全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员缘袁圆怨渊怨冤院员远愿苑 耀 员远怨猿允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员源鄄园苑鄄圆源摇 接受日期院圆园员源鄄员员鄄员园
基金项目院国家自然基金青年基金项目渊猿员猿园员苑愿苑冤袁安徽农业大学校级科研项目渊圆园员圆扎则园园远冤
作者简介院杨恩东袁男袁助理实验师袁主要从事分子生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 赠藻凿憎蚤造造岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院同第一作者遥
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员缘冤园怨鄄员远愿苑鄄园苑
小繁缕酵母表达 糟阅晕粤文库的构建及 孕郧
互作蛋白的获得
杨恩东员 摇 牛晓伟圆 摇 王心宇猿
渊员安徽农业大学生命科学学院袁安徽 合肥摇 圆猿园园猿远曰圆浙江省农业科学院蔬菜研究所袁
浙江 杭州摇 猿员园园圆员曰猿南京农业大学生命科学学院袁江苏 南京摇 圆员园园怨缘冤
摘摇 要院植物 原病原菌相互作用过程中袁病原菌的致病因子起着重要作用遥 为了探寻与核盘菌致病因子
多聚半乳糖醛酸酶渊责燥造赠早葬造葬糟贼怎则燥灶葬泽藻袁孕郧冤存在相互作用的基因袁以核盘菌的非特异性寄主 原油菜田间
杂草小繁缕渊杂贼藻造造葬则蚤葬 葬责藻贼葬造葬 哉糟则蚤葬冤为试验材料袁构建了核盘菌诱导的小繁缕酵母表达 糟阅晕粤文库袁经检
测文库满足酵母双杂交的筛选袁进而以 孕郧 蛋白为诱饵对文库进行筛选遥 阳性克隆测序后分析发现共
获得 苑 个基因袁晕悦月陨文库比对后发现同源基因为 源园杂核糖体蛋白尧圆远杂核糖体 砸晕粤基因尧真核生物延伸
因子 耘云 原 员粤尧丙酮酸激酶尧多聚泛素尧葡萄糖磷酸变位酶以及跨膜蛋白的编码基因遥 这些相互作用靶
蛋白的发现为进一步了解和防控核盘菌奠定了基础遥
关键词院油菜曰小繁缕曰多聚半乳糖醛酸酶曰酵母双杂交曰核盘菌曰抗病基因
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员缘郾 园怨援 员远愿苑
摇 摇 核盘菌渊杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂冤是一种重要的植
物病原真菌袁能够侵染 源园园 多种植物袁其中包括大量农
作物袁在发病区常导致粮食和蔬菜严重减产咱员暂 袁由该
菌引起的油菜渊月则葬泽泽蚤糟葬 灶葬责怎泽冤菌核病严重时植株发病
率高达 远园豫 耀愿园豫 袁损失惨重遥 研究表明油菜中核盘
菌的抗源十分稀少袁不同品系间对核盘菌的耐受性有
所差异袁高抗品种未见报道袁化学防治效果也不甚理
想咱圆暂 遥 因此袁分离获得相关抗病基因袁研究核盘菌与
植物的互作关系十分重要遥 核盘菌侵染油菜时主要分
泌多聚半乳糖醛酸酶袁果胶酶咱猿暂 尧角质酶咱源 原 缘暂 尧葡萄糖
淀粉酶咱远暂 尧蛋白酶咱苑暂等遥 已有研究表明多聚半乳糖醛
酸酶渊孕郧冤在核盘菌致病过程中存在着密切的关系咱愿暂 遥
杂澡蚤藻澡等咱怨暂证明在黄曲霉不同类型中袁表达 孕郧 基因的
类群具有很高的毒性袁而不表达 孕郧 基因的类群则不
具致病性遥 匀葬增藻 等咱员园暂证明表达 孕郧 基因的灰霉病菌
