全 文 ：核 农 学 报 2004，18(2)：89—92
Acta Agricuhurae Nucleatae Sinica
文章编号 ：1000—8551(2004)02—089—04
加速器7 Li 注入小麦种胚内靶核反应
的生物学效应
杨俊诚 潘 伟 于伟翔 刘录祥 王 晶 赵林姝
郑企成 赵文荣 白希祥
(1．中国农业科学院土壤肥料研究所 ，北京 100081；2．中国农业科学 院原子能利用研究所 ，北京 100094；
3．中国农业科学院作物科学研究所 ，北京 100081；4．中国原子能科学研究院核物理研究所 ，北京 102413)
摘 要：将加速 器 Li¨ 离子束与生物体内遗传物质发生‘H( Li， Be)n内靶特征核反应诱发核酸
分子结构变化 的机制应 用于生物诱变，辐照剂量在 1．416×10 粒子／crn2—1．416×10 粒子，cIIlz
范围内处理的小麦，观察幼苗叶片细胞亚显微结构 ，发现 离子束注入 引起 了细胞膜的破 裂，细
胞发 生质壁分离，细胞核形状 变得不规则等。 出现叶绿体局部 突起 ，形成 芽状 结构 ；叶绿体基
粒排列散乱，基粒类囊体模糊不清；叶绿体膜破裂，甚至消失；线粒体 出现脊模糊、破裂等 变化。
对幼苗根尖细胞学研究观察，获得单桥、双桥、桥断裂、落后染色体、三级、断片和微核等畸变类
型；对已获得的小麦突变株，分别进行 M，代 DNA分子的 RAPD分析 ，结果发现 DNA均发生变
异，证明 Li¨ 注入通过内靶核反应能够诱发小麦在分子水平上产生遗传变异。
关键词：内靶核反应 ；细胞亚显微结构；根尖细胞；遗传变异
BIoLoGICAL EFFECTS INDUCED BY THE INNER．TARGET REAC n oN
oF ACCELERATED LI IoNS W ITH W HEAT EM_BRYo
YANG Jun．cheng‘ PAN Wei YU Wei．xiang4 LIU Lu．xiang WANG Jing
ZHAO Lin．shu ZHEN Qi．cheng ZHAO Wen．rong BAI Xi．xiang
(1．Institute ofSoil and Fertilizer，Chinese Acndem?ofAgrieuhural Sciences，CAAS，Beijing， 100081；2．Institutefor
ApplicationofAtomic Energy．CAAS，Beijing， 100094；3．InstitueofCrop Sciences，CAAS，Being， 100081；
4．Department ofRadiophysics．China Institute of 4tomic Energ~．Beijing． 102413)
Abstract：Using the mechanism of the nuclear reaction of accelerated Li ions with the inner target in mutant ma—
terial i．e H( Li， Be)n，the biological effects were studied．The wheat seeds were irradiated with the doses ranged
from 1．416×10 ions／cm2 to 1
．
416×10 ions／cm2
． It was found that the cel membrane ruptured，the plasmolysis
occurred，the nucleus shape changed．The serious changes of the chloroplast were as follows：the membrane protu·
berance，the grand disorder，the membrane disappearance，cristae of mitochondrion rupture etc．by checking of the
sub．microstructure of leaf cel1．The single micronucleus and multi·micronucleus were observed at the interphase．
The chromosome aberrational cells including chromosome fragment，lagging chromosome，chromosome bridge an d
circular chromosome were found during the mitosis．RAPD analysis of seedling genomic DNA variation in M2 genera·
tion of three mutants showed their DNA sequences had changed．The result confirmed that the implantation of Li”
