全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032359205
晚粳稻品种浙粳 22 内稃突变体基因的
遗传分析和基因定位
赵宁春1 　叶胜海1 　汪得凯1 　陆艳婷1 　陈萍萍2 　金庆生1 　张小明1
(11 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所 ,浙江 杭州　310021 ; 21 浙江师范大学化学与生命科学学院 ,浙江 金华　321004)
摘 　要 :晚粳稻品种浙粳 22 内稃突变体是60 Coγ射线对浙粳 22 辐照后选到的内稃约为正常内稃一半大
小的突变体。遗传分析表明 ,该突变性状由 1 对隐性基因控制。该内稃突变体与籼稻珍汕 97 杂交的 F2
群体 ,采用 SSR 分子标记对突变性状基因进行初步遗传定位 ,把内稃突变基因定位在第 9 号染色体上 ,
暂命名为 hig1 ,位于 RM6051 和 RM556 之间 ,遗传距离为 1217cM。
关键词 :水稻 ;内稃突变基因 ;遗传分析 ;基因定位
GENETIC ANALYSIS AND MOLECULAR TAGGING OF A GENE FOR
PALEA MUTANT IN J aponica RICE VARIETY ZHEJING 22
ZHAO Ning2chun1 　YE Sheng2hai1 　WANG De2kai1 　LU Yan2ting1 　CHEN Ping2ping2
Jin Qing2sheng1 　ZHANG Xiao2ming1
(1. Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang 　310021 ;
2. College of Chemistry and Life Sciences , Zhejiang Normal University , Jinhua , Zhejiang 　321004)
Abstract :A rice mutant , which has smaller palea than normal in its floret , was derived from Japonica rice Zhejing 22 by 60 Co
γ2rays irradiation. Genetic analyses indicated that the palea mutant trait was controlled by one pair recessive gene. The gene
was mapped at an interval on rice chromosome 9 flanked by RM6051 on one side , as well as RM566 on the other side , at the
distances of 1217cM based on the SSR markers method by using a F2 population from the mutant ( Japonica)ΠZhenshan 97
( Indica) . The tagged recessive palea mutant gene was temporarily named hig1.
Key words :rice ; palea ; genetic analysis ; gene mapping
收稿日期 :2008211205 　接受日期 :2009201215
基金项目 :浙江省科技厅重点资助项目 (2004C12020 , 2008C22068)和浙江省自然科学基金 ( Y3080479)
作者简介 :赵宁春 (19802) , 女 ,山西临汾人 ,博士 ,研究方向为水稻品质研究及遗传育种。E2mail :nczhao @126. com
