全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551 (2000) 0220065207
电子束与γ辐射对大麦种胚 DNA
非预定合成的影响
刘　晓1 　赵玉芳2 　凌备备2
(11 中国科学院大连化学物理研究所生化工程室　辽宁 大连　116023 ;21 浙江大学核农所　浙江 杭州　310029)
摘 　要 :羟基脲抑制与流式细胞仪检测证明 ,在大麦种子的吸涨初期 ,种胚 DNA 合成
主要是 DNA 非预定合成 ,一定剂量下60Co2γ辐射能刺激增强种胚的 DNA 非预定合
成。辐射刺激效应随修复时间延长呈下降趋势。50～400 Gy 的电子束辐射对大麦种
胚的 DNA 非预定合成也有刺激作用。在半致死剂量附近有一峰值 ,在致死剂量附
近出现最小值。
关键词 :电子束 　60Co2γ射线 　辐射 　大麦 　DNA 非预定合成 　羟基脲
收稿日期 :1999212227
基金项目 :国家自然科学基金 (39470405)
作者简介 :刘晓 (19652) ,女 ,浙江缙云人 ,理学博士 ,现为中国科学院大连化学物理研究所博士后 ,主要从事植物生理与
分子生物学的研究
在受到各种外来理化因素损伤的情况下 ,细胞对损伤 DNA 的修复效率将决定细胞的命
运 ;如果 DNA 结构得到正确的修复则细胞功能趋于正常 ,如果修复不成功、不完全或不精确 ,
则细胞可能发生死亡 ,或发生遗传信息的变化与丢失从而引发突变。因此 ,对 DNA 损伤与修
复的研究是深入了解突变与进化的分子过程的重要手段[1 ,2 ] 。研究 DNA 非预定合成有重要
意义。
在文献 4 中我们已研究了电子束辐射导致大麦种胚 DNA 复制合成启动推迟、DNA 复制、
RNA 合成活性下降的问题[4 ] ,本文将研究电子束与60 Co2γ辐射对大麦种胚 DNA 损伤的修复
效应。
1 　材料与方法
111 　试剂
3 H2胸腺嘧啶脱氧核苷 (3 H2TdR) 比活度为 112 ×1012Bq/ mmol (上海核技术开发公司生
产) ;非放射性标记的胸苷 ( TdR)与羟基脲购自 Sigma 公司 ,其余试剂为国产分析纯。
112 　辐射处理
供试大麦 ( Hordeum v ul gare L . )干种子 ,品种为浙农大 3 号 ,萌发率 98 % ,含水量 814 %。
电子束辐射在中国科学院上海原子核研究所进行 ,采用国产 115 MeV 电子静电加速器装置 ,
实验用电子束能量为 110 MeV。辐射剂量为 50～200 Gy 时 ,剂量率 30 Gy/ min (电子流强
0121μA) ;辐射剂量为 200～500 Gy 时 ,剂量率 60 Gy/ min (电子流强 0142μA) ,辐射在室温下
56　核 农 学 报　2000 ,14 (2) :65～71Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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进行 ,辐射后立即将种子置 4 ℃保存。60 Co2γ辐射在浙江大学核农所钴室进行 ,钴源强 219 ×
1015Bq ,剂量率 5 Gy/ min ,将种子置冰浴中辐射 ,辐射后立即置 4 ℃保存。
113 　种子吸涨
大麦种子去颖壳 ,015 %的 NaClO 处理 60 s ,无菌双蒸水洗涤 3 次 ,吸干 ,转移至含 9 ml 处
理液的无菌培养皿中 ,28 ℃避光吸涨。每处理 3 次重复 ,各 15 粒种子。
114 　羟基脲处理
取吸涨不同时间的大麦种子 ,用无菌滤纸吸去表面的水分 ,转移到羟基脲溶液中 ,继续
28 ℃避光吸涨到所需时间。
115 　大麦种胚 DNA 合成活性测定
大麦种胚 DNA 标记、分离等参见文献 4 ,每样本 3 次重复。DNA 标记液组成 :蔗糖 2 % ,
氯霉素 10μg/ ml ,含3 H2TdR ,放射性浓度为 813 ×105 Bq/ ml ,含所需浓度的羟基脲。用吸涨 4
h 的对照组种子 ,煮沸 5 min 后剥胚进行放射性本底测量。取水解后的样本 015 ml ,加闪烁液
( PPO 5 g ,POPOP 014 g ,乙二醇乙醚 450 ml ,加二甲苯至 1 L) 8 ml ,在 Packard 1900CA 双道液
体闪烁计数器上以猝灭校正法测定 dpm 值 ,以样本 dpm 值减去本底 dpm 值后计算每样本的