的菌株具有很高的致病性袁而 孕郧 突变体虽然能感染
植物袁但丧失了扩增能力遥 在核盘菌侵染寄主的过程
中袁孕郧作为致病因子能够诱导大豆细胞发生程序性死
亡咱员员暂 遥 蕴蚤 等咱员圆暂证实在众多的 孕郧中袁被命名为 泽泽责早员凿
的 孕郧在核盘菌侵染初期大量表达并在致病过程中发
挥的重要作用遥 宰葬灶早 等咱员猿暂利用 孕郧 做为诱饵蛋白筛
选到了 员 个含有 悦圆 结构域的功能蛋白袁并将其命名为
陨孕郧 原 员袁且该蛋白受核盘菌诱导后高表达遥 随后又发
现该蛋白在细胞中的定位受钙离子信号调节袁陨孕郧 原 员
与 孕郧的相互作用可能在核盘菌侵染过程的信号传导
中起重要作用咱员源暂 遥 由于目前油菜抗病育种研究只是
发现了一些感病相对轻的或避病资源袁并通过杂交获
得了一些耐菌核病品种袁尚未发现免疫或完全抗病品
种咱员缘暂 遥 因此袁难以从中获得抗病基因遥
小繁缕渊杂贼藻造造葬则蚤葬 葬责藻贼葬造葬 哉糟则蚤葬冤袁又称无瓣繁缕袁属
石竹科繁缕属袁学术界一直把它作为繁缕的一个变种
或亚种袁积累的资料并不多袁是油菜田地里的一种常见
杂草咱员远暂 袁田间和实验发现它对核盘菌免疫袁因而属于
非特异性宿主关系袁可作为核盘菌的天然抗性资源遥
本研究前期采用同源克隆的方法获得了核盘菌的
孕郧基因袁在此基础上袁构建了核盘菌诱导后的小繁缕
酵母表达文库袁采用酵母双杂交技术经过筛选后获得
苑 个与 孕郧存在相互作用的蛋白袁并对其功能进行了讨
苑愿远员
核摇 农摇 学摇 报 圆怨 卷
论袁以期为从核盘菌天然抗性资源中获得抗性基因奠
定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 试验材料与试剂
员郾 员郾 员摇 植物材料摇 小繁缕种子由江苏省农业科学院
经济作物研究所提供袁种于南京农业大学农学院棉花
研究所日光室遥
员郾 员郾 圆摇 菌株和载体摇 大肠杆菌渊耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤冤菌株
阅匀员园月为中国科学院遗传与发育研究所提供袁核盘菌
由南京农业大学植保所惠赠曰责郧粤阅栽苑砸藻糟袁责郧月运栽苑 购
自宝生物工程 渊大连冤有限公司袁 栽鄄藻葬泽赠 载体购自
孕则燥皂藻早葬 公司渊中国北京冤遥
员郾 员郾 猿摇 主要试剂 摇 栽源 连接酶尧阅晕粤 聚合酶尧各种限
制性内切酶袁凿晕栽孕袁酝粤栽悦匀酝粤运耘砸 郧粤蕴源 栽憎燥鄄匀赠遭则蚤凿
杂赠泽贼藻皂 猿驭 蕴蚤遭则葬则蚤藻泽 等均购自 栽葬运葬砸葬 生物工程公司
渊中国大连冤袁砸晕粤 提取试剂 栽则蚤扎燥造 购自 陨灶增蚤贼则燥早藻灶渊上
海冤公司袁胶回收试剂盒购自博大泰克公司渊中国北
京冤袁其余试剂为国产或进口分析纯遥 所用引物合成
及测序均由 陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司渊中国上海冤完成遥
员郾 圆摇 试验方法
员郾 圆郾 员摇 核盘菌的培养基及其 砸晕粤的提取摇 核盘菌用
马铃薯蔗糖液体培养基渊蔗糖 圆园早窑蕴 原员袁马铃薯 圆园园
早窑蕴 原员冤培养 员 周后过滤收集菌丝袁菌丝液氮研磨后袁
参照 栽则蚤扎燥造说明书提取核盘菌 砸晕粤遥
员郾 圆郾 圆摇 小繁缕总 砸晕粤的提取摇 在小繁缕长到 圆 个月
时接种核盘菌袁并保湿 猿凿 后取叶片及茎液氮冻存袁采