ions could induce genetic mutation in wheat．
Key words：Nuclear reaction with inner target；sub·microstructure of cel；chromosome；mutant variation
收稿 日期 ：2003-05-06
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(39870446)
作者简介：杨俊诚(1955 )，男，研究员，主要从事核技术农业应用研究工作。
维普资讯 http://www.cqvip.com
核 农 学 报 l8卷
良种选育是现代农业技术体系的核心。将高新技术应用于主要农作物诱变育种，是选育优 良新品
种(系)的重要手段u 。
在最近 1O多年中，离子辐射 已在许 多重要农作物上进行了试验研究 ，并取得重要进展 。’Li离子与
生物体遗传物质上的 H发生内靶核反应后，造成对 DNA分子难以正确修复的损伤，从而诱发变异，这
种诱变机制完全不同于以往的离子辐射和电离辐射，有可能减少诱变的随机性，提高诱变效率，创造出
其它诱变技术难以获得的突变体 。本文研究了加速器 Li 离子束注入小麦种胚后，小麦叶片细胞
亚显微结构和根尖细胞染色体的辐射生物学效应 ，获得 M，代小麦突变株基因组 DNA分子变异的证据。
1 材料和方法
1．1 试验材料
小麦由中国农业科学院原子能利用研究所辐射遗传育种研究室提供 。
1．2 试验方法
1．2．1 幼苗叶片电镜样品制备和观察 将辐照处理后的种子在25℃恒温箱中培养，第 7d分别剪取辐
照和对照叶片的相同部位 ，切成 1rnm 的小块 ，抽气后在戊二醛溶液 中固定。用磷酸缓冲液冲洗 2h，然
后固定 、脱水 、包埋、聚合 、切片 ，染色观察。
1．2．2．幼苗根尖细胞学观察 种子在25℃催芽 18h后，低温(0～4℃)处理 1～2d，在25℃的恒温箱中培
养，待根长约 1cm时切根放入冰水中进行预处理 24～36h。固定、解离、水洗后，染色压片，镜检观察。
1．2．3 RAPD分析 选择春小麦 F44经离子束注入后的M 代大穗，穗细长稀疏，穗短芒稀疏 3种变异
单株种子及对照。种子在 25℃温室中培养，10d后取材进行基因组 DNA的提取。PCR反应体积为 25 ，
其中含 10×PCR bufer 2．5tA，1．5mmol／L MgC12，dNTP50umol／L，Taq酶 1．5U，引物为0．15umol／L，DNA模板
20ng。扩增产物在 1．2％的琼脂糖凝胶中电泳 ，在紫外凝胶成像系统下扫描照相。
2 结果与讨论
2．1 幼苗叶片细胞亚显微结构的损伤
细胞是组成生物体的基本单位，小麦幼苗形态出现了畸变表明其细胞结构可能受到了损伤。通过
透射电镜法观察了出现畸变的叶片细胞亚显微结构 ，并与正常的叶片细胞 、正常的叶绿体 、正常的线粒
体(图 1-a、b、c)进行了比较。
结果表明，经离子束注入的小麦的叶片亚显微结构出现多种损伤。离子束注入引起了细胞膜的破
裂(图 1-d)，造成一些细胞器进入细胞间隙(图 l—e、f)；很多细胞发生质壁分离(图 1-g)；有的细胞核形状
变得不规则 ，局部突起形成芽状(图 1．e)。
在所观察到的异常结构中，出现最多的是叶绿体的结构异常。有的叶绿体形状发生改变，局部出现
突起，形成芽状结构(图 1-h)。有的叶绿体基粒排列散乱，基粒类囊体模糊不清(图 1-i)，叶绿体膜破裂，
甚至消失(图 1．i)，内容物散布在原生质体中(图 1-k)。这些叶绿体结构的异常造成了小麦的主脉失绿。
线粒体出现脊模糊、破裂(图 1．1)等变化。
以上观察结果表明，离子束注入会损伤细胞的结构，这些结构的损伤就会影响细胞的正常代谢等功
能 ，进而影响小麦的生长。
2．2 细胞生物学效应
经辐照处理后根尖细胞在细胞分裂期观察到单微核(图 1．ITI)、多微核(图 1-n)等核畸变类型；在有
丝分裂期，染色体发生多种类型的畸变，包括染色体断片(图 1．o)、落后染色体(图3-p)、染色体桥(图 1一
q，图 1一r)、落后染色体 +桥(图 1．s)和环状染色体(图 1-t、u)等。辐照剂量在 1．416×10m粒子／cm2—
1．416×10 粒子，cIn2范围内均出现 了这些类型的畸变。
维普资讯 http://www.cqvip.com
2期 加速器 Li 注入小麦种胚内靶核反应的生物学效应 9l
k m n 0
图 l 畸变株叶片细胞亚显微结构变化
Fig．1 Changes of cel in sub．microstructure
a：为正常细胞(×2ooo)；b：为正常叶绿体(×25000)；c：为正常线粒体(×4oooo)；d：为细胞膜破裂
(×2500)；e：为细胞核形状异常，叶绿体进入细胞间隙，膜消失(×4ooo)；f：为线粒体进入细胞问骧
(×25000)；g：为细胞质壁分离(×12000)：h：为叶绿体膜突起(×12000)；i：为叶绿体基粒捧列散乱
(×12000)；j：为叶绿体膜消失(×25000)；k：为叶绿体膜消失。内含物溢出(×12ooo)；l：为线粒体脊
