全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032248204
春石斛兰类原球茎分化过程中抗氧化酶活性和
可溶性蛋白的变化
侯大强　柴明良　庄晓英
(浙江大学园艺系Π农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :以春石斛兰 ( Dendrobium nobile Sw. )为试材 ,研究了类原球茎在分化芽和根系发生过程中抗氧化
酶系统中多种酶活性及可溶性蛋白的变化规律。结果表明 ,在分化过程中抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 、
愈创木酚过氧化物酶 (POD) 、多酚氧化酶 (PPO)和过氧化氢酶 (CAT) 的活性和可溶性蛋白含量均呈现先
降后升的趋势 ;超氧化物歧化酶 (SOD) 活性则呈现先升后降的变化。对过氧化物酶同工酶和可溶性蛋
白进行 SDS2PAGE电泳发现 ,在分化过程中均有新谱带的产生或原有谱带的消失。
关键词 :春石斛兰 ( Dendrobium nobile Sw. )类原球茎 ;分化 ;抗氧化酶 ;可溶性蛋白 ;同工酶
THE CHANGES OF ANTIOXIDANT ENZYME ACTIVITIES AND SOLUBLEPROTEINS DURING
DIFFERENTIATION OF SHOOTS AND ROOTS FROM PROTOCORM2LIKE BODIES ( PLBs)
IN Dendrobium nobile in vitro
HOU Da2qiang 　CHAI Ming2liang 　ZHUANG Xiao2ying
( Department of Horticulture , Zhejiang UniversityΠThe Key Laboratory of Horticultural Plant Growth ,
Development and Biotechnology , Ministry of Agriculture , Hangzhou , Zhejiang 　310029)
Abstract :The changes of antioxidant enzyme activities and soluble proteins during the differentiation of shoots and roots from
PLBs in Dendrobium nobile Sw. in vitro were systematically investigated. The results indicated that the activities of ascorbic
peroxidase (APX) , guaiacol peroxidase ( POD) , polyphenol oxidase ( PPO) , catalyse ( CAT) and the contents of soluble
proteins were decreased and then increased ; and the activity of superoxide dismutase ( SOD) was increased and then
decreased. The formation of new bands and the disappearance of the original bands in peroxidase isozymes and soluble proteins
during differentiation were also detected by using SDS2PAGE electrophoresis analysis.
Key words :protocorm2like bodies ( PLBs) of Dendrobium nobile Sw. ; differentiation ; antioxidant enzyme ; soluble protein ;
isozyme
收稿日期 :2005208211
作者简介 :侯大强 (19792) ,男 ,山东青岛人 ,在读研究生 ,研究方向为观赏植物生物技术。柴明良为通讯作者 ,Tel : 0571 86971036 ; Email : mlchai @
zju. edu. cn
　　植物体内具有完善的抗氧化防御系统 ,由抗氧化
酶和抗氧化剂组成。许多重要的植物生理生化过程是
在活性氧的参与下完成的 ,活性氧的产生对植物细胞
既有消极伤害的一面 ,也有积极有益的一面。在离体