DNA 合成活性。
116 　细胞核流式细胞仪分析
同文献4 ,每样本检测 110 ×104 个细胞核。
2 　结 　果
211 　不同浓度羟基脲对大麦种胚 DNA 复制合成活性的影响
未辐射处理的大麦种子在不同浓度羟基脲溶液中吸涨 18 h 后 ,在含相应浓度羟基脲的标
记液中标记 2 h ,检测种胚 DNA 合成活性 ,得到羟基脲抑制大麦种胚 DNA 复制合成活性的剂
量2效应曲线 ,结果见图 1。由图 1 可见 ,在 5～20 mmol/ L 农度范围内 ,羟基脲对 DNA 复制合
成活性的抑制作用随处理浓度升高而增强 ,在 20 mmol/ L 的羟基脲处理下 ,大麦种胚的相对
放射性强度 (样本 DNA 合成活性占对照的百分率)只有 32 %。但此后随羟基脲浓度进一步提
高 ,抑制作用不再增强 ,表明 20 mmol/ L 的羟基脲即可对大麦种胚的 DNA 复制合成达到最高
抑制水平。
图 1 　不同浓度羟基脲对大麦种胚 DNA 复制合成活性的影响
Fig. 1 　Effects of hydroxyurea concentration on DNA replication activity in barley embryos
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　　大麦种子在不同浓度羟基脲溶液中吸涨 20 h ,分离种胚的细胞核 ,用流式细胞仪分析 G1 、
S、G22M 期细胞核的百分率 ,结果见表 1。由表 1 可见 ,在无菌双蒸水中吸涨 20 h 的对照组大
麦种胚的 G1 期细胞核比率较未吸涨休眠期种子胚中有较大的下降 ,而 S 期与 G22M 期细胞核
比率则较休眠期种胚中有较大的提高 ,表明大麦种胚在吸涨 20 h 有大量胚细胞从 G1 期进入 S
期与 G22M 期。10～20 mmol/ L 的羟基脲处理 20 h 均可使胚中 S 期细胞核比率较吸涨 20 h
的对照组显著降低 ,但与休眠期种胚中基本相当 ;而 G22M 期细胞核比率随处理浓度增加而下
降 ,在 20 mmol/ L 的羟基脲处理下 , G22M 期细胞核比率与休眠期种胚中基本相当 ,表明不同
浓度的羟基脲处理可在不同程度上导致大麦种胚细胞的 G1 期阻滞 ,而 20 mmol/ L 的羟基脲
处理几乎可将大麦种胚细胞全部阻滞在 G1 期。
表 1 　不同浓度羟基脲对大麦种胚 S期细胞核比率的影响
Table 1 　Effects of hydroxyurea concentration on dist ribution on
S2phase nuclei percentage in barley embryos
吸涨时间
imbibition
time (h)
羟基脲浓度
concentration of
hydroxyurea (mmol/ L)
细胞核比率
percentage of nuclei ( %)
G1 S G22M
0 0 7416 819 1615
20 0 3517 2814 3519
20 10 6015 816 3019
20 15 6511 813 2616
20 20 7616 910 1414
212 　羟基脲处理不同时间对 DNA 复制合成活性的抑制效应
大麦种子在无菌双蒸水中预吸涨不同时间后在 20 mmol/ L 羟基脲溶液中继续吸涨 ,使吸
涨时间之和为 18h ,种胚在含 20 mmol/ L 羟基脲的标记液中标记 2 h ;对照组在无菌双蒸水中
吸涨 18 h ,在不含羟基脲的标记液中标记 2 h ,检测种胚 DNA 合成活性 ,得到表 2。由表 2 可
见 ,20 mmol/ L 的羟基脲对大麦种胚 DNA 合成活性的抑制强度与处理时间呈正相关 ,但羟基
脲处理 4 h 与处理 18 h 的DNA 合成活性基本相同 ,表明 20 mmol/ L 的羟基脲处理 4 h 即可达
到最高抑制水平。
表 2 　20 mmol/ L 羟基脲处理不同时间对大麦种胚 DNA合成活性的影响
Table 2 　Effects of different t reating duration of 20 mmol/ L hydroxyurea
on DNA synthesis activity in barley embryos
羟基脲处理前
的吸涨时间
imbibition
hours before