用 悦栽粤月 原 酸酚法咱员苑暂 袁提取总 砸晕粤袁 阅晕葬泽藻 陨 消化
阅晕粤遥
员郾 圆郾 猿摇 孕郧基因的克隆及 孕郧鄄责 郧月运栽苑 诱饵载体的构
建摇 将培养好的核盘菌菌液过滤收集菌丝袁液氮研磨
后尧用 栽则蚤扎燥造渊购自 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司冤方法提取 砸晕粤袁反
转录后以 糟阅晕粤 为模板袁用引物 蕴圆怨园源园 原 云院 缘忆 原
糟糟葬贼葬糟贼早贼糟贼葬早贼葬糟葬贼贼糟葬糟 原 猿忆尧 蕴圆怨园源园 原 砸院 缘忆 原
贼糟糟葬早贼早糟贼贼早葬葬葬早贼葬早糟糟早葬 原 猿忆扩增 孕郧基因袁测序比对无误
后设计引物 缘忆 原 糟贼糟贼悦粤栽粤栽郧早贼贼糟葬糟葬贼贼糟贼贼贼糟糟贼糟早早糟糟 原 猿忆和
缘忆 原 糟贼糟贼悦栽郧悦粤郧贼贼葬葬糟葬糟贼贼早葬糟葬糟糟葬早葬贼早早 原 猿忆袁分别引入
晕凿藻 陨 和 孕泽贼 陨 酶切位点袁采用限制性内切酶 晕凿藻 陨 和
孕泽贼 陨双酶切 孕悦砸产物和空载体 责 郧月运栽苑袁将 孕郧 基因
的 韵砸云克隆到酵母表达载体 孕郧月运栽苑 的 晕凿藻 陨 和 孕泽贼
陨 位点之间袁构建诱饵载体 孕郧鄄 责 郧月运栽苑咱员猿暂 遥
员郾 圆郾 源摇 核盘菌诱导小繁缕 糟阅晕粤 的构建 摇 酵母双杂
交文库的构建及筛选均完全按照 酝粤栽悦匀酝粤运耘砸
郧粤蕴源 栽憎燥鄄匀赠遭则蚤凿 杂赠泽贼藻皂 猿驭 蕴蚤遭则葬则蚤藻泽 说明书进行曰
糟阅晕粤合成采用 杂酝粤砸栽渊泽憎蚤贼糟澡蚤灶早 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 葬贼 缘忆 藻灶凿
燥枣 砸晕粤 贼则葬灶泽糟则蚤责贼冤技术袁引物用 韵造蚤早燥 凿 栽遥 随后袁长距
离 孕悦砸渊蕴阅 孕悦砸冤法合成双链 阅晕粤袁将 孕悦砸 仪预热到
怨缘益曰准备 圆 个反应体系袁员 个为样品袁员 个为对照袁反
应体系如下院云蚤则泽贼鄄杂贼则葬灶凿 糟阅晕粤 圆滋蕴尧员园 伊 月阅 粤凿增葬灶贼葬早藻
圆 孕悦砸 月怎枣枣藻则员园滋蕴尧缘园 伊 凿晕栽孕 酝蚤曾 圆滋蕴尧缘忆 孕悦砸 孕则蚤皂藻则
圆滋蕴尧猿忆 孕悦砸 孕则蚤皂藻 圆滋蕴尧员园 伊 郧悦鄄酝藻造贼 溶液 员园滋蕴尧缘园 伊
月阅 粤凿增葬灶贼葬早藻 圆 孕燥造赠皂藻则葬泽藻 酝蚤曾 圆滋蕴尧加去离子水总体
积 员园园滋蕴曰扩增条件为院怨缘益 预变性 远园 泽曰怨缘益 变性
圆园泽尧远愿益 退火延伸 远皂蚤灶袁圆缘 个循环曰远愿益 延伸 缘皂蚤灶遥
取 苑郾 园滋蕴 孕悦砸 反应产物袁用 员郾 圆豫琼脂糖凝胶电泳鉴
定质量曰样品按照说明书中的步骤纯化后备用遥 随后袁
将文库双链 糟阅晕粤 和载体 责郧粤阅栽苑 原 砸藻糟 共转化到酵
母菌株 粤匀员园怨 中袁并在 杂阅 辕 原 蕴藻怎平板上筛选转化子尧
经富集尧每管 员皂蕴 分装后保存于 原 愿园益冰箱袁便得到
了酵母双杂交 糟阅晕粤文库遥
员郾 圆郾 缘摇 文库滴度及插入片段大小检测摇 为计算文库
滴度袁分别按 员 辕 员园袁员 辕 员园园袁员 辕 员 园园园袁员 辕 员园 园园园 比例稀释
后将 员园园滋蕴菌液涂布到 杂阅 辕 原 蕴藻怎渊员园园皂皂冤平板上袁
猿园益倒置培养 圆 耀 猿凿 后袁计算库容大小曰随机挑取 缘园
个单菌落袁用载体引物 粤阅鄄陨灶泽藻则贼 杂糟则藻藻灶蚤灶早 粤皂责造蚤皂藻则
杂藻贼菌落 孕悦砸法检测文库插入片段的大小遥