通讯作者 :张小明 (19622) ,男 ,浙江杭州人 ,研究员 ,博士 ,主要从事水稻遗传育种研究。E2mail : xmzhang @mail . hz. zj . cn　　水稻是世界上最重要的粮食作物之一 ,也是单子叶植物发育分子生物学研究的理想模式植物。因此 ,对突变体的发育机制进行研究具有重要的理论意义和实用价值。花器官的发育是水稻从营养生长向生殖生长转变的关键标志之一 ,其发育机制的研究远远落后于双子叶植物。近年来 ,随着分子遗传学及分子生物学的迅速发展 ,尤其是通过对拟南芥和金鱼草两种双子叶模式植物的研究 ,有关花器官发育调节与控制的研究取得了重大进展 ,已经初步揭示花器官发育的遗传控制机理 ,并建立了花器官特性基因作用的 ABC 模 型[1 ] ,后来又发展为“ABCD”模型和“ABCE”模型[2～4 ] 。目前 ,通过水稻基因组文库或 cDNA 文库筛选与双子叶植物花器官发育相对应的 MADS 盒基因 ,已经得到 20 多个类似 MADS 盒多基因家族的基因[5～9 ] 。但这些基因大部分都是以双子叶植物基因的保守序列为探针 ,通过同源克隆的方式得到的 ,而不是以突变体为材料的直接鉴定和克隆。水稻花发育突变体是研究相关基因表达与功能的良好材料 ,为研究基因的表达调控与器官形态发生之间的关系提供了一个非常独特的系统。由于水稻的生长周期长 ,且缺乏与性状的直
953　核 农 学 报　2009 ,23 (3) :359～363Journal of Nuclear Agricultural Sciences
接连接点而无法确定这些基因在水稻中的确切功能。
显然 ,没有花器官异常发育的突变体难以开展此项研
究。
目前与花器官发育相关的水稻突变体研究不多。
本研究利用60 Coγ射线对晚粳稻品种浙粳 22 辐射处
理 ,在 M2 代中发现一株内稃突变体 ,其内稃约为正常
内稃的一半 ,种子发育正常。为明确该突变体是否是
一种新的内稃突变体 ,对该突变体进行了遗传分析 ,并
应用 SSR 技术对其进行了初步定位 ,以期为进一步揭
示水稻花器官发育机制提供素材。
1 　材料和方法
111 　材料
常规晚粳稻品种浙粳 22 (单株繁殖的纯系干种
子)经60 Coγ射线以 014kGy 辐照处理后 ,从 M2 代中发
现 1 株内稃突变体 ,经过连续多代种植观察 ,确认该突
变体稳定遗传 ,命名为浙粳 22 内稃突变体。
112 　方法
11211 　群体构建及遗传分析 　2007 年 9 月在浙江省
农业科学院试验农场用内稃突变体作母本 ,珍汕 97、
浙粳 22 (野生型) 为父本配制杂交组合。2008 年冬季
在海南种植杂种 F1 ,单株收获。2008 年夏在浙江省农
业科学院海宁杨渡试验基地种植 F2 ,抽穗后对遗传分
析群体 (突变体Π浙粳 22) 的植株颖壳表型进行调查统
计 ,并进行遗传分析 ;对定位群体 (突变体Π珍汕 97) 中
有突变体表型的植株 ,田间取样。
113 　测定与分析
11311 　水稻总 DNA 的提取 　参见 McCouch[10 ] 的方法
稍作修改。取叶片 012g ,在液氮中研磨成粉放入 2ml
离心管中 ,加入预热的 65 ℃CTAB 抽提液 700μl ,CTAB
抽提液包含 2 % ( WΠV) CTAB、100mmolΠL Tris2HCl
(pH810) 、20mmolΠL EDTA (pH810) 、114molΠL NaCl ,置
65 ℃水浴 30～60min ,期间每隔 10min 轻倒转离心管使
之分散均匀 ,待冷至室温后加入等体积氯仿Π异戊醇
(24 ∶1) , 室温摇动 5min 后于 4 ℃ 12000rΠmin 离心
10min。取上清至另一 115ml 离心管中 , 加等体积
- 20 ℃异丙醇沉淀 DNA。然后 12000rΠmin 离心 10min ,
倒掉上清液 ,加 70 %乙醇洗涤 2 次 ,加入适量的去离
子水溶解 ,4 ℃冰箱暂时保存。
11312 　SSR 分析　SSR 引物参照网上已公布的引物序
列 (http :ΠΠwww1gramene1orgΠ)由上海生物工程技术服务
有限公司合成。PCR 反应总体积 20μl ,包含模板 DNA
1μl、20mmolΠL Mg2 + 2μl ,10mmolΠL dNTPs 014μl、10μmolΠl
的正反向引物各 015μl、10 ×PCR buffer 210μl 和 2UΠμl
Taq DNA 聚合酶 015μl、ddH2O1311μl ; PCR 反应在
Biometra PCR 仪上进行 ,反应条件 : 94 ℃预变性 5min ;
