３ 可知，Ｂｇ１ 的蛋白类代谢物对枯萎病的抑
制作用明显，其中发酵上清液和粗蛋白液对枯萎病的
抑菌圈直径分别为 ２２􀆰 ４ ｍｍ和 ２２􀆰 ０ ｍｍ。 粗蛋白液经
ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０ 离子交换层析后得到的 Ｐ１ 峰
蛋白液对枯萎病的抑菌圈直径为 １３􀆰 ５ ｍｍ，Ｐ１ 峰蛋白
液经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 凝胶过滤层析后得到的 Ｐ１ － １ 峰
蛋白液对枯萎病的抑菌圈直径为 １０􀆰 １ ｍｍ。 由 ２􀆰 ３ 中
测的各步样品的蛋白浓度知，随着粗蛋白液、Ｐ１ 峰液、
Ｐ１ － １ 峰液中蛋白浓度的依次降低，其相同体积的样
品对甘蓝枯萎病的抑制作用也呈下降的趋势，说明抗
菌蛋白为菌株 Ｂｇ１ 的主要抗菌物质之一。 但发酵上清
液中蛋白浓度仅约是粗蛋白液中的 ５２％ ，而其抑菌活
性却与粗蛋白液的相当，据此分析发酵上清液中除了
此抗菌蛋白外，还存在其他抑菌活性物质，这与
ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 离子交换层析分离时峰 Ｐ４ 洗脱
液具有较弱的抑制活性相一致。
２􀆰 ５　 Ｂｇ１ 抗菌蛋白的纯度和分子量
将粗蛋白液、 ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０ Ｐ１ 峰、
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ Ｐ１ － １ 峰分别进行 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 检测，由
结果可知，经过三步分离纯化后，得到的 Ｐ１ － １ 峰蛋白
样品为单一条带（图 ４），说明其为单一组分。 经与标
２３
　 １ 期 类芽孢杆菌 Ｂｇ１ 抗真菌蛋白的分离及其特性分析
注：Ａ ～ Ｄ：左孔分别为发酵上清液、粗蛋白液、ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０
　 　 Ｐ１ 峰和 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ Ｐ１ － １ 峰洗脱液，右孔均为对照。
Ｎｏｔｅ： Ａ ～ Ｄ： Ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｗｅｌｌｓ ｏｎ ｅａｃｈ ｐｌａｔｅ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ， ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｔｈｅ ｅｌｕａｔｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ
ｐｅａｋ Ｐ１ ｏｆ ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０ ａｎｄ ｔｈａｔ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｐｅａｋ Ｐ１ －
　 １ ｏｆ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｗｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ．
图 ３　 各纯化阶段的抗菌蛋白对甘蓝枯萎
病菌的抑制活性
Ｆｉｇ． ３　 Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｇａｉｎｓｔ Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔａｇｅｓ
准蛋白比较，可知该抗菌蛋白的表观分子量为 １０ ＫＤ
左右，属于低分子量蛋白。
３　 讨论
近年来，从各种植物的土壤和根际陆续分离发现
了一些类芽孢杆菌新种，如埃吉类芽孢杆菌 （ Ｐ．
ｅｌｇｉｉ）、爱媛类芽孢杆菌（Ｐ． ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ）、解几丁质类芽
孢杆菌 （ Ｐ． ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ）、韩国类芽孢杆菌 （ Ｐ．
ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）及 Ｐ． ｆｒｉｇｏｒｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓ、Ｐ． ｕｌｉｇｉｎｉｓ、Ｐ． ｐｕｒｉｓｐａｔｉｉ
等［２３ － ２７］。 从这些类芽孢杆菌中已分离出了多种抑菌
物质，如吴雪昌等从埃吉类芽孢杆菌 Ｂ６９ 菌株中分离
到了 多 肽 菌 素 Ｐｅｌｇｉｐｅｐｔｉｎｓ 和 聚 酮 类 化 合 物
Ｐａｅｎｉｍａｃｒｏｌｉｄｉｎ 等 多 种 抗 生 素 类 化 合 物， 其 中
Ｐｅｌｇｉｐｅｐｔｉｎｓ对大肠杆菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ）、金黄色葡萄球菌
（ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）、 枯 草 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等细菌和白色念珠菌（Ｃａｎｉｄｉａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、尖孢
镰刀菌、立枯丝核菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）等真菌均有抑
制作用，而 Ｐａｅｎｉｍａｃｒｏｌｉｄｉｎ 主要抑制金黄色葡萄球
菌［１２，２８ － ２９］；Ｍａｒｉａ等［３０］从爱媛类芽孢杆菌、Ａｎｉｌ 等［１３］
从类芽孢杆菌 Ｄ１ 中均分离到了几丁质酶； Ｙｏｕｎｇ
注：Ｍ：蛋白 Ｍａｋｅｒ；１：粗蛋白液；２：ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０ Ｐ１ 峰；
３：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ Ｐ１ － １ 峰。
Ｎｏｔｅ： Ｍ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄｓ； １： ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ； ２： ｐｅａｋ Ｐ１
ｏｆ ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ － ５０； ３： ｐｅａｋ Ｐ１ － １ ｏｆ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００．
图 ４　 Ｂｇ１ 抗菌蛋白各纯化步骤样品的
ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ． ４　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔａｇｅ
等［２６］从韩国类芽孢杆菌中发现了类伊枯草菌素类
（ｉｔｕｒｉｎ⁃ｌｉｋｅ）抗菌化合物，该化合物对立枯丝核菌、尖
孢镰刀菌、炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ． ）、灰葡萄孢
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）等具有较强的抑制作用。 本试验所
研究的类芽孢杆菌 Ｂｇ１ 从 １６ＳｒＤＮＡ 和 ｒｏｐＢ 基因序列
分析结果来看，与埃吉类芽孢杆菌、爱媛类芽孢杆菌亲
缘关系较近，而从生理生化及脂肪酸含量测定结果来
看，与二者均存在较大差异（另文发表）；另外，从抑菌
物质来看，Ｂｇ１ 的主要抗菌物质是蛋白类物质且其不
产几丁质酶，该抗菌蛋白主要对尖孢镰刀菌、赤霉菌
（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）有较强的抑制作用，而对大肠杆
菌无抑制作用［１４］，这与埃吉类芽孢杆菌、爱媛类芽孢
杆菌的抑菌物质存在差异，所以 Ｂｇ１ 很可能是不同于
二者的一个新种，有待于进行种的进一步鉴定。
本研究通过对类芽孢杆菌 Ｂｇ１ 发酵液粗提物的蛋
白酶处理和抑菌活性试验进一步确定了其代谢产物的
主要活性成分为蛋白类物质，稳定性试验表明其抗菌
蛋白具有很好的环境稳定性。 抗菌蛋白经硫酸铵沉
