全 文 ：　文章编号 :100028551 (2000) 0520264204
小麦 D 型细胞质雄性不育系与保持系
叶绿体 DNA 的 RAPD 分析
杨景成 3 　于元杰　齐延芳 3 　沈法富　刘凤珍
(山东农业大学农学系植物遗传工程实验室　山东 泰安　271018)
摘 　要 :将外源λDNA 导入普通小麦品系 814527 ,选出 1 稳定的细胞质雄性不育系 ,
简称 D 型不育系。受体 814527 可以作该不育系的保持系。供体λDNA、受体
814527、D 型不育系及其与鲁麦 14 号的杂种一代叶绿体 DNA 的 RAPD 分析结果显
示 ,D 型不育系及杂种一代有 1 条与供体相同而在受体中不存在的特异带 ,另外有两
条特异带在受体和杂种一代中存在 ,而在不育系中消失 ,这两条带可能与育性有关。
RAPD 分析证明供体 DNA 片段可以整合插入到受体叶绿体基因组中 ,改变原有的基
因表达和调控 ,导致性状变异。
关键词 :小麦 ;细胞质雄性不育 ;DNA ;RAPD 分析
收稿日期 :1999209227
作者简介 :杨景成 ( 　　)3 现工作单位 :山东省农业科学院原子能农业应用研究所 ,济南 ,250100。
细胞质雄性不育 (cytoplasmic male sterility ,cms)是高等植物中普遍存在的一种现象 ,它在
玉米、高粱、水稻等农作物杂交种配制和杂种优势利用上取得了巨大成就。几十年来 ,人们从
遗传学、细胞学、生理生化、分子生物学的角度对细胞质雄性不育机理进行了广泛研究 ,取得了
很大进展[1～5 ] 。
随着分子生物学研究的进展 ,细胞质雄性不育研究进一步深入。许多研究结果表明 cms
与叶绿体基因组 (ctDNA)和线粒体基因组 (mtDNA) 及其表达产物有直接关系。小麦 T 型不
育系研究表明 ,位于 mtDNA 分子上 Cox Ⅰ基因上游的 ORF256 可能与 cms 的产生有关。该
ORF256 只存在于提莫菲维细胞质、小麦 T2cms 和杂种的细胞质中 ,在普通小麦的细胞质中未
发现 ORF256 的存在[6 ,7 ] 。刘一农对小麦雄性不育系及保持系 ctDNA 进行酶切电泳 ,发现二
者存在明显差异 ,认为叶绿体基因组核苷酸序列的变异可能打破叶绿体与细胞核及线粒体之
间的固有平衡 ,从而导致细胞质雄性不育性的形成[8 ] 。
1 　材料与方法
111 　试验材料
λDNA、小麦品系 814527、鲁麦 14 号、D 型不育系及其与鲁麦 14 号的杂种一代均由山东
农业大学农学系植物遗传工程实验室提供。
112 　试验方法
462 　核 农 学 报　2000 ,14 (5) :264～267Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
11211 　叶绿体 DNA 的提取及纯化 　参考刘一农[8 ]方法。
11212 　RAPD 分析 　用 018 %琼脂糖凝胶电泳方法检测 ctDNA 质量 ,用 UV22201 紫外检测
仪测定 DNA 在 230nm、260nm 和 280nm 处的紫外吸收值 ,计算 DNA 纯度和浓度。
PCR扩增所用引物购自中国科学院遗传所。反应条件在 Williams等[9 ]的基础上略有改动。
在 RAPD 反应前将模板 DNA 稀释至 10ng/μl ,准备好以下几种反应液 : 10 ×buffer
(100mM Tris2HCl p H815 , 100mM KCl , 30mM MgCl2 , 011 %gelatia) , 25mM MgCl2 , 215mM
dN TP ,5mM 引物 ,5U/μl Taq 酶。扩增的反应体系为 :10 ×buffer 215μl ,25mM MgCl2 215μl ,
215mM dN TP 115μl ,引物 2μl , Taq 酶 013μl ,模板 DNA 2μl ,ddH2O ,总体积 25μl。
反应在 DNA Thermal Cycler 480PCR 仪上进行。第一循环 ,95 ℃变性 3min ,36 ℃1min ,
72 ℃2min。以下 94 ℃1min ,36 ℃1min ,72 ℃2min ,35 个循环 ,最后 72 ℃延伸 5min。
扩增产物检测是将扩增产物中加入 2μl 溴酚蓝 ,用 114 %琼脂糖凝胶电泳分离 , EB 染色 ,
紫外灯下观察 ,照相。
2 　结果与分析
211 　ctD NA的检测
