全 文 ：158
文章编号 ：1000—8551(2004)02—158—03
核 农 学 报 2004，18(2)：158 160
Acta Agric~turaeNudeatae Sinica
抗链霉素单克隆抗体的制备和鉴定
王 谦 齐孟文 何方洋 杨根海 曲 勃
(中国农业大学 ，北京 100094)
摘 要：用 CDI法合成链霉素全抗原，免疫 BALB／c小鼠，采用杂交瘤技 术得到 了一株 能稳定分
泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞。经ELISA鉴定，sM—McAb为IgG1类；细胞培养上清的
效价达 104以上，腹水的达 10 以上；与双氢链霉素交叉反应率为200％，与庆大霉素、卡那霉
素无 交叉反应。
关键词：链霉素；单克隆抗体；酶联免疫
PREPARATIoN AND IDENTIFICATIoN oF M oN0CLoNAL
ANTIBoDIES AGAINST STRE盯 oMYCIN
WANG Qian QI Meng·-wen HE Fang—-yang YANG Gen·-hai QU Qing
(China Agricultural Uniz emit)，Beijing 100094)
Abstract：The antigen of streptomycin synthesized by CDI reaction was used for preparation of a hybridoma cell line
which secretes monoclonal antibodies against streptomycin．The antibody was characterized by IgGl isotype，the titers
of antibody in cel supematant and ascites were 1：10 and 1：1 0 ，respectively．The antibody against streptomycin
was selective toward dihydIDstI ptomycin with cross—reactivit
．
y of about 200％ ，and．wasn’t detective cross—reactivity
toward gentamicin and kalamycin．
Key words：streptomycin；monoclonal antibody；ELISA
链霉素(Streptomycin，SM)是一种重要的氨基糖苷类抗生素，由美国瓦克斯曼研究所于 1945年研制
成功，临床中主要用于结核菌感染的治疗 ，后来发现其存在严重的耳及肾毒性，因此治疗作用已逐渐
被其它新药所取代 ，但在畜禽疾病防治方面，仍是常用药物之一。链霉素对鸡、羊、牛、猪的各类炎症，
如鸡传染性鼻炎、猪急性支气管炎、猪白痢、奶牛子宫内膜炎等有很好的疗效，因此经常作为饲料添加剂
使用 。具有药物史的畜禽产品有可能含有链霉素残留，对消费者的健康构成潜在危害，因此，建立有效
的检测方法对于保障畜产品安全具有重要意义。目前链霉素残留的检测主要有仪器分析和免疫分析两
种方法，其中酶联免疫吸附分析(ELISA)，具有简便、快捷、灵敏和成本低廉及现场检测的优点，尤其适合
在生产和流通过程对畜禽产品的药物残 留进行检测。本研究旨在应用杂交瘤技术建立能稳定分泌抗链
霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为下一步的链霉素 ELISA试剂盒开发奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料
链霉素购于北京生物制品检定所；聚乙二醇(PEG)、羧 甲基羟胺(CMO)、牛血清白蛋 白(BSA)、卵清
蛋自( ! 旦 的羊抗鼠 IgG、羊抗鼠 IgG亚类抗体、HRP标记的兔抗羊 IgG，购于 Sigma公司；
收稿日期 ：2003—03—24
作者简介：王谦(1978一)，男，江西铜鼓人，硕士，从事免疫测定方法研究。
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2期 抗链霉素单克隆抗体的制备和鉴定 l59
BALB／c小鼠购于中国科学院遗传研究所；SP2／0骨髓瘤细胞为中国农业大学核技术农业应用实验室保
存 。
1．2 方法