treatment with
hydroxyurea (h)
3H2TdR 标记前的
羟基脲处理时间
hours of 20 mmol/ L
hydroxyurea treatment
before labelling
with 3H2TdR(h) 标记液中羟基脲浓度concentration ofhydroxyurea inlabelling solution(mmol/ L) 大麦种胚 DNA合成活性DNA synthesisactivity in barleyembryos(dpm/ embryo) 占对照百分率( %)
18 0 0 16343 ±2418 100
0 18 20 5459 ±619 3314
14 4 20 5536 ±477 3319
16 2 20 6855 ±511 4119
18 0 20 8231 ±351 5014
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213 　羟基脲与60Co2γ射线对吸涨初期大麦种胚 DNA 合成活性的影响
在 20 mmol/ L 羟基脲溶液或无菌双蒸水中吸涨 4 h 的大麦种子在冰浴中接受60 Co2γ辐
射 ,或者休眠期大麦干种子经γ辐射后在 20 mmol/ L 羟基脲溶液或无菌双蒸水中吸涨 4 h ,种
胚在含相应浓度羟基脲的标记液中标记 2 h ,检测 DNA 合成活性 ,以非辐射处理组作为对照 ,
结果如表 3 所示。由表 3 可见 ,60 Co2γ辐射促使吸涨初期种胚的 DNA 合成活性增强 ,其中
250 Gy 辐射处理干种子较 100 Gy 辐射处理干种子对种胚 DNA 合成活性的促进作用更强 ;就
吸涨 4h 取样检测得到的结果看 ,250 Gy 辐射处理吸涨 4 h 的种子较处理干种子对 DNA 合成
活性的促进作用更强 ,但羟基脲处理对辐射所促进的种胚 DNA 合成活性没有显著影响。所
有处理组合中 ,20 mmol/ L 的羟基脲处理 4 h 可使种胚 DNA 合成活性较无羟基脲处理的相应
组略有下降 ,但从 t 检验的结果可知 ,所有处理组合中 ,羟基脲存在与否对种胚 DNA 合成活性
没有显著影响 ,该结果表明 ,吸涨初期大麦种胚的 DNA 合成为非预定合成 ,辐射能刺激 DNA
非预定合成 ,此外 ,已有报告指出该品种大麦在吸涨 12h 才有种胚细胞从 G1 期启动进入 S
期[4 ] ,这与本实验的结果一致。
表 3 　60Co -γ辐射与羟基脲处理对吸涨初期大麦种胚 DNA合成活性的影响
Table 3 　Effects of 60Co -γand hydroxyurea on DNA synthesis activity in barley embryos
辐射时种子的状态
State of seeds when
γ
- irradiation (h)
辐射剂量
Dosage of 60Co -γ
irradiation ( Gy)
羟基脲浓度
Concentration of
hydroxyurea (mmol/ L)
DNA 合成活性
DNA synthesis activity
(dpm/ embryo)
t 检验 3
t - test
未辐射 0 0 75010 ±11916 　
Non irradiation 20 68518 ±8516 11348
干种子 100 0 88518 ±10715
Dry seeds 20 88417 ±5314 01035
干种子 250 0 106016 ±11315
Dry seeds 20 95514 ±11313 11638
吸涨 4h 250 0 128715 ±13717
4h of imbibition 20 126410 ±9419 01431
　3 以羟基脲浓度为 0 的相应处理为对照 ,检验羟基脲对 DNA 合成的影响 ;t2 ,0. 05 (双侧) = 41303。
214 　60Co2γ射线对不同吸涨时间的大麦种胚 DNA 非预定合成活性随修复时间的变化
图 2 　60Co2γ射线诱发的大麦种胚 DNA 非预定合成活性随修复时间的变化
Fig. 2 　Changes in unscheduled DNA synthesis activity in barley embryos induced by
60Co2γ ray with different repair time
