全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 052506204
抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及
其免疫学特性鉴定
范国英1 　王建华1 　钟　华2 　杨艳艳3 　邓润广3 　张改平3
(11 西北农林科技大学动物科技学院 ,陕西 杨陵　712100 ;21 河南科技学院动物科学学院 ,河南 新乡　453003 ;
31 河南省农业科学院生物所 ,河南 郑州　450002)
摘 　要 :用 EDC一步法和戊二醛法将 SM 偶联于载体蛋白牛血清白蛋白 (BSA) 和 OVA ,合成免疫原 BSA2
SM和包被原 OVA2SM。用紫外线扫描、SDS2PAGE 进行鉴定 ;用 BSA2SM 免疫 BALBΠC 小鼠 ,用杂交瘤技
术建立分泌 SM mAb 的细胞株 3F92C4 ;对 SM mAb 的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴
定。结果表明 ,BSA2SM 人工抗原分子结合比为 1∶25 ;筛选出 3F92C4 敏感特异的杂交瘤细胞 1 株 ,间接
ELISA 测定细胞培养上清 ,效价为 1∶312 ×102 ,同种型为 IgG2aΠκ;腹水的亲和常数 ( Ka)为 814 ×1011LΠmol ;
IC50为 8199μgΠL ,与双氢链霉素交叉反应为 10916 % ,与其他 SM 结构相似物和功能近似物无交叉反应
性。本试验获得了抗 SM 高价、敏感、特异的 mAb ,可用于 SM 的残留检测。
关键词 :链霉素 ;单克隆抗体 ;免疫学特性
GENERATION AND IMMUNOLOGICAL TRAIT OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR STREPTOMYCIN
FAN Guo2ying1 　WANGJian2hua1 　ZHONG Hua2 　YANG Yan2yan3 　DENG Run2guang3 　ZHANG Gai2ping3
(11 The Animal Science and technology College , Northwest Sci2Tech University of Agriculture and Forestry , Yangling , Shaanxi 　712100 ;
21 The Animal Science College , Henan Institute of Science and Technology , Xinxiang , Henan 　453003 ;
31 Institute of Biology and Technique Science ,Agricultural Academy of Henan Province , Zhengzhou , Henan 　450002)
Abstract :The coating antigen OVA2SM and immunogen BSA2SM synthesized with SM was coupled with BSA and OVA by
EDC2method and glutaraldehyde method. Ultraviolet and SDS2PAGE were used to identify SM artificial antigen. BALBΠC mice
were immunized by BSA2SM , the hybridoma lines that secrete SM mAb were established by using monoclonal antibody
hybridoma technology. The immunological traits such as titer , affinity , sensitivity and specificity of this mAb were
characterized. The results showed that the conjugation ratio of SM to BSA in SM artificial antigen was about 25∶1. The titer of
supernatant hybridoma cell lines of 3F92C4 was 1∶312 ×102 by indirect ELISA. The isotypes in ascites was IgG2aΠκ, the
affinity constant ( Ka) was 814 ×1011LΠmol , IC50 was 8199μgΠL , cross2reactivity to dihydrostreptomycin was 10916 % and
little cross2reactivity to other compounds. The experiment generated SM mAb was high2titer ,sensitivity and specificity. And
this mAb can be used to detecte SM residues in food.
