全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032165204
高能混合粒子场辐照小麦 M1 代变异的 SSR 分析
韩微波1 ,2 　刘录祥2 　郭会君2 　赵林姝2 　李家才3 　张少平3 　王成社1 　赵世荣2
(11 西北农林科技大学 ,陕西 杨凌　712100 ;21 中国农业科学院作物科学研究所Π农业部农业核技术与航天育种重点
开放实验室 ,北京　100081 ;31 中国科学院高能物理研究所 ,北京　100039)
摘　要 :本试验利用北京正负电子对撞机直线加速器 E2 束流打靶产生高能次级混合粒子场 ,模拟次级
宇宙射线 ,分别以 0、109、145、195、284 和 560Gy 剂量处理两个冬小麦品种 ZY9 和 ZH7 ,并与相同剂量
的60 Coγ射线相比较 ,研究混合粒子场辐射处理对小麦幼苗生长和微卫星 (SSR) 标记谱带变化的影响。
试验结果表明 ,随着混合粒子场处理剂量的增加 ,小麦幼苗生长受到的损伤逐渐增加。SSR 标记分析结
果发现 ,小麦 B 基因组的多态性位点频率占总多态性频率的 46 % ,在 3 个基因组中最高 ,可能为“热点”
突变基因组。高能混合粒子场对冬小麦幼苗的生长抑制和微卫星 DNA 的损伤效应大于γ射线。
关键词 :高能混合粒子场 ;60 Coγ射线 ;SSR 多态性 ;小麦
SSR ANALYSIS ON M1 VARIATION OF WHEAT IRRADIATED BY MIXED
HIGH ENERGY PARTICLE FIELD
HAN Wei2bo1 ,2 　LIU Lu2xiang2 　GUO Hui2jun2 　ZHAO Lin2shu2 　LI Jia2cai3
ZHANG Shao2ping3 　WANG Cheng2she1 　ZHAO Shi2rong2
(11 North2west Sci2tech University of Agriculture and Forestry , Yangling , Shaanxi 712100 ;21 Institute of Crop Science ,
Chinese Academy of Agricultural SciencesΠKey Lab of Agricultural Nuclear Technology &Aerospace Breeding , Ministry of Agriculture , Beijing 100081 ;
31 Institute of High Energy Physics , Chinese Academy of Science , Beijing 100039)
Abstract :Dry seeds of two winter wheat genotypes , ZY9 and ZH7 , were irradiated by simulative cosmic rays of mixed high2
energy particle field (shorted as CR) with different dosages of 0 , 109 , 145 , 195 , 284 and 560Gy , which was generated from
E2 of LINAC of Beijing Electron Positron Collider , 60 Coγ2rays irradiation of the same dosage as the control . The results
indicated that there were dose2effects on seedling height and root length of CR irradiation. The total rate of polymorphic loci in
genome B was 46 % , which was the highest in the three wheat genomes , implying B genome might be the hotspot mutation
genome in wheat . The microsatellite DNA damage caused by CR was more serious than those ofγ2rays in the M1 generation of
wheat .
Key words :mixed high2energy particle field ; 60 Coγ2rays ; SSR polymorphism ; wheat
收稿日期 :2005211223
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30270345) ,国家高技术研究计划 863 项目 (2002AA241011) 、国家航天育种工程项目和国际原子能机构地区合
作项目 (RAS5040)与合同项目 (RCP12610)
作者简介 :韩微波 (19792) ,男 ,陕西兴平人 ,硕士研究生 ,现在黑龙江农科院作物育种研究所工作。刘录祥和王成社为通讯作者 , Email :luxiang @
263. net . cn
　　大量研究表明 ,太空环境所具有的微重力、太空辐
射、高真空、弱地磁等综合因素 ,可影响植物后代性状
产生变异 ,且多数变异性状能够在后代遗传[1 ] 。我国
科学工作者将太空诱变技术应用于农作物新品种培育
已取得显著成效[2 ,3 ] 。由于航天育种涉及返回式卫星
等航天飞行专门技术 ,试验机会十分有限 ,因此有必要