94 ℃30s , 55 ℃ 60s , 72 ℃ 60s , 34 个循环 ; 72 ℃延伸
10min。PCR 扩增产物经 315 %琼脂糖凝胶电泳分离 ,
溴化乙锭染色后于紫外灯下观察并采用 BioRAD 凝胶
成像仪进行数据采集。
11313 　连锁分析 　采用 MAPMAKER 310 软件对分离
群体的内稃突变性状和分子标记分离的数据进行连锁
分析。计算遗传距离 (centiMorgan , cM) ,并进行遗传作
图 ,对突变性状相关的基因进行定位分析。
2 　结果与分析
211 　内稃突变体的性状表现
对内稃突变体的颖壳发育情况进行观察 ,每株随
机选取 10 个颖花 ,发现突变体内稃发育不良 ,约为正
常内稃的一半大小 (图 1) ,但内部花器官与野生型无
明显差异。进一步选取突变体颖壳和野生型颖壳进行
电镜扫描观察 ,发现内稃突变体除内稃较野生型小之
外 ,其它外部颖壳性状与野生型相同。
图 1 　内稃突变体和浙粳 22 野生型的小穗和颖壳表型
Fig. 1 　Florals and paleas of the palea mutant
and wild type of Zhejing 22
WT:野生型 ;MU :内稃突变体 ;Le :外颖 ;
Pa :内稃 ;箭头指示内稃突变体
WT: wild type ; MU : palea mutant ; Le : lemma ; Pa : palea ;
The arrow indicates the palea mutant
212 　内稃突变体的遗传分析
用内稃突变体作母本、浙粳 22 作父本配制杂交组
合 ,种植的 F1 代所有单株的颖壳均表现正常 , 表明内
稃突变性状是受隐性基因控制。通过对 F2 群体单株
颖壳性状统计分析 (表 1) ,表明内稃突变株与正常颖
063 核　农　学　报 23 卷
　　
图 2 　内稃突变体和浙粳 22 野生型颖壳、外稃及浆片的扫描电镜图片
Fig. 2 　Scanning electron micrographs of paleas , lemmas and glume of the paleas mutant and wild type of Zhejing22
A、B :分别为浙粳 22 野生型和内稃突变体的颖壳 ,放大 50 倍数 ;C、D :分别为浙粳 22 野生型和内稃突变体的外稃扫描照片 ,
放大 100 倍数 ; E、F :分别为浙粳 22 野生型和内稃突变体的浆片 ,放大 500 倍数
A , B : paleas of wild2type and mutant , magnified 50 times ; C ,D : lemmas of wild2type and mutant , magnified 100 times ;
E ,F : glume of wild2type and mutant , magnified 500 times
壳株的比例符合 1∶3 的一对基因分离比 (χ2 = 01966 <
3184) ,说明该突变性状受一对隐性基因控制。
表 1 　杂种 F2 群体中正常植株和内稃突变植株性状分离情况
Table 1 　Segregation ratio and test of the mutant trait
in F2 population
组合
cross
内稃突变
表型株数
No1 of
mutant
正常表型
株数
No1 of wild
type plants
χ2 χ20105
内稃突变体Π浙粳 22
mutantΠZhejing22 40 144 01966 3184
213 　内稃突变基因的分子定位
在浙粳 22 内稃突变体为母本 ,珍汕 97 为父本杂
交的 F2 定位群体中 ,选取 77 株有内稃突变性状的单
株作为定位群体进行基因定位。利用分布于水稻 12
条染色体上的 245 对 SSR 引物对浙粳 22 内稃突变体
和珍汕 97 进行分析 ,发现 88 对在 2 个亲本间表现多
态 ,多态性频率为 3519 %。利用这些多态性引物在定
位群体中进行连锁分析 ,发现位于第 9 号染色体上的
SSS标记 RM6051 与该突变性状有基因连锁 ,有 12 个