员郾 圆郾 远摇 孕郧互作蛋白的筛选摇 将已经构建好的诱饵载
体 孕郧鄄责 孕郧月运栽苑 转化酵母菌株 再员愿苑 后按照试剂盒说
明书进行双杂交筛选袁并计算杂交效率遥 阳性克隆用
天为时代酵母质粒小量提取试剂盒提取质粒后袁热激
法转化 阅匀员园月袁孕悦砸鉴定后送上海英俊博亚生物工程
公司测序遥
员郾 圆郾 苑摇 序列分析摇 相似性比较用 阅晕粤酝粤晕分析或在
晕悦月陨 站点上用 月蕴粤杂栽 完成袁开放阅读框渊 韵砸云冤在
晕悦月陨站点上用 韵砸云 枣蚤灶凿藻则进行分析遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 多聚半乳糖醛酸酶基因 孕郧 的克隆及诱饵载体
孕郧鄄责 郧月运栽苑 的构建
以核盘菌总 砸晕粤 为模板袁燥造蚤早燥渊凿栽冤员缘 为引物反
转录合成 糟阅晕粤遥 以 糟阅晕粤 为模板进行 孕悦砸 扩增袁得
到目的条带袁大小约为 员郾 员噪遭渊图 员冤袁与已知核盘菌
孕郧基因 杂泽责早员凿渊晕悦月陨编号院粤云缘园员猿园苑冤的 糟阅晕粤 全长
吻合袁测序证实为目的基因遥 随后将其克隆到载体
责郧月运栽苑 上袁形成诱饵载体 孕郧鄄责 郧月运栽苑遥
愿愿远员
摇 怨 期 小繁缕酵母表达 糟阅晕粤文库的构建及 孕郧互作蛋白的获得
注院酝院阅晕粤 皂葬噪藻则 阅蕴圆园园园遥 员院孕悦砸产物 孕郧遥
晕燥贼藻院 酝院阅晕粤 皂葬噪藻则 阅蕴圆园园园 郾 员院孕悦砸 责则燥凿怎糟贼 燥枣 孕郧援
图 员摇 核盘菌 糟阅晕粤 的 砸栽鄄孕悦砸电泳结果
云蚤早援 员摇 粤早葬则燥泽藻 早藻造 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽藻泽 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 砸栽鄄孕悦砸
责则燥凿怎糟贼泽 燥枣 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂 燥枣 糟阅晕粤
圆郾 圆摇 小繁缕总 砸晕粤提取结果
用核盘菌接种小繁缕茎尧叶部位袁分别取诱导第
猿尧源尧缘 天植株茎叶袁混合后采用 悦栽粤月 原酸酚法提取总
砸晕粤袁随后用 阅晕葬泽藻 陨 除去 砸晕粤 中的 阅晕粤袁取 员滋蕴 总
砸晕粤溶液与 员园滋蕴变性加样 月怎枣枣藻则混合袁在 员郾 圆豫的非
变性琼脂糖凝胶上电泳分析渊图 圆冤袁圆愿杂 则砸晕粤 和 员愿杂
则砸晕粤条带清晰袁亮度比接近圆颐 员袁用 月耘悦运酝粤晕 阅哉 原
远源园 核酸 原蛋白分析仪渊贝克曼库尔特有限公司袁美
国冤测定 韵阅圆远园尧韵阅圆愿园吸光度袁韵阅圆愿园 辕 韵阅圆远园值在 员郾 愿 耀圆郾 员 之间袁这表明该方法提取的 砸晕粤 纯度较高袁砸晕粤
没有降解袁比较完整遥
图 圆摇 小繁缕受核盘菌诱导的总 砸晕粤电泳图
云蚤早援 圆摇 郧藻造 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 燥枣 贼燥贼葬造 砸晕粤 蚤泽燥造葬贼藻凿 枣则燥皂
杂贼藻造造葬则蚤葬 粤责藻贼葬造葬 哉糟则蚤葬 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂
圆郾 猿摇 核盘菌诱导的小繁缕 糟阅晕粤文库的构建
将总 砸晕粤逆转录为第一链 糟阅晕粤袁通过长距离 孕悦砸