培养过程中 ,自 Galston 等[1 ] 1969 年最早研究烟草髓部
愈伤组织的分化与过氧化物同工酶的关系以来 ,人们
在这一领域进行了许多研究 ,发现外植体的生长、脱分
化、分化与过氧化物酶活性、可溶性蛋白含量及其同工
酶等的变化有关[2～5 ] 。但未见在兰花类原球茎 ( PLBs)
分化芽和根的过程中有上述研究内容的报道。本试验
研究了春石斛兰类原球茎分化芽和根系过程中抗坏血
酸过氧化物酶 (APX) 、愈创木酚过氧化物酶 ( POD) 、超
氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT)和多酚氧化酶
(PPO)活性以及可溶性蛋白含量的变化 ,并对可溶性
蛋白和过氧化物酶同工酶进行了 SDS2PAGE 电泳 ,以
探讨抗氧化系统若干酶及可溶性蛋白质在 PLBs 分化
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芽和根系过程中的变化规律和可能的作用机理 ,为外
源调控类原球茎的生长或分化提供基础资料。
1 　材料与方法
111 　材料
以试管中不同分化期的春石斛兰 ( Dendrobium
nobile Sw . )为试材 ,即选取在添加 10 gΠL 蔗糖的 MS 培
养基上的类原球茎及高度分别为 012、015、112、112 (显
微镜下有根分化) 和 115 cm(具明显根) 的嫩芽或幼苗
为材料。
112 　方法
11211 　抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量及 PPO 活性的
测定 　取上述 6 个不同时期的离体材料 ,立即称取 013
g(鲜重)为 1 个处理 ,经液氮处理后加入 50 mmolΠL 的
磷酸缓冲液 (pH = 718 ,含 012 molΠL EDTA 和 2 %的
PVP) 3 mL ,于预冷研钵中冰浴下研磨成匀浆 ,4 ℃下
12000 rpm 离心 20 min ,上清液即为提取液 ,用于下列
各种酶活性及可溶性蛋白含量的测定 ,每处理重复 3
次。APX、POD、CAT、SOD、PPO 的活性的测定依次参考
朱祝军等[6 ] 、Cakmak 和 Marschner[7 ] 、何宇炯等[8 ] 、
Oostendorp 等[9 ]的方法 ;可溶性蛋白含量采用考马斯亮
蓝 G2250 染色法测定。
11212 　可溶性蛋白的 SDS2PAGE凝胶电泳分析　可溶
性蛋白的 SDS2PAGE 凝胶电泳参照胡能书等的方
法[10 ] 。采用 14 %分离胶 ,5 %浓缩胶。样品上样量为
40μLΠ孔 ,室温下电压先调到 90 V ,待样品移动到浓缩
胶与分离胶的交界面时再将电压调至 120 V。凝胶用
考马斯亮蓝 G2250 染色 ,脱色至背景无色、条带清晰 ,
数码相机拍照记录。
11213 　过氧化物酶 (POD) 同工酶的 SDS2PAGE 凝胶电
泳分析　POD 同工酶的提取及 SDS2PAGE 凝胶电泳参
照胡能书等的方法[10 ] 。分离胶浓度 7 % ,浓缩胶 4 %。
凝胶采用联苯胺2愈创木酚染色法 ,20 ℃下染色 30min。
清水漂洗后拍照 ,7 %的醋酸中保存。
11214 　数据差异显著性分析 　试验数据分析采用
DPS 分析软件 ,LSD 法 ,5 %水平差异。
2 　结果与分析
211 　抗氧化物酶活性的变化
如图 1 所示 ,在类原球茎分化芽的过程中 ,APX、
图 1 　试管中不同分化时期的春石斛兰 4 种抗氧化酶活性的变化
Fig. 1 　Dynamic changes on the activities of four antioxidant enzymes during the
different differentiation stages of Dendrobium nobile in vitro.
1 ,PLBs ;2 ,高度 012 cm 的芽 ;3 ,高度 015 cm 的芽 ;4 ,高度 112 cm 的芽 ;5 ,高度 112 cm 的芽 (在显微镜下可见根原基) ;
6 ,高度 115 cm 的试管苗。下图分化阶段同本图。
1 , PLBs ; 2 , shoots height 012 cm ; 3 , shoots height 015 cm ; 4 , shoots height 112 cm ; 5 , shoots height 112 cm (visible root primordium) ;
6 , plantlets height 115 cm. The same as the following figures.
