全 文 ：　文章编号 :100028551 (2001) 0520282204
大豆幼嫩子叶离体培养及辐照处理
配合基因枪遗传转化研究
刘智宏　胡张华　郎春秀　黄锐之　陈锦清
(浙江省农业科学院原子能利用研究所 ,浙江 杭州　310021)
摘　要 :3 年来共收集 40 份栽培大豆和野生大豆材料 ,进行幼嫩子叶的离体培养 ,其
中 3 个品种获得较高的再生植株频率。辐照处理配合基因枪介导转基因研究表明 ,
5Gyγ射线辐照处理能明显提高抗性愈伤的频率。GUS 检测抗性愈伤组织 ,证明外
源基因已导入大豆细胞 ,并在其中表达。
关键词 :大豆 ;基因枪 ;辐照 ;转化
收稿日期 :1999202209
基金项目 :浙江省九五重点科技攻关资助项目
作者简介 :刘智宏 (1960～) ,男 ,浙江杭州人 ,浙江省农业科学院原子能利用研究所助理研究员 ,从事作物品质改良基因
工程研究
大豆还有豆科植物所特有的根瘤 ,在大气氮循环中起独特的作用 ,所以大豆的遗传改良一
直备受人们重视。在大豆的离体培养方面 ,人们已成功地由培养的茎尖、子叶节、幼嫩子叶及
原生质体等材料再生完整的植株并结实[1 ,9 ,10 ] 。然而这些离体培养系统应用于转基因时 ,都有
不够完善之处。主要的困难在于再生植株效率低 ,再加以转基因处理和离体筛选 ,要产生完整
的转基因植株就更困难了。所以人们一直努力改进大豆的离体培养系统 ,寻找更合适的培养
材料和新的再生植株途径。
为此 ,我们收集了国内外一系列大豆材料 ,对它们的幼嫩子叶切块进行培养 ,获得再生植
株。并用不同剂量的γ射线辐照处理受体 ,以期提高大豆基因枪转化效率。
1 　材料与方法
111 　材料
栽培大豆 ( Glycine max)国外品种 12 份 ,本国品种 28 份。国外品种由中国农业科学院品种
资源所提供 ,国内品种由浙江省农业科学院作物研究所大豆组提供。
112 　质粒
为本实验室构建的 Anti2PEPΠpIG121 ,宿主于大肠杆菌 JM109 ,参照 Manitais[8 ]方法大量提取
质粒 ,PEG纯化。经纯化后的质粒 DNA 其 OD260ΠOD280为 118 ,溶于 pH716 的 TE缓冲液中 ,浓度
为 1μgΠμl。
282 　核 农 学 报　2001 ,15 (5) :282～285Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
113 　方法
大豆材料分春、夏两季播种于本院试验田。取约 4mm 幼嫩子叶分别接种于含 2 ,42D 5mgΠ
L ,10mgΠL ,20mgΠL ,40mgΠL 的MSB 培养基 ,观察体细胞胚发生情况 ;另外还接种于含 2 ,42D 1mgΠ
L 和 BA011mgΠL 的愈伤组织诱导培养基 ,诱导愈伤组织后用含 2 ,42D 015mgΠL ,NAA 1mgΠL ,ZT
011mgΠL 的继代培养基培养 ,再挑取硬粒愈伤组织于 BA 1mgΠL ,ZT 1mgΠL 和 NAA 0115mgΠL 的
分化培养基上产生芽 ,将芽割下于 MSB 或含 IBA 0105mgΠL 的 MSB 培养基上生根 ,盆栽成活。
统计产生的植株数。
114 　辐照配合基因枪介导 　将子叶切成两半 ,伤口朝上植入琼脂培养基 ,基因枪为 Bio2Rad 公
司的 PDS21000ΠHe。在基因枪导入外源基因前和导入外源基因后 24h ,分别用γ射线 0、5、10、
20Gy 辐照处理。然后进行愈伤组织诱导 ,培养 1 周 ,再转入含有卡那霉素 200mgΠL 的培养基
上 ,统计产生抗性愈伤组织的频率。基因枪操作程序参照 Sanfordl[11 ] ,所用金粉颗粒直径为
116μm ,无菌条件下制备金粉的乙醇溶液 ,浓度 60μgΠμl。取 50μl 悬浮液分装于 Eppendorf 管中 ,
每一管加入 5μl 质粒 ,加入 50μl 215M CaCl2 和 20μl 011M 亚精胺溶液 ,充分振荡 3min ,10000rpm
离心 10min ,弃上清液 ,重新悬浮于 50μl 100 %乙醇中 ,轰击压力为 1100psi。
115 　GUS 分析
GUS(β2葡萄糖苷酸酶)组织化学表达分析按 Jefferson[5 ]所述进行。在缓冲液中加入终浓度
为 20 %的甲醇为抑制内源的β2葡萄糖苷酸酶活性 ,染色后经乙醇∶冰醋酸 (3∶1) 固定液固定。
Nikon 体视显微镜下拍摄。
2 　结 　果
211 　离体培养情况
高浓度 2 ,42D 培养基对 Century 等 12 份美国品种及 18 份中国品种皆未见产生体细胞胚。
对 10 个品种幼嫩子叶块离体培养 ,子叶块通过器官发生再生植物的结果列于表 1 和图版 Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ,从表 1 可见浙春系列品种有较好的分化能力。
表 1 　子叶块分化产生的芽(丛)数
Table 1 　Number of shoots differentiated from immature cotyledon calli
品种
cultivars
子叶块数
number of cotyledon
芽 (丛)数
number of shoot cluster
平均每丛芽生根株数
average plant number
per shoot cluster
浙春 1 号 48 23 215
Zhechun No. 1
GF 22 0 —
C12 10 0 —
C17 45 2 0
浙春 2 号 28 3 3
Zhechun No. 2
浙 328 30 15 0
Zhe 328
浙春 3 号 28 12 2
Zhechun No. 3
3811 40 0 —