渊蕴阅鄄孕悦砸冤扩增出双链 糟阅晕粤渊凿泽 糟阅晕粤冤袁电泳结果显示
糟阅晕粤片段在 园郾 圆 耀圆噪遭之间袁可以用于建库渊图 猿冤遥
注院凿泽 糟阅晕粤院双链 糟 阅晕粤曰酝院阅晕粤 皂葬噪藻则 阅蕴圆园园园遥
晕燥贼藻院凿泽 糟阅晕粤院阅燥怎遭造藻 泽贼则葬灶凿 阅晕粤援 酝院阅晕粤 皂葬噪藻则 阅蕴圆园园园援
图 猿摇 小繁缕受核盘菌诱导的混合 凿泽 糟 阅晕粤电泳图
云蚤早援 猿摇 郧藻造 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 燥枣 凿泽 糟阅晕粤 燥枣 杂贼藻造造葬则蚤葬
葬责藻贼葬造葬 哉糟则蚤葬 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂
运用 杂酝粤砸栽 技术袁将 凿泽 糟阅晕粤 及线性载体
责郧粤阅栽苑 原 砸藻糟共转化酵母菌株 粤匀员园怨 后袁凿泽 糟阅晕粤与
线性载体 责郧粤阅栽苑 原 砸藻糟 发生同源重组袁形成环状载
体袁即在酵母中构建成 糟阅晕粤表达文库遥
圆郾 源摇 文库插入片段的大小和转化效率检测
参照文库构建试剂盒说明书测定原始文库滴度为
源郾 员源 伊 员园愿责枣怎窑 皂蕴 原员袁重组率为 怨远豫 袁利用载体引物
渊粤阅 缘忆 孕则蚤皂藻则院 缘忆鄄悦栽粤栽栽悦郧粤栽郧粤栽郧粤粤郧粤栽粤悦悦悦悦粤
悦悦粤粤粤悦悦悦 原猿忆曰粤阅 猿忆 孕则蚤皂藻则院 缘忆鄄郧栽郧粤粤悦栽栽郧悦郧郧郧
郧栽栽栽栽栽悦粤郧栽粤栽悦栽粤悦郧粤栽 原 猿忆冤进行 孕悦砸扩增袁产物取
员园滋蕴电泳检测发现袁插入片段大小主要分布在 苑缘园 耀
员 缘园园 遭责渊图 源冤遥
分别将菌液按 员园 倍尧员园园 倍尧员 园园园 倍尧员园 园园园 倍尧
员园园 园园园 倍尧员 辕 员园尧员 辕 员园园尧员 辕 员 园园园 稀释涂布后计数菌
落袁统计后得转化效率为 员郾 缘 伊 员园远 辕 猿 滋早 责郧粤阅栽苑 原
砸藻糟载体袁大于 员郾 园 伊 员园远 辕 猿 滋早 责郧粤阅栽苑 原 砸藻糟 载体袁符
合试剂盒要求遥
圆郾 缘摇 诱饵 孕郧对小繁缕 糟阅晕粤 文库的筛选及相互作
用靶蛋白的获得
按照试剂盒说明书袁将 孕郧鄄责郧月运栽苑 转化酵母菌株
再员愿苑袁糟阅晕粤文库已转化到酵母 粤匀员园怨 菌株中遥 利用
酵母菌株 再员愿苑 与 粤匀员园怨 交配渊酝葬贼蚤灶早冤方法筛选小繁
缕 糟阅晕粤文库袁杂交菌液渊图 缘冤第 员 轮筛选在三缺培
养基 杂阅 辕 原 匀蚤泽 辕 原 蕴藻怎 辕 原 栽则责上进行袁筛选到的阳性克
隆在涂有 载 原 琢 原 郧葬造的四缺培养基 杂阅 辕 原 粤凿藻 辕 原 匀蚤泽 辕
原 蕴藻怎 辕 原 栽则责上划线进一步确认是否为真正的阳性克
隆遥 经过上述严格筛选袁最后筛选到 圆园 多个阳性克
隆袁测序后剔除相同的基因袁共获得 苑 个不同基因渊表
员冤遥 其中袁源园杂核糖体蛋白和 圆远杂核糖体 砸晕粤基因分
怨愿远员
核摇 农摇 学摇 报 圆怨 卷
注院员 耀 缘园院阳性克隆遥
晕燥贼藻院 员 贼燥 缘园院孕燥泽蚤贼蚤遭藻 糟燥造燥灶蚤藻泽援 酝院 阅晕粤 皂葬噪藻则 阅蕴圆园园园援
图 源摇 文库插入片段鉴定
云蚤早援 源摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 造藻灶早贼澡 燥枣 贼澡藻 蚤灶泽藻则贼藻凿 枣则葬早皂藻灶贼泽 蚤灶 贼澡藻 糟 阅晕粤 造蚤遭则葬则赠