开展地面模拟航天环境对生物的诱变作用研究。1999
年以来 ,中国农业科学院航天育种中心等单位 ,在国内
外率先利用北京正负电子对撞机模拟次级宇宙粒子
(主要包括派介子、谬子、正、负电子、光子和质子等)处
561　核 农 学 报　2006 ,20 (3) :165～168Journal of Nuclear Agricultural Sciences
理小麦种子 ,与γ射线相比显著提高了相对生物学效
应[4～6 ] 。
本研究利用北京正负电子对撞机直线加速器 E2
束流打靶产生的高能混合粒子场模拟宇宙粒子处理小
麦干种子 ,研究混合粒子场对幼苗生长的影响 ,用 SSR
标记方法研究 M1 代微卫星 DNA 损伤特性与变异 ,初
步探索高能混合粒子场诱变冬小麦的特异性及育种
前景。
1 　材料与方法
111 　材料
试验选用中国农业科学院作物科学研究所育成的
两个冬小麦品种 ZY9 和 ZH7 为材料。
112 　辐照处理
利用北京正负电子对撞机直线加速器 E2 束流打
靶产生的高能混合粒子场 (用 CR 表示) 处理 ZY9 和
ZH7 风干种子。辐照剂量分别为 0、109、145、195、284
和 560Gy ,剂量率为 0104～0122GyΠmin , 每处理 400 粒
种子。用于对比研究的60 Coγ射线处理在中国农业辐
照中心进行 ,处理剂量和种子数量与高能混合粒子场
处理相同 ,剂量率为 0178～1136GyΠmin。
113 　幼苗培养
分别随机选取处理和对照 (未处理种子) 种子各
100 粒 ,3 次重复 ,整齐摆放在发芽盒 (12cm ×12cm) 中
浸湿的滤纸上 ,置于 21 ℃的恒温箱中发芽培养 ,10d 后
测量幼苗苗高和幼根根长。
114 　SSR 分析
采用改进的 CTAB 法[7 ] 提取辐照处理的小麦基因
组 DNA。PCR 扩增反应体系 20μl [8 ] : 1 ×PCR 缓冲液 ;
SSR 引物 ,012μmolΠL ;dNTPs ,200μmilΠL ;MgCl2 ,115mmilΠ
L ; Taq 酶 , 1U ; 模版 DNA , 100ng。PCR 扩增仪 ( PTC2
100 ,MJ Rearch) 。反应程序 : (1) 94 ℃预变性 5min ; (2)
94 ℃变性 45s ,退火 35s ,72 ℃延伸 1min ,35 个循环 ; (3)
72 ℃延伸 10min ,4 ℃保存。退火温度为 50 ℃～60 ℃。
试验共选用 93 对 SSR 引物[9 ] ,平均分布于 21 条染色
体上 ,每条染色体上约 3～5 个位点。引物由上海博亚
公司合成 ,每种引物重复实验两次。PCR 扩增产物采
用变性聚丙烯酰胺凝胶 (6 %)恒功率电泳 ,硝酸银染色
并统计扩增条带。
多态性频率计算公式为 :多态性位点频率 ( %) =
(出现的多态性位点数Π扩增出的总位点数) ×100 %
2 　结果与分析
211 　M1 代种子幼苗生长分析
与对照相比较 ,经高能混合粒子场处理后 ZY9 和
ZH7 M1 代的幼苗高度变矮 ,根长变短 ,幼苗苗高和根
长的损伤率都随剂量的增加而逐渐增加 (图 1) 。CR
处理对小麦造成的损伤比γ射线处理更严重 ,而且
ZH7 所受到的损伤高于 ZY9 ,在 195Gy 剂量时损伤率
就达到 50 % ,而γ射线处理则需要更高的剂量才能达
到这一损伤率。
　　方差分析结果表明 ,在同一剂量下 ,γ射线和 CR
处理对 ZY9 和 ZH7 造成的损伤分别存在显著和极显
　　　
图 1 　CR 和γ射线处理后对小麦 M1 代幼苗苗高与根长的损伤率曲线图 (左图为苗高 ,右图为根长)
Fig. 1 　The damage effects of seedling height and root length in wheat M1 generation irradiated by CR andγ2ray
(left : seedling height ; right : root length)
γ:60Coγ射线 ;CR :高能量混合粒子场。下图表同
γ:60Coγ rays ;CR : mixed high energy particle field. The same as the following figure and table
661 核　农　学　报 20 卷
著差异 ;同种处理方法的不同剂量之间存在极显著差
异。这表明混合粒子场处理具有明显的诱变效应 ,对
M1 代种子幼苗生长的抑制作用大于γ射线处理。
560Gy 剂量组由于处理剂量过高而没有足够的叶片进
行后续的 SSR 分析实验。
212 　SSR 标记分析
21211 　SSR 多态性表现形式 　经混合粒子场辐照处
理之后 ,ZY9 和 ZH7 的对照与 M1 代之间的 SSR 多态
性表现形式主要有 3 种 : (1) 扩增片段数的增多 ; (2)
扩增片段数的减少 ; (3)扩增片段长度的差异。这表明
混合粒子场辐照引起了 ZY9 和 ZH7 M1 代微卫星 DNA
较大的损伤 ,微卫星 DNA 序列发生了较大的变化。
21212 　SSR 多态性的频率分析 　本研究中所选取引
物的扩增带型均清晰稳定且具有可重复性 (如图 2) 。
ZY9 和 ZH7 经混合粒子场辐照处理之后 ,共有 48 对
SSR 引物在对照与 M1 代之间扩增出 55 个位点。其中
13 个位点在对照与 M1 代之间显示出多态性 ,约占总
扩增位点的 23164 %。其中位于 A 基因组上的多态性
位点占 31 % ,B 基因组上的多态性位点占 46 % ,D 基因
组上的多态性位点占 23 % ,可见 B 基因组的微卫星