本试验所提取的受体 814527、D 型不育系及其与鲁麦 14 号杂种一代的 DNA 经紫外检
测 ,测定其在 230nm、260nm 和 280nm 处的紫外吸收值 ,OD260/ OD280 > 118 ,OD260/ OD230 >
210 ,符合 RAPD 分析的要求。
212 　RAPD 分析
实验中共用 130 个引物对供体λDNA、受体 814527、D 型不育系及其与鲁麦 14 号杂种一
代的 ctDNA 进行了扩增。共有 14 个引物在 4 个材料中均不能扩增出产物 ,占全部引物的
11 % ,说明这 14 个引物与模板无同源性。有扩增产物的引物 116 个 ,占全部引物的 89 % ,平
均每个引物产生 314 条带。有 3 个引物能产生多态性片段 ,它们是 OPD22、OPS205、OPX212。
对受体 814527、D 型不育系和杂种一代来说 ,有 97 个引物的扩增产物带型相同 ,占有扩增引
物的 95 % ,说明三者叶绿体基因组存在很高的同源性。
图版 Ⅰ　OPD22 的扩增产物
Plate Ⅰ　Aplified production
of primer OPD202
11 受体 814527 ; 21λDNA ;
31D 型不育系 ; 41 杂种 F1
11receptor 814527 ; 21λDNA ;
31D2type sterile line ; 41F1 图版 Ⅱ　OPS205 的扩增产物Plate Ⅱ　Aplified productionof primer OPD20511 受体 814527 ; 21D 型不育系 ;31 杂种 F111receptor 814527 ; 21D2typesterile line ; 31F1 图版 Ⅲ　OPX212 的扩增产物Plate Ⅲ　Aplified productionof primer OPX21211 受体 814527 ; 21D 型不育系 ;31 杂种 F111receptor 814527 ; 21D2typesterile line ; 31F1
562　5 期 小麦 D 型细胞质雄性不育系与保持系叶绿体 DNA 的 RAPD 分析
　　OPD22 对供体λDNA、受体 814527、D 型不育系和杂种 F1 的扩增结果见图版 Ⅰ。对受体
814527 的扩增产物只有两条主带 ,D 型不育系和杂种 F1 在这两条主带的基础上多了一条与
供体相对应的特异性带。多出的这一条带可能是供体 DNA 片段整合进后代变异体叶绿体基
因组的结果。由于叶绿体基因组是胞质遗传 ,所以杂种 F1 当中也具有这一条带。
OPS205 和 OPX212 的扩增结果见图版 Ⅱ和图版 Ⅲ。与受体 814527、杂种 F1 相比 ,OPS205
对不育系的扩增物少了一条主带 ,在 OPX212 的扩增产物中 ,不育系缺少了一条次主带。受体
814527 和杂种 F1 中均有这两条带 ,而不育系中缺失。据此表明 ,这两条特异带所在位点的基
因很可能是育性表达所必需的 ,它们的缺失会导致雄性败育。
从扩增结果可以看出 ,受体 814527 和不育系的 ctDNA 存在差异 ,不育系和杂种 F1 的
ctDNA 也有差异 ,但要比受体和不育系之间的差异小。
D 型不育系是受体 814527 导入λDNA 后获得的。ctDNA 的 RAPD 分析结果表明 ,不育
系与受体 814527 相比 ,扩增产物增加了一条与受体相对应的特异带 (图版 Ⅰ) ,同时也有特异
带的减少 (图版 Ⅱ、图版 Ⅲ) 。造成这种差异的原因可能是供体 DNA 片段整合进了变异体 (不
育系)叶绿体基因组中 ,使相应区段的序列发生改变 ,在此区段如果发生反应 ,则某些引物的结
合位点相应发生改变 ,从而引起扩增产物的增加或减少。
综上所述 ,RAPD 分析结果初步证明了供体λDNA 的某些片段整合进了变异体 (不育系)
的叶绿体基因组中 ,改变了原有的序列 ,破坏了原有基因的表达和调控 ,打乱了细胞核、叶绿体
和线粒体基因组间的平衡 ,从而导致不育变异体的产生。
3 　讨 　论
细胞质雄性不育是核2质关系不协调而导致的花粉败育。细胞核和细胞质是细胞赖以生
存的两个部分 ,生活细胞具有核遗传系统和细胞质遗传系统 (包括叶绿体遗传系统和线粒体遗
传系统) 。两个系统既相互独立 ,又相互联系、相互渗透、相互影响。在长期进化过程中 ,植物
形成了协调的核2质关系 ,植株发育正常 ,花粉可育。但当细胞质或细胞核遗传系统发生改变