表 员摇 通过酵母双杂交筛选小繁缕文库所得克隆的推测功能
栽葬遭造藻 员摇 郧藻灶藻泽 泽糟则藻藻灶藻凿 遭赠 赠藻葬泽贼 贼憎燥鄄澡赠遭则蚤凿 葬灶凿 贼澡藻蚤则 责怎贼葬贼蚤增藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶泽
序号
晕燥援
序列长度
杂藻择怎藻灶糟藻 造藻灶早贼澡 辕 遭责
同源基因
匀燥皂燥造燥早燥怎泽 早藻灶藻
同源性
陨凿藻灶贼蚤贼赠 辕 豫
员 猿员怨 源园杂核糖体蛋白 源园杂 则蚤遭燥泽燥皂葬造 责则燥贼藻蚤灶渊源冤 怨圆
圆 猿猿缘 耀 源员猿 圆远杂核糖体 砸晕粤基因 圆远杂 则蚤遭燥泽燥皂葬造 砸晕粤 早藻灶藻渊员园冤 怨怨
猿 远员园 真核生物延伸因子 耘怎噪葬则赠燥贼蚤糟 藻造燥灶早葬贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则 员粤渊藻耘云员粤冤 愿苑
源 缘源远 丙酮酸激酶 孕增则怎增葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 愿员
缘 源源员 多聚泛素 孕燥造赠怎遭蚤择怎蚤贼蚤灶 愿苑
远 远远园 耀 苑愿远 磷酸葡萄糖变位酶 孕澡燥泽责澡燥早造怎糟燥皂怎贼葬泽藻 渊猿冤 愿缘
苑 员 猿源员 跨膜蛋白 栽则葬灶泽皂藻皂遭则葬灶藻 责则燥贼藻蚤灶 苑圆
摇 摇 注院括号中数字为双杂交筛选所得克隆的数目遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 灶怎皂遭藻则 蚤灶 遭则葬糟噪藻贼 则藻责则藻泽藻灶贼泽 则藻责藻葬贼 贼蚤皂藻泽 燥枣 泽葬皂藻 早藻灶藻泽 泽糟则藻藻灶藻凿 遭赠 再圆匀援
注院箭头表示典型的合子袁其为三耳突状袁分别代表 圆 个母细胞
和 员 个子细胞遥
晕燥贼藻院 粤则则燥憎 责燥蚤灶贼 贼燥 葬 扎赠早燥贼藻 贼赠责蚤糟葬造造赠袁 憎澡蚤糟澡 蚤泽 澡葬泽贼澡则藻藻鄄造燥遭藻凿 泽澡葬责藻袁 贼澡藻 造燥遭藻泽
则藻责则藻泽藻灶贼蚤灶早 贼澡藻 贼憎燥 澡葬责造燥蚤凿渊责葬则藻灶贼葬造冤糟藻造造泽 葬灶凿 贼澡藻 遭怎凿凿蚤灶早 凿蚤责造燥蚤凿 糟藻造造泽援
图 缘摇 双杂交结果观察
云蚤早援 缘摇 砸藻泽怎造贼 燥枣 贼澡藻 赠藻葬泽贼 皂葬贼蚤灶早
别有 源 个和 员园 个克隆袁葡萄糖磷酸变位酶有 猿 个克
隆袁真核生物延伸因子渊藻耘云员 粤冤尧丙酮酸激酶尧多聚泛
素和跨膜蛋白各有 员 个克隆遥
猿摇 讨论
已有的研究表明袁核盘菌和寄主互作时核盘菌分
泌多聚半乳糖醛酸酶渊责燥造赠早葬造葬糟贼怎则燥灶葬泽藻袁孕郧冤尧纤维素
酶渊 糟藻造造怎造葬泽藻冤尧半纤维素酶 渊 澡藻皂蚤糟藻造造怎造葬泽藻泽冤尧果胶酶
渊责藻糟贼蚤灶藻泽贼藻则葬泽藻冤等降解植物细胞壁的酶来加速侵
染咱员愿 原 圆园暂 遥 其中袁孕郧 具有重要的功能遥 因此袁寻找与
孕郧存在相互作用的蛋白有着重要的意义遥 前期袁
宰葬灶早等咱员猿暂筛选获得油菜中与 孕郧 存在互作的蛋白
陨孕郧 原 员袁为防控菌核病奠定了一定的基础遥 本研究以
核盘菌的非特异性寄主小繁缕为材料袁通过酵母双杂
交的方法筛选到了 圆员 个阳性克隆袁测序比对后发现分
属 苑 类不同基因编码的蛋白袁分别是 源园杂核糖体蛋白尧
园怨远员
摇 怨 期 小繁缕酵母表达 糟阅晕粤文库的构建及 孕郧互作蛋白的获得