淀、离子交换层析及凝胶过滤层析分离纯化获得了单
一 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ条带的活性组分，并确定了其分子量，为
该菌株后续的理论和应用研究提供了科学依据，在此
基础上进一步鉴定其抗菌蛋白的结构，克隆其编码基
因，通过遗传改造或工程菌株构建，获得适于生产应用
的优良菌株，进而开发高效生防制剂，可为镰刀菌枯萎
３３
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
病的防治提供安全有效的替代和补充产品。
４　 结论
类芽孢杆菌 Ｂｇ１ 抗真菌蛋白的分子量约 １０ｋＤ，在
１００℃以下温度和 ｐＨ值 ３ ～ ７ 的酸性至中性条件下抑
菌活性稳定，表现了良好的应用开发潜能；但其对 ｐＨ
值 ＞ ８ 以上的碱性条件和蛋白酶敏感，在应用中应避
免与此类因子的接触。
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ｎｏｖ． ，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｐａｃｅｃｒａｆｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｅａｎ ｒｏｏｍ［Ｊ］ ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
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Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｆｒｏｍ
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｌｇｉｉ Ｂ６９ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ⁃
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Ｒ，Ｌｉ Ｏ，Ｇａｏ Ｈ． Ｐａｅｎｉｍａｃｒｏｌｉｄｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｆｒｏｍ
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｆ６ － Ｂ７０ ａｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
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［３０］　 Ｐａｇｎｏｎｃｅｌｌｉ Ｍ Ｇ Ｂ，Ａｒａúｊｏ Ｎ Ｋ，Ｓｉｌｖａ Ｎ Ｍ Ｐ，Ａｓｓｉｓ Ｃ Ｆ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ
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Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，５３（６）：１４６１ － １４６８
４３
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
２０１３，２７（１２）：００２９ ～ ００３５
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｂｇ１
ＹＥ Ｈｕｉ⁃ｍｉｎ１，２ 　 ＺＨＡＮＧ Ｄｉａｎ⁃ｐｅｎｇ２ 　 ＬＩＵ Ｘｉａ１ 　 ＹＵ Ｌｉ１ 　 ＬＩＵ Ｗｅｉ⁃ｃｈｅｎｇ２
（ １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈａｎｊｉａｎｇ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　 ５２４０８８； ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ　 １０００９７）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｋｅｙ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｂｇ１ ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｔｈｅ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ Ｂｇ１ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ． Ｔｏ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ａ ｍｅｔｈｏｄ ｂｙ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ． Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｂｇ１ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｈａｋｅ⁃ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ． Ｔｈｅ
ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ６０％ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ （ＮＨ４） ２ＳＯ４ ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ
ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ＤＥＡＥ⁃Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ ｉｏｎ⁃ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ
ｓｔｒａｉｎ Ｂｇ１ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ： ２８℃ ～
１００℃ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ， ４℃ ｆｏｒ ５５ ｄ ａｎｄ ｐＨ ３ ～ ７． Ｂｕｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐＨ >８ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｌｏｓｔ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅａｓｅ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｒｅｅ⁃ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｃｔｉｖｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ １０ ＫＤ ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ． Ｉｔ ｗａｓ
ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｉｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｂｇ１ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ
ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏｗａｒｄｓ ｈｅａｔ， ａｃｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｔｉｍｅ， ａｎｄ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｈｕｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ； Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ； Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ
５３