Key words :streptomycin ; monoclonal antibody ;immunological traits
收稿日期 :2006211215
基金项目 :“十五”国家重大科技专项 (001BA804A30)
作者简介 :范国英 (19732) ,女 ,河南焦作人 ,在读博士 ,主要从事动物中毒性及营养代谢性疾病研究。E2mail :fanguoy @163. com
通讯作者 :王建华 (19482) ,男 ,河南南阳人 ,教授 ,主要从事动物中毒性及营养代谢性疾病研究。E2mail :jhwang1948 @sina. com　　链霉素 (SM)属于氨基糖苷类抗生素 ,用于革兰氏阴性菌和结核杆菌感染治疗 ,在治疗家畜感染性疾病中发挥了重要作用 ,但其毒副作用较大[1 ] 。1999 年农 业部在《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定 ,牛奶中链霉素的最高残留限量 (MRL) 为 200μgΠkg[2 ] 。然而 ,相应的链霉素检测技术并不完备 ,由于氨基糖苷抗
605　 核 农 学 报　2007 ,21 (5) :506～509Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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生素缺少发色基团 ,应用 HPLC 分析时常要对其衍生
化 ,设备条件过高 ,难以普及 ;并且其理化测定方法相
当复杂、通用性差[3 ] 。免疫学分析方法具有灵敏、快
速、特异性强、简便等优点 ,已在兽药、农药残留检测领
域广泛应用[4 ] 。本研究旨在为链霉素残留免疫学检测
方法的建立和拥有自主知识产权检测产品技术的开发
奠定基础。
1 　材料与方法
111 　试验材料
SPF 级 6 周 BALBΠC小鼠 ,购自郑州大学医学院实
验动物中心 ,在本实验室饲养。小鼠骨髓瘤细胞株
NS0 由英国国家动物健康研究院惠赠。SM、牛血清白
蛋白 (BSA) 、卵清蛋白 (OVA) 、12乙基232(32二甲基氨基
丙基)碳化二亚胺盐酸盐 ( EDC) 、O2羧甲基羟胺、戊二
醛 ( GA) 、弗氏完全佐剂 ( FCA) 、弗氏不完全佐剂 ( FIA)
等化学试剂均为 Sigma 产品 ,纯度 ≥9910 % ;羊抗鼠酶
标二抗 ( GaMIgG2HRP) 由本实验室制备 ;3 ,3′,5 ,5′2四
甲基联苯胺 (TMB)购自上海华美 ;其他试剂市售所得 ,
均为 AR 级 ;试验用水为超纯水。
准确配制 1gΠL 的 SM 母液 (1g SM 溶于 1L 双蒸水
中) ,根据需要配制标准液 ;洗液 ( PBST) 为含体积比
0105 % Tween220 的 PBS 液 ;包被液 ( CBS) 为 011molΠL
pH916 的碳酸盐缓冲液 ;阻断 ELISA 的封闭液、稀释液
为含体积比 5 %猪血清的 PBST;酶底物为 TMB 的磷酸2柠檬酸缓冲液 ;终止液为 2molΠL 硫酸。
112 　人工抗原的合成与鉴定
11211 　人工抗原的合成　采用 EDC 一步法合成人工
抗原。第 1 步 ,与 O2羧甲基羟胺在 pH 9 的条件下反
应 ,引入羧基 ;第 2 步 ,用 EDC 一步法将 SM 偶联到载
体蛋白 BSA 和 OVA 上。反应液用葡聚糖凝胶
Sephadex G225 柱纯化 ,用 TLC 监测 ,收集 Rf = 0112 组
分 ,制得人工抗原 BSA2SM ,冻干 ,4 ℃保存备用。同样
方法制得包被抗原 OVA2EDC2SM。为消除桥抗对单克
隆细胞筛选的影响 ,同时用戊二醛 ( GA) 方法制备包被
原 SM2GA2OVA。
11212 　人工抗原的鉴定 　(1) UV 鉴定 :用 PBS 配制
SM 和BSA 标准溶液 ,取一定量的BSA2SM 溶于 PBS ,用
Braford 法[5 ] 测定其蛋白质的浓度 ,据此浓度调节 BSA2
SM溶液中蛋白质的浓度 ,使之与 BSA 标准溶液一致 ,
在波长 200～400nm 范围内进行紫外线扫描 ,参照杨利
国等[6 ]方法计算 BSA 与 SM 的分子结合比。(2) SDS2
PAGE鉴定 :参照 Kammps 等[7 ]的方法。
113 　细胞融合用小鼠的筛选
用BSA2SM 免疫 6 周龄 BALBΠC 小鼠 5 只 ,剂量
20μg·200μlΠ只 ,背部皮下分点注射。首免 ,用无菌 PBS
溶解 BSA2SM ,与等量 FCA 混合 ,充分乳化 ;加强免疫 ,
用无菌 PBS 溶解 BSA2SM ,与等量 FIA 混合 ,充分乳化 ,