圆远杂核糖体 砸晕粤基因尧真核生物延伸因子 耘云员 粤尧丙酮
酸激酶尧多聚泛素尧葡萄糖磷酸变位酶尧跨膜蛋白遥
已有研究证实核糖体蛋白除了参与蛋白质的合成
外袁还有许多核糖体外功能袁例如参与自体翻译调控尧
正常细胞的恶性转化尧发育调控尧砸晕粤 的加工咱圆员 原 圆圆暂 袁
张月娟等咱圆猿暂利用酵母双杂交筛选与无毒蛋白 粤增则孕贼燥尧
粤增则孕贼燥月互作的基因袁阳性克隆测序比对后发现与番茄
圆缘杂 则蚤遭燥泽燥皂葬造 砸晕粤 早藻灶藻同源性达 怨怨豫 袁本研究也筛选
到核糖体蛋白袁这与李杰等咱圆源暂的研究相对应袁推测该
基因参与蛋白质合成及对致病因子 孕郧 的识别遥 泛素
渊怎遭蚤择怎蚤贼蚤灶冤是由 苑远 个氨基酸组成的短肽袁非常保守地
存在于所有真核生物中咱圆缘暂 袁其主要的功能是选择性降
解蛋白质袁通过对蛋白表达水平的调控来实现对细胞
生物功能的调控遥 李星等咱圆远暂构建了叶锈菌诱导的小
麦叶片抑制差减杂交文库并分析发现获得抗病相关基
因袁其中就包括多聚泛素基因遥 本研究筛选获得了含
有 源源员 个碱基的多聚泛素基因袁推测可能是识别 孕郧
为外源蛋白后将其降解袁并在小繁缕抵抗核盘菌侵染
过程中起着作用遥 丙酮酸激酶是葡萄糖代谢途径的一
个调控酶袁除了普遍地参与细胞的能量代谢外袁丙酮酸
激酶也可以被一些生物和非生物刺激所诱导遥 据报
道袁栽酝灾尧伤害胁迫尧晕葬悦造尧水杨酸尧茉莉酸甲酯可以诱
导辣椒胞浆的丙酮酸激酶 悦葬孕运渊糟冤员 的表达咱圆苑暂 遥 杨
金丽等咱圆愿暂利用酵母双杂交系统研究发现丙酮酸激酶
和壳寡糖诱导的 杂藻则 辕 栽澡则 蛋白激酶 渊 燥造蚤早燥糟澡蚤贼燥泽葬灶
蚤灶凿怎糟藻凿 责则燥贼藻蚤灶 噪蚤灶葬泽藻袁韵陨孕运冤存在相互作用袁而后者在
壳聚糖诱导的烟草抗性反应中起着重要作用遥 丙酮酸
激酶可以被 栽酝灾尧伤害胁迫和一些植物激素及核盘菌
诱导袁预示这个蛋白可能参与了植物对逆境胁迫的诱
导反应遥 藻耘云员粤除了在植物蛋白质合成延伸过程中充
当主要的翻译因子外袁还参与同翻译控制有关的信号
传导尧细胞生长尧应激反应及与运动性有关的信号传
导袁并且与细胞凋亡等有关咱圆怨 原 猿园暂 袁本研究筛选获得的
藻耘云员粤袁推测可能是参与相关防御基因的表达调控遥
磷酸葡萄糖变位酶由 孕郧酝 渊责澡燥泽责澡燥早造怎糟燥皂怎贼葬泽藻冤
基因编码袁在糖酵解过程中催化 员 原磷酸葡萄糖和 远 原
磷酸葡萄糖的可逆转化袁其氨基酸序列在大肠杆菌袁醋
菌属尧酵母及兔子和人等不同物种中高度保守遥 大肠
杆菌和兔子的 孕郧酝几乎有着相同的分子量袁在活性位
点有着近乎相同的氨基酸序列和相同的活性需求遥
孕郧酝基因缺陷型菌株对 杂阅杂 原阴离子去污剂渊蕴月 中
加 员豫 杂阅杂冤敏感袁说明在生物对抗外界有毒物质如离
子去污剂时细胞膜外复合物的生物合成作用必不可
少咱猿员暂 袁沈晴等咱猿圆暂研究证明在水稻中磷酸葡萄糖变位
酶 孕郧酝受水稻白叶纹枯病菌 孕载韵怨怨 菌株诱导遥 本研
究筛选获得的 孕郧酝袁可能在应对病菌侵染等逆境下细
胞膜外复合物的生物合成中起作用遥 跨膜蛋白与信号
转导有着密切的关系袁其中有很多受体本身就是膜蛋
白袁起到参与细胞膜内外物质尧能量交换袁构成各种离
子跨膜的通道以及构成呼吸链和转运蛋白等作用咱猿猿暂 遥
本研究筛选获得的跨膜蛋白袁可能是在核盘菌侵染过
程中将细胞外信号转化为细胞内信号袁而启动防御反
应遥 总之袁小繁缕对核盘菌产生非寄主抗性主要是通
过及时识别细胞外信号袁改变相关基因表达尧蛋白质合