942　3 期 春石斛兰类原球茎分化过程中抗氧化酶活性和可溶性蛋白的变化
POD的活性均急剧下降 ,随着芽的继续生长 ,APX 和
POD 的活性继续降低 ;根系一旦被诱导 ,又呈上升趋
势 ,但活性均低于类原球茎期的水平 ;而 CAT 的活性
在 PLB 分化芽后降到最低水平 ,随着芽的生长活性缓
慢升高 ,在根发生时活性又有所降低 ,根分化一旦完成
活性再略有升高 ,变化趋势与 APX和 POD 大致相同。
SOD 与 APX、POD、CAT的活性变化则呈现完全相
反的变化趋势。在类原球茎时期处于相对较高的水
平 ,芽的分化伴随 SOD 活性的增强 ,当芽高度为 015
cm时活性达到最高 ,但随芽的进一步长高以及根的分
化和生长 ,活性呈现接近直线降低的趋势 ,在根长为
013 cm 时 ,SOD 的活性接近于 0。
212 　多酚氧化酶( PPO)活性的变化
如图 2 所示 ,在类原球茎分化芽的过程中 ,PPO 的
活性呈明显的下降趋势。在芽不断生长的过程中 ,活
性继续降低 ,生根前幼苗高度为 112 cm 时降到最低 ,
生根后活性回升 ,且随根系伸长 ,酶活性继续增强。
图 2 　试管中不同分化时期的春石斛兰 PPO 活性的变化
Fig. 2 　Dynamic changes on the activities of PPO during
the different differentiation stages of
Dendrobium nobile in vitro
213 　可溶性蛋白含量变化及 SDS2PAGE电泳
整个分化过程中 ,可溶性蛋白含量先降低后增加
(图 3) ,以类原球茎含量最高 ,是高度为 015 cm 芽的
1716 倍 ,与其它各时期相比均达到了极显著水平 ,这
表明在石斛兰的生根诱导过程中可能存在某些特异蛋
白的选择性降解或合成被抑制。SDS2PAGE 电泳图谱
(图 4)也证实 ,可溶性蛋白含量呈现先降低后增加的
趋势 ,同时在类原球茎期谱带最多。在 PLBs 分化成芽
(012 cm)时 ,有大约 50 kD 的一个蛋白 (条带 a) 的出
现 ,存在 25 kD(条带 e)和 19 kD 左右 (条带 f)两个蛋白
的选择性降解或合成被抑制 ;当芽达到一定的高度
(112 cm) ,在 35 kD 左右的一个蛋白 (条带 c) 被降解或
合成被抑制 ;生根的准备阶段一旦完成 ,在 38 kD 左右
的一个蛋白 (条带 b) 的合成受到明显抑制 ,而大约 27
kD 一个蛋白 (条带 d)的合成受到促进。
图 3 　类原球茎分化过程中可溶性蛋白含量的变化
Fig. 3 　Changes of soluble proteins
during differentiation of PLBs
图 4 　类原球茎不同分化阶段可溶性
蛋白的 SDS2PAGE凝胶电泳
Fig. 4 　Changes of soluble protein bands during
differentiations of PLBs under SDS2PAGE electrophoresis
214 　过氧化物酶( POD)同工酶的 SDS2PAGE 凝胶电泳
分析
从凝胶电泳分析结果 (图 5) 可见 ,处于不同分化
阶段春石斛兰试管材料的 POD 同工酶的活性均较低 ,
在类原球茎时期仅有 1 条谱带 ,在分化芽的过程中出
现第 2 条谱带。当芽的高度达 112 cm 即将生根时出
现第 3 条带。当根系一旦被诱导 ,第 2、3 两条带均又
消失。小植株的继续生长又使第 2 条带恢复。由此可
推断 ,第 2 条带所对应的 POD 同工酶与类原球茎分化
成芽有关 ;第 3 条带所对应的过氧化物酶同工酶与根
系的诱导有关 ,伴随根系分化的完成而消失。
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图 5 　类原球茎不同分化阶段过氧化物酶
(POD)同工酶的 SDS2PAGE凝胶电泳
Fig. 5 　Changes of isozyme bands during differentiations
of PLBs under SDS2PAGE electrophoresis
3 　讨论
类原球茎是包括春石斛兰在内的许多兰科花卉最
重要的离体无性繁殖的中间体 ,对其生长和分化的调