3812 30 0 —
8624 20 0 —
382　5 期 大豆幼嫩子叶离体培养及辐照处理配合基因枪遗传转化研究
212 　子叶块基因枪转化
用 0、5、10、20 Gy 4 个剂量分别在转基因处理前 24h 和转基因后 24h 进行辐照处理 ,培养 1
周后在卡那霉素 200mgΠL MSB 上进行筛选培养 (图版 Ⅰ) ,1 个月后统计产生抗性愈伤组织的
子叶块 (见表 2、图 2) 。结果表明 5 Gy 的辐照能提高抗性愈伤比例。
图版 Ⅰ　5 Gyγ射线辐照处理子叶块
Plate Ⅰ　Cotyledon irradiated with 5 Gyγ2ray 图版 Ⅱ　抗性大豆愈伤组织Plate Ⅱ　Soybean KmR calli
表 2 　不同辐照剂量下产生抗性愈伤子叶块比例
Table 2 　Ratio of cotyledon with KmR calli after irradiating cotyledons at various doses
处理
treatment
剂量 dose ( Gy)
0 5 10 20
转基因后辐照
bombardment before irradiation
1Π6 9Π20 0Π20 0Π20
辐照后转基因
irradiation before bombardment
5Π24 19Π23 8Π24 2Π22
图版 Ⅲ　抗性愈伤的 X2Gluc 染色
Plate Ⅲ　The soybean KmR calli
stained with X2Gluc
左 :对照　　右 :抗性愈伤
Left :CK　　Right : KmR calli
213 　GUS 分析
抗性愈伤组织经 X2Gluc 染色后呈蓝色
(图版 Ⅲ) ,而未经基因枪转化的对照愈伤组
织不着色 ,这说明转入的 GUS 基因已在大
豆细胞中表达。
3 　讨 　论
以上的研究是探讨提高大豆转基因效
率的一个方面。任何成功的转化都有赖于
高效组织培养再生系统。获得大豆转基因
植株的两篇最早报道采用两种不同方法 ,即
Hinchee 等[4 ]转化子叶所采用的农杆菌方法
和 McCabe[7 ]等转化芽分生组织采用的基因
枪法 ,此后报道不多 ,且转化效率极低 ,大豆组织培养困难是主要原因。本研究收集了 40 个国
482 核　农　学　报 15 卷
内外品种 ,选择幼嫩子叶为起始材料 ,对其再生能力作了系统研究 ,初步研究表明浙春系列品
种具有较好的分化能力。
要提高稳定转化频率 ,一方面要改进离体培养系统 ,另一方面可增加一些处理因素。
Kohler[6 ]等报道了辐射介导使 4 种植物的外源 DNA 整合率提高 6～7 倍 ,我们的试验表明 5 Gy
γ射线辐照处理能促进大豆外源基因导入和整合 ,而高剂量照射对细胞造成的不可逆损伤 ,反
而不利于外源基因的导入。这些与我们先前的报道一致[2 ] ,即辐照破坏细胞壁有利于外源基
因导入 ,另一方面辐照处理能提高外源基因整合率 ,可能与辐照处理抑制细胞排异性、促进
DNA 修复系统功能有关 ,有待作更深入研究。
参考文献 :
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[11 ] 　Biolistic PDS21000ΠHe Particle Delivery System ,Instruction Manual . Bio2Rad Laboratories.
IN VITRO CULTURE OF SOYBEAN IMMATURE COTYLEDONS AND GENETIC
TRANSFORMATION VIA BIOLISTIC SYSTEM
LIU Zhi2hong 　HU Zhang2hua 　LANG Chun2xiu 　HUANG Rui2zhi 　CHEN Jin2qing
( Institute for Application of Atomic Energy , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang prov . 　310021)
ABSTRACT :40 soybean ( Glycine max( L. ) Merr. ) cultivars were collected to study in vitro cul2
ture of immature cotyledons. Regenerated plants of 3 cultivars were obtained and one cultivar was
used to study the effect of irradiation treatment on stable genetic transformation rate. 0 ,5 ,10 ,20
Gy were applied before or after bombardment with Bio2Rad system. It was found that 5 Gy was
the effective dose to raise the ratio of cotyledons with KmR calli. GUS enzyme activity showed that
foreign genes had been integrated into genome of soybean callus.
Key words :soybean ;transformation ;biolistic system;irradiation treatment
582Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2001 ,15 (5) :282～285