单交换发生 ,遗传距离为 716cM。进一步通过标记加
密 ,在 RM6051 附近寻找新的 SSR 标记 ,发现 RM566、
RM24324 和 RM3700 与半内稃基因连锁 (图 3) ,分别有
8、12 和 15 个单交换发生 ,遗传距离分别为 511、716 和
917cM ,成功地把基因界定在标记 RM6051 和 RM566 之
间 ,二标记间的遗传距离为 1217cM (局部分子标记连
锁图谱见图 4) ,该内稃突变基因暂命名为 hig1。
3 　讨论
Coen 和 Meyerowitz[11 ]提出了双子叶植物花发育的
163　3 期 晚粳稻品种浙粳 22 内稃突变体基因的遗传分析和基因定位
图 3 　RM566 在亲本和 F2 部分隐性单株间的表现
Fig. 3 　Segregation of RM566 among mutant plants and their parents
P1 :内稃突变体 ;P2 :珍汕 97
P1 : palea mutant ; P2 : Zhenshan97
图 4 　内稃突变基因在水稻第 9 号染色体的部分连锁图
Fig. 4 　SSR map of the palea mutant
gene on chromosome 9
ABC模型 ,认为 A 类基因单独特化形成第 1 轮的花
萼 ,A 和 B 类基因共同作用形成第 2 轮的花瓣 ,B 和 C
类基因共同作用形成第 3 轮的雄蕊 ,而 C 类基因可单
独特化形成第 4 轮的心皮。随后 , Colombo 等 [12 ] 和
Angenent 等[13 ]对 ABC模型进行了补充 ,在矮牵牛中发
现一类具有控制胚珠发育的基因 ,并将它们命名为 D
类功能基因 ,从而使花发育模式发展为 ABCD 模型。
Pelaz 等[14 ]在拟南芥中发现控制第 2、3、4 轮花器官 (花
瓣、雄蕊和心皮) 发育的 E 类基因 (SEP1Π2Π3) ,进一步
扩展了花发育的模型 ,但 E 类基因与 ABCD 各类基因
之间的相互作用关系还不很清楚。
水稻花序的单位是颖花 ,由外稃、内稃、2 枚浆片、
6 枚雄蕊和 1 枚雌蕊组成。在水稻中发现的与花发育
相关的突变体包括与花器官数目有关的突变体 dl、
fon1、fon2 和 fon3[15 ,16 ] 以及内、外稃伸长和叶状化的
1hs1、1h、lrs 和 srs 突变体[17 ,18～20 ] 。罗琼等[21 ] 与 Luo
等[7 ] 报道了内稃缺失突变体 ,该突变体增加了两个类
似浆片状的结构[21 ,22 ] 。本研究中的突变体外稃、雌蕊、
雄蕊发育都正常 ,但内稃较小约为正常的一半 ,与上述
报道的突变体不同 (图 1) 。浙粳 22 内稃突变体 ,经遗
传分析表明 ,其突变性状受一对隐性基因控制 ,形态和
遗传分析表明 hig1 基因可能是水稻的一个新基因。
在大麦 Leayf22lemma 突变体中 ,外稃转变成发育
完全的小叶 ,内稃和其他花器官没有发生改变 ,即在同
一突变体中外稃和内稃受到不同的影响 ,表明大麦的
外稃和内稃是不同的器官[23 ] 。罗琼等对 npa21 突变体
的研究认为水稻外稃和内稃也不是同一器官 ,内稃转
变成了类似浆片的结构 ,与拟南芥 ap121 突变体第一
轮花萼转化成苞叶状结构相似。本试验也表明水稻中
外稃和内稃不是同一器官 ,据此推测外稃和内稃都是
与双子叶植物花萼一致的器官 ,只是不同的花轮转化
而来。基于 RAPIA 是水稻的 API 基因 ,只局限在内
稃、外稃和浆片中表达 ,而雄蕊和雌蕊原基中没有表
达 ,推测 hig1 基因与 A 基因密切相关。
要正确解释这一发育现象 ,还需进一步对突变体
形态发育的早期阶段进行扫描电镜观察、相关基因克
隆 ,并对基因的结构和功能进行研究[24 ] 。利用分子标
记和遗传图谱是定位和克隆相关基因的一种有效方
法。因此 ,本研究在对该突变体进行花器官形态结构
观察和突变性状遗传分析的基础上将与该突变性状相
关的基因定位于第 9 号染色体上 ,为突变基因的精细
定位和遗传机理研究奠定了基础 ,对进一步理解水稻
花器官发育的分子调控机制具有重要意义。
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