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　　休眠种子或在无菌双蒸水中预吸涨 4 h、8 h 的大麦种子 ,在冰浴中接受60 Co2γ辐射处理 ,
辐射剂量为 250 Gy ,辐射后在 28 ℃继续吸涨使种胚细胞得到一定的修复 ,每隔 2 h 取样标记 ,
测定种胚 DNA 合成活性 ,以相同处理的非辐射种胚作对照 ,结果如图 2 示。由图 2 可见 ,对照
组大麦种胚 DNA 非预定合成活性随修复时间延长呈下降趋势 ,预吸涨不同时间受辐射处理
的种胚 DNA 非预定合成活性也呈相同变化趋势。预吸涨 4 h、8 h 的大麦种子受γ辐射处理
后种胚的 DNA 非预定合成活性较对照组种胚在相同吸涨时间 DNA 非预定合成活性的增加
部分反映了辐射刺激 DNA 非预定合成的强度 ,图 2 的结果表明 ,60 Co2γ射线对预吸涨 8 h 大
麦种胚 DNA 非预定合成的刺激强度大于对预吸涨 4 h 种胚的刺激作用 ,而后者较对休眠期种
胚的刺激作用强 ,但辐射所刺激的 DNA 非预定合成活性随修复时间延长也呈下降趋势。
215 　电子束辐射对吸涨初期大麦种胚 DNA 非预定合成的影响
不同剂量电子束辐射处理大麦休眠种子 ,种胚在吸涨初期的 DNA 非预定合成活性随吸
涨 (修复)时间的变化曲线见图 3。由图 3 可见 ,电子束辐射处理的大麦种胚 DNA 非预定合成
活性随修复时间延长呈下降趋势 ,与60 Co2γ射线处理的结果一致。在种子吸涨的 4～8 h 内 ,
电子束辐射样本的 DNA 非预定合成活性均高于同期对照 ,而且 ,400 Gy 电子束辐射样本的
DNA 非预定合成活性基本高于 200 Gy 辐射样本 ,表明电子束辐射可促使大麦种胚 DNA 非预
定合成活性增强 ,促进作用的强度与辐射剂量有关。
不同剂量电子束辐射处理大麦干种子 ,修复 4 h 后检测种胚 DNA 合成活性 ,结果见图 4。
图中曲线显示 ,在实验所用剂量范围内 ,不同剂量的电子束辐射对大麦种胚 DNA 非预定合成
均有刺激作用 ,刺激强度与辐射剂量之间的关系比较复杂 ,在 150 Gy 剂量内 ,辐射促进的
DNA 非预定合成活性随辐射剂量升高呈增加的变化趋势 ,在 150 Gy 处达到最大值 ;DNA 非
预定合成活性在 200、250 Gy 的辐射剂量下有所下降 ,在 250 Gy 处出现最小值 ,但随辐射剂量
进一步增加而又呈现上升趋势 ,这种变化趋势与60Co2γ射线处理的结果类似[5 ] 。
图 3 　电子束辐射对大麦种胚 DNA 非预定合成活性随修复时间的变化
Fig. 3 　Changes in barley embryos unscheduled DNA synthesis activity induced by electron
beam irradiation with different repair time
3 　讨 　论
大麦种子在 28 ℃吸涨 12 h 左右 ,部分胚细胞开始由 G1 期进入 S 期 ,DNA 复制合成随即
开始启动 ,种胚的 S 期细胞比率在吸涨 18 h 前后达到吸涨后的第一个峰值 ;同时 ,DNA 复制
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图 4 　电子束辐射对大麦种胚 DNA 非预定合成活性的剂量效应曲线
Fig. 4 　Dosage2response curve of unscheduled DNA synthesis activity in
barley embryos after electron beam irradiation
大麦种受电子束辐射的剂量率为 :50～200 Gy ,30 Gy/ min ;250～400 Gy ,60 Gy/ min。
大麦种子在 28 ℃吸涨 4h 后 ,分离种胚 ,并在3H2TdR 中处理 2h。
Barely seeds were irradiated with electron beam at dose rates of 50～200 Gy , 30 Gy/ min ; 250～400 Gy , 60 Gy/ min.
After being allowed to imbibe at 28 ℃for 4 h , the embryos were excised and incubated with 3H2TdR for 2h.