时 ,固有的协调的核2质关系被打破 ,花粉发育过程中核质之间不能正常地进行信息交流 ,导致
花粉败育。
随着分子生物学的发展 ,人们越来越多地关注叶绿体基因组及其翻译产物与 cms 的关系。
刘一农等对玉米、小麦、油菜的不育系与保持系进行了限制性酶切电泳 ,发现 3 种植物的不育
系与保持系 ctDNA 存在差异 ,认为叶绿体基因组核苷酸序列的变异可能破坏了叶绿体与细胞
核以及线粒体之间的固有平衡 ,导致 cms 的产生[8 ] 。李家洋等发现玉米、甜菜和高粱的细胞
质雄性不育系与保持系之间叶绿体类囊体膜多肽存在差异 ,并认为叶绿体类囊体膜多肽的组
成与 cms 可能存在某种联系[10 ] 。刘祚昌对 T 型和 V Ⅱ型小麦离体叶绿体翻译产物的研究发
现 ,两个不育系的叶绿体翻译产物中均比保持系多 1 个 54000 道尔顿的多肽 ,表明小麦 cms 可
能与叶绿体基因组的表达有关[11 ] 。
本研究中 ,对 D 型不育系及其保持系的 ctDNA 进行了 RAPD 分析 ,发现二者存在较大差
异。从而推断与 D 型不育系花粉败育有关的胞质因子可能存在于叶绿体基因组当中。D 型
不育系是外源λDNA 导入受体 814527 而产生的 ,λDNA 导入以后 DNA 片段很可能整合插入
到了叶绿体基因组核苷酸序列中 ,使之发生变异 ,这种变异可能打破了叶绿体与细胞核及线粒
662 核　农　学　报 14 卷
体之间的固有平衡 ,从而导致 cms 的产生。
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ctDNA RAPD ANALYSIS ON D2TYPE CMS LINE OF WHEAT AND ITS MAINTAINER LINE
YAN G Jing2cheng 　YU Yuan2jie 　Q I Yan2fang 　SHEN Fa2fu 　L IU Feng2zhen
( Plant Genetics Engineering L aboratory , Depart ment of A gronomy of S handong A gricult ural
U niversity , Taian , S handong Prov . 271018)
ABSTRACT :A stable cms l ine named D2type cms l ine was obtained after injection of exogenous
λD NA into wheat l ine 814527. Line 814527 can be its maintainer. In order to detect the differ2
ences on molecular level amongλD NA , receptor 814527 , sterile l ine and its F1 hybrid , ctD NA
RAPD analysis was made. The results showed that one specif ic band existed in the doner of the
sterile l ine and its F1 hybrid , but not existed in the receptor. Two specif ic bands existed in the
receptor and F1 hybrid , but disappeared in the sterile l ine. These bands might be related to male
steril ity. It also proved that the D NA fragment of the donor could be integrated into the genome
of receptor , which might disorder the expressing and controll ing of the genes , and then bring
about mutations.
Key words :wheat ; cytoplasmic male sterility ; ctDNA ; RAPD analysis
762Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2000 ,14 (5) :264～267