成和生物膜修复方式起作用遥 有关靶基因的具体功能
及它们与 孕郧的互作关系有待于进一步研究遥
源摇 结论
本研究以核盘菌致病因子 孕郧 蛋白为诱饵袁采用
酵母双杂交方法袁首次从核盘菌诱导后的非特异性寄
主小繁缕中进行了筛选袁获得了 苑 个与核盘菌致病因
子 孕郧存在互作的蛋白袁推测它们分别通过参与信号
识别袁调控相关基因表达等方式抵抗核盘菌侵染遥 这
为进一步研究核盘菌侵染植物过程和防控油菜菌核病
奠定了基础遥
参考文献院
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库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定 咱允暂 援 作物学
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咱员远暂 摇 张守栋袁顾德兴援 繁缕和无瓣繁缕作为资源植物的研究 咱允暂 援 杂
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咱圆员暂摇 田媛袁张俊平援 核糖体蛋白质的新功能及其与相关疾病的关系
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咱圆猿暂摇 张月娟袁赵廷昌袁杨玉文援 利用酵母双杂交系统筛选感病番茄中
蔬四号与无毒蛋白 粤增则孕贼燥尧粤增则孕贼燥月 互作的蛋白 咱 允暂 援 中国农业
科学袁圆园员员袁源源渊圆猿冤院源怨猿怨 原 源怨源源
咱圆源暂摇 李杰袁闫秀英袁丁燏袁吴灶袁简纪常袁谢吉国援 利用酵母双杂交系
统筛选草鱼呼肠孤病毒 晕杂猿愿 相互作用蛋白 咱允暂 援 海洋与湖沼袁
圆园员猿袁源源渊圆冤院猿园缘 原 猿园怨
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咱圆远暂摇 李星袁于秀梅袁李亚宁袁张立荣袁刘大群袁杨文香袁张汀援 叶锈菌诱
导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析 咱允暂 援 中国农业
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咱圆愿暂摇 杨金丽袁赵小明袁尹恒袁张洪艳袁杜昱光援 酵母双杂交筛选 韵陨孕运
相互作用蛋白 咱允暂 援 应用与环境生物学报袁圆园员园袁员远渊源冤院源苑源 原
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咱圆怨暂摇 周冰袁曹诚袁刘传援 翻译延伸因子 员粤的研究进展 咱允暂 援 生物技术
通讯袁圆园园苑袁员愿渊圆冤院圆愿员 原 圆愿源
咱猿园暂摇 覃迎姿袁黄先益袁叶兴枝袁王爱勤袁李杨瑞援 植物延伸因子 藻耘云员粤
研究进展 咱允暂 援 广西农业科学袁圆园园怨袁源园渊缘冤院源苑圆 原 源苑苑
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咱猿圆暂摇 沈晴援 水稻白叶枯病菌受寄主诱导表达基因的鉴定及致病功能
研究 咱阅暂援 南京院南京农业大学袁圆园员员
咱猿猿暂摇 宋江华袁张立新援 植物跨膜蛋白研究进展 咱 允暂 援 生物学杂志袁
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