DNA 对诱变因素较敏感 ,推测 B 基因组可能为小麦
“热点”突变基因组。
图 2 　SSR 引物 Xgwm234 在 ZY9 (左)和 ZH7 (右) M1 代中的扩增结果
Fig. 2 　Binding patterns amplified by primer Xgwm234 in M1 generation of ZY9 (left) and ZH7 (right)
irradiated by CR and F rays
1 :对照 ;2、4、6 和 8 :γ射线处理材料 ;3、5、7 和 9 :CR 处理材料 ,处理剂量分别为 109、145、195 和 284Gy
1 : control ; 2 , 4 , 6 , 8 : M1 generation irradiated byγ2rays ; 3 , 5 , 7 , 9 : M1 generation irradiated by CR ; dosage was 109 , 145 , 195 , 284Gy respectively
表 1 　不同剂量混合粒子场与γ射线处理后小麦 ZY9 和
ZH7 M1 代的 SSR 多态性位点频率分析结果
Table 1 　SSR polymorphic loci rate in M1 generation of
ZY9 and ZH7irradiated by mixed particle field
(CR) and gamma rays
品种 variety 剂量 dose ( Gy) γ CR
ZY9 109 3. 64 7. 27
145 9. 09 10. 91
195 14. 55 21. 82
284 12. 73 9. 09
ZH7 109 3. 64 3. 64
145 10. 91 10. 91
195 5. 45 5. 45
284 3. 64 9. 09
　　如表 1 所示 ,经混合粒子场处理后 ,ZY9 M1 代中
有 10 对 SSR 引物扩增得到 12 个位点 ,多态性位点频
率为 3164 %～21182 % ; ZH7 M1 代中有 9 对 SSR 引物
扩增得到 11 个位点 ,多态性位点频率为 3164 %～
10191 %。当混合粒子场处理剂量为 195Gy 时 ,ZY9 的
SSR 多态性位点频率为 21182 % ,γ射线处理的 SSR 多
态性位点频率为 14155 % ;当混合粒子场处理剂量为
284Gy 时 ,ZH7 的 SSR 多态性位点频率为 9109 % ,γ射
线处理的 SSR 多态性位点频率为 3164 % ,混合粒子场 处理后 M1 代的 SSR 多态性位点频率高于γ射线 ,这表明混合粒子场处理对冬小麦微卫星 DNA 的损伤效应大于γ射线。3 　讨论种子受到辐照后 ,胚细胞特别是分生组织细胞会受到损伤 ,并在种子生长过程中表现出幼苗变矮 ,根长变短等生长抑制[10 ] 。本研究中发现混合粒子场不但抑制了小麦幼苗的生长 ,并且抑制效果大于γ射线。王岳光等发现60 Coγ射线高剂量的抑制作用非常明显 ,但低剂量对小麦生长有一定的促进作用[11 ] 。本试验中γ射线在 109、145Gy 剂量处理时 ,ZH7 M1 代幼根生长比对照根长不但没有降低 ,反而有刺激生长的表现 ,这同前面的研究结果一致。混合粒子场相同剂量的处理中没有这种现象。经混合粒子场处理后 ,小麦染色体受到了损伤 ,M1 代出现了包括环状染色体、染色体断片等多种畸变类型[5 ] 。目前有研究认为水稻经空间诱变处理后其突变株与原种之间存在着不同程度的微卫星多态性[12 ] 。本研究中 ,与对照相比 ,M1 代的 SSR 扩增条带有的减少 ,有的增多 ,还有片段大小的差异 ,这可能是由于辐
761　3 期 高能混合粒子场辐照小麦 M1 代变异的 SSR 分析
射处理后 ,小麦基因组 DNA 发生突变从而导致与 SSR
上下游引物配对的碱基序列发生改变 ,致使扩增片段
增加或减少甚至没有扩增产物 ;同时 ,SSR 上下游引物
之间的碱基插入或缺失 ,致使扩增产物长度发生变化
等。
高睦枪等利用 53 对 SSR 引物对 48 个小麦新品种
进行遗传差异研究 ,认为 B 基因组的等位变异最
多[13 ] ;贾继增等对来自 11 个国家的 15 个小麦品种进
行 RFLP 多态性检测 ,表明六倍体小麦 B 基因组的遗
传多样性最高[14 ] 。本实验中 B 基因组的多态性频率
占总多态性频率的 46 % ,明显高于其他两个基因组 ,
因此 B 基因组对辐照最敏感 ,是小麦 3 个基因组中的
“热点”突变基因组 ,这与先前的研究相吻合。
参考文献 :
[ 1 ] 　刘录祥 ,郑企成. 空间诱变与作物改良. 北京 :原子能出版社 ,1997
[ 2 ] 　Liu Luxiang et al . Crop germplasm enhancement through aerospace
mutation technique , In : Proceedings of International Conference on
Engineering and Technological Sciences 2000 ( Eds by Song Jian and
Wang Maohua) , 356～357 , New World Press , 2000
[ 3 ] 　Liu L , Van Zanten L , et al . Officially Released Mutant Varieties in
China. Mutation Breeding Review , 2004 , 14 : 1～62
[ 4 ] 　刘录祥 ,王　晶 ,等. 作物空间诱变效应及其地面模拟研究进展.