控是兰花试管无性繁殖研究的重要内容。已有的大量
研究均是围绕着外部因子 ,如培养基的成分和激素组
合等开展 ,而对类原球茎整个生长和分化过程中内在
的生理生化变化的研究却未见有系统的报道。
黄卓烈等[11 ]在桉树插穗生根中发现 ,难生根无性
系的 POD 活性高 ,对诱导生根不利 ;反之 ,易生根无性
系的 POD 活性低 ,对诱导根原基形成有利。Tang 等[12 ]
通过在培养基中添加抗氧化物 DTT 和 PVP ,证实通过
抑制过氧化物酶活性的提高 ,可以提高维吉尼亚松树
(Pinus virginiana Mill . ) 外植体的分化能力。上述研究
从不同的侧面佐证了本试验的结果。本试验表明 ,类
原球茎分化芽的过程中 ,APX、POD、CAT 和 PPO 的活
性均呈急剧下降 ,在根发生后逐渐回升。POD 和 PPO
的活性最低点均出现在根原基发生前期 ,即根原基的
诱导期。有研究表明[13 ] ,POD 和 PPO 活性下降直接或
间接调控 IAA 的水平 ,促进根原基的发生 ;而根原基发
生后 POD 和 PPO 的活性又有所提高 ,可能与生根辅助
因子“IAA2酚酸复合物”的产生、H2O2 参与细胞壁形
成、木质素单体的聚合有关。由于 POD 和 PPO 的活性
变化均早于根的形态发生 ,一方面说明根发生的生理
生化变化先于形态发生 ,另一方面也证实了 POD 和
PPO 是诱导根原基产生的关键性酶 ,可以作为鉴定根
形态发生与否及生根难易的重要的生理指标[11 ] 。
从可溶性蛋白的含量变化和电泳图谱中均可看
出 ,类原球茎分化芽和根的过程中可溶性蛋白不仅表
现为量的变化 ,同时也是某些蛋白被选择性降解或合
成受到抑制 ,以及新蛋白合成的过程。在类原球茎分
化芽和根的过程中 ,细胞活动旺盛 ,所以可溶性蛋白大
量消耗而明显下降。在根原基发生期可溶性蛋白含量
又逐渐上升 ,与苹果新稍[14 ] 离体生根及大白菜子叶[3 ]
培养过程中的变化相一致。
过氧化物酶同工酶具有调节植物内源激素 IAA 合
成的功能[15 ] 。在苹果、猕猴桃等植物上的研究已表
明 ,不定芽分化和根的发生与过氧化物酶 ( POD) 活性
及过氧化物酶同工酶的变化密切相关[14 , 16～18 ] 。在本
试验也证实了过氧化物酶同工酶在类原球茎分化芽和
根的过程中存在明显的变化。表明有可能通过在培养
基中有针对性地添加该类酶的促进或抑制剂来调控类
原球茎的生长或分化 ,使石斛兰的试管繁殖的各个环
节有序地展开。
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良难以取得大的突破。CB F 基因的组成型超表达能
够诱导植物体内多个冷诱导和脱水诱导基因的表达 ,
激活体内的多种耐逆性机制 ,从而使转基因植株的耐
逆性得到综合改良[4 ,5 ] 。作者曾用拟南芥 CB F1 基因
转化草坪草高羊茅获得了耐逆性增强的转基因植
株[13 ] ,本研究在此基础上用该基因转化水稻 ,又使获
得的转基因后代的多种耐逆性得到了提高。基因工程
改良耐逆性是目前水稻遗传转化研究的热点 ,本研究
成功获得一批耐逆性增强的转基因材料 ,相信对培育
耐逆水稻新品种具有一定意义。
在植物遗传转化研究中 ,转基因植株有潮霉素抗
性而没有 GUS 活性的现象已有不少报道[6 ,7 ,14 ,15 ] ,本研
究结果也有类似现象 ,4 株转基因植株能扩增出 hpt 基
因片段而 GUS 染色呈阴性。作者推测 ,产生这一事件
的原因之一可能是发生了转基因沉默。转基因沉默是
一种比较常见的现象[16 ] ,一般认为 ,它的发生多数与
同源序列的插入有关[17 ] 。本研究所用质粒上目标基
因 CB F1、筛选基因 hpt 和报告基因 gus 均以 CaMV 35S
为启动子、NOS 为终止子 ,这可能就是导致转基因沉默
发生的根源所在[6 ,7 ] 。由此建议 ,在构建植物表达载体
时 ,对于多个不同的基因应尽量选用不同的启动子和
终止子序列 ,以避免同源序列插入引起转基因沉默的
发生[6 ] 。当然 ,在本研究中 ,也不能排除在 T - DNA 整
合过程中发生了重组而导致 gus 基因不能正常表达的
可能性。
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