合成活性从吸涨 12 h 始急剧升高 ,在吸涨 18 h 已非常活跃[4 ] 。图 1、表 1、表 2 的结果表明 ,20
mmol/ L 的羟基脲处理大麦种子 4 h 即可达到对胚 DNA 复制合成活性的最高抑制水平。但在
种子开始吸涨初期 ,20 mmol/ L 的羟基脲处理 4 h 对种胚的 DNA 合成及60Co2γ辐射所刺激的
胚 DNA 合成增加均没有显著影响 (表 3) ,表明大麦种胚在吸涨 4 h 的 DNA 合成与 S 期细胞
的 DNA 复制合成具本质差别 ,证明吸涨初期的 DNA 合成是 DNA 非预定合成 ,而辐射所刺激
的也是 DNA 非预定合成。图 2、图 3 的结果表明 ,电子束与60Co2γ辐射所刺激的 DNA 非预定
合成的强度随修复时间呈现相同的变化趋势 ,即随修复时间延长而下降 ,因此对辐射诱发
DNA 非预定合成规律的研究应尽量缩短修复时间。
电子束对大麦种胚 DNA 复制合成的半致死剂量与致死剂量分别为 178 Gy 与 256 Gy[4 ] ,
图 4 的结果表明 ,电子束对大麦种胚的 DNA 非预定合成活性的刺激作用在半致死剂量附近
出现一个高峰 ,该结果与γ辐射处理大麦[5 ] 、黑麦[6 ] 、豌豆[7 ]种胚得到的结果一致 ;但随辐射
剂量进一步增加 ,种胚 DNA 非预定合成又出现上升趋势 ,原因尚待进一步研究。在辐射的半
致死剂量附近出现 DNA 修复合成高峰预示用半致死剂量附近的辐射来作诱变育种处理 ,可
以得到较高的突变率。图 2 表明 ,吸涨初期 ,大麦种胚 DNA 非预定合成活性随吸涨 (修复) 时
间有所降低 ,这很可能是由损伤 DNA 数目变小引起的。
大于 400 Gy 的γ射线对大麦种胚的 DNA 非预定合成表现出抑制作用[5 ] ,而 50～400 Gy
的电子束辐射均促使大麦种胚的 DNA 非预定合成活性增强 ,两种辐射处理间的这种差异可
能缘于辐射后的修复时间不同 ,也可能缘于辐射品种本身的差异。
20 mmol/ L 的 DNA 复制合成的特异性抑制剂羟基脲几乎可将种胚细胞全部阻滞在 G1
期 (表 1) ,而且该浓度的羟基脲对大麦种胚 DNA 合成的抑制强度已达到最高水平 ,但是 ,在该
浓度条件下大麦种胚还有大约 5200dpm/ 胚的 DNA 合成活性 ,约为对照的 32 % ,远远高于辐
射刺激的 DNA 非预定合成的最高值。在种胚 DNA 复制合成的高峰期 ,20 mmol/ L 的羟基脲
所不能抑制的这部分 DNA 合成活性是否与线粒体等细胞质的 DNA 合成有关 ,尚待进一步研
究。
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UNSCHED UL ED D NA SYNTHESIS IND UCED BY EL ECTRON BEAM AND
γ IRRADIATION IN BARL EY EMBRYOS
L IU Xiao1 　ZHAO Yu2fang2 　L IN G Bei2bei2
( 1 Dalian Instit ute of Chemical Physics , Chinese Academy of Sciences , Dalian , L iaoning Prov . 　116023 ;
2 Instit ute of N uclear2A gricult ural Sciences , Zheji ng U niversity , Hangz hou , Zhejiang Prov . 　310029)
ABSTRACT :D NA synthesis in barley embryos during the initial imbibition of barley seeds was
proved to be unscheduled D NA synthesis ( UDS) from the evidence by hydroxyurea treated at 20
mmol/ L and flow cytemetric analysis of isolated nuclei. Unscheduled D NA synthesis activity in
barley embryos were accelerated by 60 Co2γ ray with its effects decreasing with the repair time.
Barley embryos unscheduled D NA synthesis activity were enhanced also by electron beam irradi2
ation in the dosage range from 50 to 400 Gy. There was a peak at a dosage lower than LD50 , and
a minimum at the lethal dosage of electron beam irradiation.
Key words :Electron beam , 60 Co2γ, radiation , barley , unscheduled DNA synthesis ( UDS) , hy2
droxyurea
17Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2000 ,14 (2) :65～71