首免后 4 周进行 ,共免 5 次 ,每次间隔 2～6 周 ,最后 1
次免疫后 10d 断尾采血分离血清 ,用间接 ELISA 检测抗
SM抗体效价 ,若效价 < 116 ×10 - 3即可用于细胞融合 ;超
免 ,最后 1 次加强免疫后 4～30 周 ,细胞融合前 3～5d ,
尾静脉与腹腔各注射BSA2SM 50μg·200μlΠ只。选择对链
霉素效价高 ,且抑制效果较好的小鼠用于融合。
114 　杂交瘤细胞株的建立
11411 　细胞融合　融合过程参照杨利国[6 ] 等的方法。
超免量为 80μgΠ只 ,采用静脉注射和腹腔注射同时进
行。
11412 　杂交瘤细胞株的筛选 　融合细胞共培养 14d ,
在第 10 天用 HT 培养液换液 ,第 14 天开始检测 ,用
RPMI21640 完全培养液补充培养 ;用间接 ELISA 和阻
断 ELISA 进行阳性孔筛选 ,选择强阳性、抑制率高、细
胞生长旺盛的孔转到 24 孔板上扩大培养 ,冻存一部分
细胞后 ,再进行有限稀释克隆化 ,而后再检测、扩大培
养、冻存、鉴定和建株[2 ] 。
115 　SM mAb 的制备及其免疫学特性鉴定
11511 　SM mAb 的制备　体内诱生腹水法。
11512 　SM mAb 免疫学特性鉴定　采用秋水仙素阻断
法[14 ]进行核型分析 ;采用间接 ELISA 检测制备的 SM
mAb 效价 ;按鉴定试剂盒说明进行操作 ;参照 Batty[18 ]
所述方法测定其亲和常数 ( ka) ;阻断 ELISA 测定 SM
mAb 对 SM 的半数抑制 ( IC50 ) ,以 IC50值衡量其敏感性 ;
用氨基糖苷类及其他抗生素类药物作为抑制剂测 SM
mAb 的半数抑制浓度 ,计算其交叉反应率 (CR %) 。
2 　结果与分析
211 　人工抗原鉴定
UV 鉴定 BSA 的特征峰在 278nm ,SM 没有紫外特
征峰 ,两者偶联后 ,其峰与载体蛋白相比没有太大变
化 ,故不能用紫外来计算其偶联率。SDS2PAGE鉴定结
果见图 1。图 1 表明 ,BSA 的泳动速度大于BSA2SM ,说
明BSA2SM 的分子量大于 BSA ,证明偶联成功 ;用紫外
凝胶成像系统分析软件分析得出 ,BSA2SM 的分子量为
710 ×105DL ,BSA 的分子量为 6162 ×105DL ,BSA 与 SM
的分子结合比约为 1∶25。
212 　杂交瘤细胞株的建立
705　5 期 抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定
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图 1 　BSA2SM偶联的 SDS2PAGE鉴定
Fig. 1 　Identification of BSA2SM
conjugation by SDS2PAGE
1 :marker ;2 :BSA ;3 :BSA2SM
细胞融合后 10d 观察融合效果 ,4 块细胞培养板
384 孔中全部有杂交瘤细胞克隆形成 , 融合率为
100 % ;间接 ELISA 检测 ,阳性 13 孔 ,阳性率 317 % ;阻
断 ELISA 筛选 ,3 次克隆化后获得 1 株杂交瘤细胞 ,定
名为 3F92C4 ,并分别测定其 IC50 。多次传代 ,8 次冻存
及复苏 ,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。
213 　SM mAb 免疫学特性鉴定结果
21311 　杂交瘤核型鉴定结果 　NS0 染色体数目为 62
～68 条 ,小鼠脾细胞染色体数目为 40 条 ,本试验获得
的杂交瘤染色体数目为 96～102 条 ,平均 98 条。
21312 　同种型鉴定 　IgG仅有单体形式 ,其重链含有
三个恒定区结构域。小鼠有四个亚类 ,分别为 IgG1、
IgG2a、IgG2b 和 IgG3。用 Pierce 公司的小鼠 mAb 同种
型间接 ELISA 检测试剂盒鉴定 ,本试验所制的单克隆
抗体 F13923F92C4 的同种型为 IgG2aΠκ。
21512 　效价测定结果 　杂交瘤 3F92C4 分泌的抗 SM
mAb 细胞培养上清效价达到了 1∶312 ×102 。阻断
ELISA 测定腹水效价为 1∶112 ×106 ,Batty 法[12 ] 测定其
亲和常数为 814 ×1011LΠmol。
21513 　敏感性鉴定结果 　曲线的回归方程为 y = -
371397 x + 851692 ,根据回归方程计算出 3F92C4 对 SM
的 IC50为 8199μgΠL ,SM 的阻断 ELISA 检测限可确定为
1μgΠL ,本试验所获 mAb 对 SM 具有较高的敏感性。