核农学报 ,2004 ,18 (4) :247～251
[ 5 ] 　刘录祥 ,韩微波 ,等. 混合粒子场诱变小麦的细胞学研究. 核农学
报 ,2005 ,19 (5) :327～331
[ 6 ] 　刘录祥 ,赵林姝 ,等. 高能混合粒子场辐照冬小麦生物效应研究.
科学技术与工程 ,2005 ,5 (21) :1642～1645
[ 7 ] 　Micheli M R , Bova R , et al . Reproducible DNA fingerprinting with the
random amplified polymorhic DNA ( RAPD) method. Nucleic Acids
Research , 1994 , 22 : 1921～1922
[ 8 ] 　郭会君. 小麦茎秆强度及其相关性状的 QTL 分析. 中国农业科学
院研究生院 :硕士研究生论文 ,2002
[ 9 ] 　Roder M S , Korzun V , et al . A microsatellite map of wheat . Genetics ,
1998 , 149 : 2007～2023
[10 ] 　徐冠仁. 植物诱变育种. 北京 :中国农业出版社 ,1992
[11 ] 　周　峰 ,易继财 ,等. 水稻空间诱变后代的微卫星多态性分析. 华
南农业大学学报 ,2001 ,22 (4) :55～57
[12 ] 　王岳光 ,孙锡勇 ,等. γ射线照射和离子束注入小麦生物学效应
的研究. 莱阳农学院学报 ,1998 ,15 (4) :258～260
[13 ] 　高睦枪 ,刘冬成 ,等. 我国部分冬小麦新品种 (系) SSR 标记遗传
差异的研究. 农业生物技术学报 ,2001 ,9 (1) :49～54
[14 ] 　贾继增 ,张正斌 ,等. 小麦 21 条染色体 RFLP 作图位点遗传多样
性分析. 中国科学 C辑 ,2001 ,31 (1) :13～21
(上接第 217 页)
扩增分析的。
参考文献 :
[1 ] 　Zietkiewicz E , Rafalski A , Labuda D. Genome fingerprinting by simple
sequence repeat (SSR) 2anchored polymerase chain reaction amplification.
Genomics , 1994 , 20 :176～183
[2 ] 　Bornet B , Branchard M. Nonanchored inter simple sequence repeat
( ISSR ) markers : reproducible and specific tools for genome
fingerprinting. Plant molecular biology reporter ,2001 , 19 : 209～215
[3 ] 　Gupta M , Chyi Y S , Romero2Severson J , et al . Amplification of DNA
markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple2
sequence repeats. Theor Appl Genet , 1994 , 89 :998～1006
[4 ] 　邹喻苹 ,葛 颂 ,王小东. 系统与进化植物学中的分子标记. 北京 :
科学出版社 ,2001
[5 ] 　Tsumura Y, Ohba K, Strauss S. H. Diversity and inheritance of inter
simple sequence repeat polymorphisms in Donglas2fir and sugi
(Cryptomeria japonica) . Theor Appl Genet , 1996 , 92 :40～45
[6 ] 　冯富娟 ,王凤友 ,刘 　彤. 红松 ISSR2PCR 实验系统影响因素. 植
物学通报 , 2004 , 21 (3) : 326～331
861 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (3) :165～168