破裂(×4OOOO)；m：为单微核；n：为多微核；o：为正常的有丝分裂后期；P：为染色体断片；q：为落后
染色体 ’r．S：为染色体桥；t：为落后染色体 +桥；U：为环状染色体
a：leaf cell of control；b：chloroplast of control；C：mitochondria of control；d：cell membrane rupture；e：nuele-
US shape change，chloroplast being out of cell，membrane disappearance；f：mitochondria beil1g out of cell；g：
plasmolysis；h：chloroplast memb rane protuberance；i：glana disorder；j：e~omplmt membrane dim ；
k：chloroplast memb rane disappearance，inclusion dispersing in cytoplasm；l：cristae of mltochondrion nlpt．1Ie；
m ：single micronucleus；n：multi-micmnuclei；0：normal anaphase；P：chromosome fragn~nts；q：la chro-
mosome；r。s：chromosome bridge；t：lagging chromosome+bridge；U：eircular chromosome
⋯． 一
¨
维普资讯 http://www.cqvip.com
92 Aeta Agr／cu／／urae Nudeame S／n／ca
2004，18(2)：89—92
2．3 M2代突变株 DNA分子随机扩增多态性分析
本试验采用春小麦 F44的 M 代群体中3种穗型变异(大穗、穗细长稀疏、穗短芒稀疏)小麦产生的
种子以及对照种子，利用 RAPD技术分析其基因组变异，为 Li 离子束注入小麦的诱变机制研究提供科
学依据。从 OPJ系列的 20种 lObp随机引物 中筛选出可得到清晰扩增产物 ，重复性好 的 l6种随机引物
(见表 1)进行 RAPD分析 。所用的 Marker为 Lambda DNA／ Ⅲ+EcoR I。
表 1 所用 l6种引物的序 列
Table 1 Sequences of 1 6primers
大穗型变异株的 RAPD分析结果表明 ，OPJ一12、OPJ一15两种引物能够扩增出多态 的 DNA片断(图 2一
a)。OPJ一12在处理组 中多扩增出了 1200bp和 83lbp片段。OPJ一15在处理组 中多扩增出了 1700bp、941bp
和 83lbp片段。穗细长稀疏型变异株的 RAPD分析结果表明，OPJ一10引物能够扩增 出多态的 DNA片断
(图 2-b)。它在处理组 中多扩增 出了 268bp片段 ，缺失了 1587bp、648bp和 150bp片段。
穗短芒稀疏变异株的 RAPD分析结果表明，OPJ一4、OPJ一12和 OPJ一15等 3种引物能够扩增 出多态的
DNA片断(图 2-e)。OPJ一4在处理组中多扩增出了 1320bp、880bp、820bp和 468bp片段 ，缺失 了 1593bp片
段。OPJ一12在处理组 中的扩增缺失 了 468bp片段。OPJ一15在处理组 中多扩增出了 885bp片段 ，缺失 了
529bp片段。
3 结论
a● b
图2 变异株的 RAPD扩增结果
Fig．2 RAPD pattern of mutant
a ：A为对照 ，B为大穗型变异株；b ：A为对照 ，
B为穗 细长稀疏变异株．；C ：A为对照 ，B为穗短
芒稀疏变异株
a 。 ：A is control，B is mutant with big spike，M is
Marker； b ：A is control，B is mutant with slender
spike and spo2"Se grains；c ：A is control，B is mutant
with short awn an d spo2"Se grains
3．1 Li 离子束注入小麦种子能引起小麦幼苗叶片细胞的亚显微结构 出现异 常，包括细胞膜破裂、质
壁分离、叶绿体和线粒体结构破坏，细胞核形状改变等。离子束注入会造成细胞结构的损伤，影响细胞
的正常代谢等功能，从而影响小麦的正常生长。
3．2 根尖细胞在细胞分裂间期出现了单微核，多微核等类型的核畸变，在有丝分裂期，出现了染色体断
片、落后染色体、染色体桥、染色体桥 +落后和环状染色体等类型的畸变。当剂量在 1．416×10m粒子，
cm
2
～ 1．416×10 粒子，crn2范围内，细胞分裂间期的微核畸变率与分裂期的染色体畸变率具有显著的正
相关性，可利用单微核畸变率研究离子束注入对染色体的损伤 。
3．3 用 RAPD技术分析了3种小麦变异株的 M 代幼苗基因组，结果表明其 DNA的 RAPD扩增结果与
对照相比均发生变化。这可能是由于引物的互补位点发生了突变，导致互补位点增加或减少，从而使扩
增片段增加或减少造成的；也有可能是由于互补位点之间 DNA发生了插入或缺失，使扩增产物大小发