21515 　特异性鉴定结果　SM 的 IC50为 8199μgΠL ,说明
SM 对其 mAb 结合反应的特异性很强 ;与双氢链霉素
的交叉反应为 10916 % ,与其他抗生素类的交叉反应
率均小于 01001 %(表 1) 。结果表明 ,SM mAb 对 SM 及
其类似物有较好的特异性。
图 2 　阻断 ELISA 检测 SM IC50
Fig. 2 　IC50 inhibitive curve of SM mAb
by competitive ELISA
表 1 　SM与 SM类似化合物的交叉反应
Table 1 　The percent of cross2reactivity of SM
with SM analogous compounds
类似物
analogues
IC50
(μgΠL) 交叉反应率cross2reactivity( %)
双氢链霉素 dihydrostreptomycin 　812 10916
链霉素 streptomycin 8199 100
卡那霉素 kanamycin > 1000 < 01001
庆大霉素 gentamycin > 1000 < 01001
盐霉素 salinomycin > 1000 < 01001
氨苄青霉素 ampicillin > 1000 < 01001
妥布霉素 tobramycin > 1000 < 01001
丁胺卡那霉素 amikacin > 1000 < 01001
萘替米星 netimicin > 1000 < 01001
紫苏霉素 sisomycin > 1000 < 01001
泰勒菌素 taylorella > 1000 < 01001
磺胺嘧啶 sulfadiazine > 1000 < 01001
磺胺二甲氧嘧啶 sulfadimethoxine > 1000 < 01001
磺胺间甲氧嘧啶 sulfamonomethoxine > 1000 < 01001
3 　讨论
完全抗原的制备是建立小分子免疫学分析方法的
基础 ,SM 是小分子化合物 ,分子量 MN = 581126 ,结构
简单 ,不具备免疫原性 ,根据 Landsteiner[9 ] 创立的小分
子半抗原免疫学理论 ,半抗原设计遵循不产生新的抗
原决定簇、间隔臂性质稳定且长度适宜、化学反应简单
易行三个原则 ,选择 SM 上的醛基作为偶联位点 , 用羧
甲基羟胺引入羧基 ,再与载体蛋白上的氨基偶联 ,偶联
率较高 ,免疫原性较好。
Sionf 等[10 ]认为 ,一定长度的间隔臂的介入 ,有助
于半抗原结构的暴露和特异性抗体的产生 ,但是间隔
臂过长可形成新的抗原表位 ,易被细胞识别而产生“桥
抗体”,间隔臂过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞
805 核　农　学　报 21 卷
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对半抗原的识别 ,不产生特异性抗体 ,最好的间隔臂是
3～ 6 个直链碳 , 长度以 5 ～ 8! 为宜。本试验以
N CH3 COO 作间隔臂 ,长度适宜 ,产生了针对
SM的特异性抗体。关于半抗原与载体蛋白的最佳分
子结合比目前尚未形成定论 , Eilange[11 ] 提出最佳分子
结合比为 5～25∶1 ,Schneider 等[12 ] 提出以 10～20∶1 为
好 ,吴松如等[13 ] 认为以 3～45∶1 为好。本试验 SM 与
BSA 的分子结合比为 25 :1 ,并取得了较好的免疫效果。
间隔臂抗体的产生是不可避免的。故在制作多抗
时 ,会产生不能抑制或抑制限较高 ,即使在选用不同的
包被原时 ,亦不能产生很好的结果。故在筛选单抗时 ,
合理筛选程序决定了能否成功地获得 1 株高亲和力的
单抗。本试验采用三种方法同时检测 ,第一步 ,用与免
疫原合成完全相同的方法合成的包被原进行筛选 ,即
可获得目的半抗原抗体和间隔臂抗体 ;第二步 ,用与免
疫原不同的合成方法 ,即对间隔臂不同的包被原进行
筛选 ,获得的阳性孔即为目的半抗原的抗体 ;第三步 ,
同时用两种方法合成的包被原包被作抑制试验 ,抑制
限较低的阳性孔即可进行扩大培养 ,冻存及亚克隆。
本试验成功合成了 SM 人工抗原 ,经 4 次免疫
BALBΠC小鼠后获得了高效价的 pAb ,通过杂交瘤技术
获得 1 株高亲和力和高特异性的杂交瘤细胞 ,经多次
传代、冻存与复苏 ,杂交瘤分泌抗体稳定 ,经鉴定制备
出的 SM mAb 高价、敏感、特异 ,可以用于 SM 残留检测
的免疫学试验。
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