生了变化。总之， Li 离子束注入能够导致小麦基因组 DNA发生突变，诱发小麦产生遗传变异。
参考文献 ： (下转 147页)
维普资讯 http://www.cqvip.com
Acta Agriculturae Nucleatae Sinica 1 47
2004，18(2)：142—147
条件下，两种供试水稻土上的保氮复合碳铵可使氮肥的挥发损失减少 5．25％～9．12％。
2．2．2 保氮复合碳铵能提高作物氮肥利用率 石灰性的灰潮土水稻土 ，中性的黄棕壤水稻土及鄂东沙泥
土旱地土上 ，等氮量或等肥量的保氮复合碳铵与碳铵相比，对水稻，棉花均能提高氮肥利用率。分别提高
早稻和中稻对氮肥的利用率 1O．95％ ～15．O1％，提高棉花的氮肥利用率7．77％(表 1O、表 11)。
表 ll 保 氦复合碳铵对棉花氮肥利用率的影响
Table l1 Influence of NPCAB on N use efficiency by coton
参考文献 ：
[1] 郎家文．保氮增效剂调节氮肥施用量和利用率研究．资源开发与保护，1991(7)：179
[2] 倪竹如，碳铵添加硝化抑制剂对玉米吸收氮素的影响．核农学通报．1994，15(4)：185
[3] 柴永山．玉米施肥方式与保氮剂应用的研究．玉米科学．1995，3(3)：62
[4] 中国科学院遗传研究所，DF型碳铵增效添加剂．农业科技要闻．1993．(5)，4
[5] 温贤芳，等．应用同位素 N标记肥料研究作物对几种化肥利用和硝化抑制剂的作用．原子能农业应用，1981(1)：30
- - 一 ● ● 一 - - ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ● ⋯ ● 一 ⋯ ● ● ● ●
(上接 第 92页)
[1 j Maluszynski M，Nichterlein K，et a1．Oficialy released mutant、arieties．The FAO／IAEA Database．Mutation Breeding Review，2000，12：1—3
[2] 徐冠仁．植物诱变育种学 北京：中国农业出版社，1996，1—18，112，410～448
[3 余增亮，霍裕平．离子注入生物学研究述评．安徽农业大学学报．1994．21(3)：221～225
[4] 杨剑波，吴李君，李莉，等．离子束辐照 M13mpl8一DNA(RFI)诱导lacZ突变的序列分析．中国科学(B辑)，1995，25(12)：1273～1278
[5] 朱凤绥，卫俊智，孙元枢等．N 离子引起的黑麦染色体易位．作物学报，1993，19(4)：299～302
[6] 朱凤绥，卫俊智，陆挺．N 离子注入的生物效应和机理研究．作物杂志，1992(3)：8—9
【7] Schaefer A．Free radical from polyerystalline pyrimidines and pruines upon heavy ion bombardment at low temperatures：8／1 electron spin resonance
study．Int J Radiat Biol，1993，63(2)：139—149
[8] Scholz M，Riter S，Kraft G．Analysts of chromosome damage based on the time COUl~3e of aberations．Int．J Radiat Biol，1998，74(3)：325～331
[9] Rydberg B，Lobfieh M，Coper P K．DNA Double—strand breaks induced by high—energy Neon and Iron ions in human fibmblasts．I．Pulsed—field
gel electrophoreses method．Radiat Res，1994，139：133— 141
[10] Rydberg B．Clusters of DNA damage induced by ionizing radiation：formation of shout DNA fragments．1I．Experimental detection．Radiat Res，
1996，145：200—209
[11] Dizdaroglu M．Formation of an 8-hydroxyguanine moiety in DNA on y-iradiation in aqueous solution．Biochem，1985，24：4476～4481
[12] Yamaguehi H，Tatara A，Nalto T．Unscheduled DNA synthesis induced in barley seeds by gamma ray and 4-nitroguinoline 1-oxide．Jpn J Genetics．
1975，50(4)：307 3l8
维普资讯 http://www.cqvip.com