1．2．1 sM全抗原的合成与鉴定 SM．肟的合成：取 81．3mg sM及 13．2mg CMO溶于34ota双蒸水，加
入 1．4mg醋酸钠，室温搅拌反应 24h。
SM．BSA的合成：取 170td SM．肟及 100mg EDC溶于20％的乙醇溶液中，加入 51．6mg BSA(溶于 1ml
双蒸水中)，室温缓慢搅拌反应 24h，用 0．02M pH7．2的磷酸缓冲液透析两天，分装且 4℃保存。包被抗
原 SM．OVA同法合成。
偶联比率测定：光谱法测定 SM．BSA、SM．OVA、SM、BSA及 OVA的吸光值，按文献所引公式b 计算偶
联 比率 。
1．2．2
．动物免疫 选 6～8周龄雌性 BALB／c小鼠。取 sM．BSA偶联物，20tg／只小鼠，加生理盐水到
50 ，与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按 100tal1只进行初免，颈部、皮下多点注射，以后乳化改用弗氏不完
全佐剂 ，每隔 2周 ，与初免同样剂量加强免疫 。于三免后 7d采血 ，用间接竞争性 ELISA检测血清效价 ，
选择抗血清效价高、链霉素竞争抑制强的小鼠脾脏进行细胞融合，融合前 3d腹腔免疫 1次，不加佐剂。
1．2．3 杂交瘤细胞制备和筛选 参照杨利 国等的方法 ，按免疫鼠脾细胞与 SP2／0骨髓瘤细胞 1：5的
比例混合细胞，用 50％PEG促融，HAT培养基筛选融合细胞，间接非竞争性 ELISA挑选阳性孔，间接竞
争性 ELISA进一步筛选细胞株 J¨，有限稀释法进行克隆。
1．2．4 腹水 McAb的制备 BALB／c小鼠腹腔注射灭菌的液体石蜡，0．5ml／只，7～17d后同法注射单克
隆细胞 1×10 ～2×10 个(0．5ml／只)，10d后抽取腹水 ，离心除去油脂沉淀后 ，即得小鼠腹水 McAb。
1．2．5 抗 SM．McAb的特性鉴定
效价测定 ：细胞培养上清 McAb(或腹水 McAb)作连续 10倍梯度稀释 ，加入被 SM．OVA包被的酶标
板中，再加 HRP标记的羊抗鼠 IgG。设阳性对照(阳性小鼠血清)、阴性对照(骨髓瘤细胞培养上清)、空
白对照(蒸馏水)各两孔。检测结果以A值(630nm／450nm)大于或等于阴性对照的3倍为阳性。以阳性
孔相应的最高稀释倍数为效价。
50％抑制浓度(IC如)：用 sM．OVA包被酶标板，加入稀释后的腹水，分~JIJJjn入 5、10、20、50、100、200rig／
rnl的链霉素标准品做间接竞争 ELISA测定，与零标准品比较，OD值降低到一半所对应的标准品浓度即
为 Ic ，并以Ic 作为灵敏度。
特异性鉴定：用链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、卡那霉素做竞争性 ELISA，以其它抗生素与 SM．
McAb的交叉反应率，即链霉素的 Ic 除以其它抗生素的 Ic 的百分数，作为特异性指标。
IgG亚类鉴定：采用 ELISA方法。在包被好 SM．OVA的聚苯乙烯板中依次加入单克隆细胞培养上
清，羊抗鼠I 亚类的二抗及 HRP标记的兔抗羊三抗，温育显色，酶标仪读取 A值(630nnd450nm)，以相
应的阳性孔相应判定抗血清的 IgG。
2 结果和讨论
2．1 抗原及融合鼠的选择
经光谱法测定和计算，SM．BSA、SM．OVA中 SM与 BSA及 OVA的偶联率分别为 1：15和1：12；，SM—
BSA、SM．OVA的蛋白浓度分别为 14．6mg／ml和8mg／ml。三免后，采集免疫鼠血清，确定包被 SM．OVA的
浓度和不同血清的稀释度，在确定的条件下，用间接竞争性 ELISA测定抗小鼠抗血清的Ic 值，结果见
表 1。由表 1可见 ，选择 Ic 最小鼠 6号 鼠做融合。
2．3 单克隆抗体特性鉴定
2．3．1 细胞培养上清和腹水效价 采用竞争性 ELISA筛选，经过 3次克隆后发现 3B。．c9．c，细胞株的
Ic∞最小，扩大培养后打腹水。倍比稀释后 ELISA法测定效价(1：80000 SM．OVA包板，1：5000酶标二
抗)。实验得阴性对照平均 A值为0．052，所以细胞培养上清效价达 10 以上，腹水则达 10。以上(图 1)。
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Acta Agriculturae Nudeatae S／n／ca
2004，tg(2)：158～160
表 1 小 鼠抗血清 间接竞争性 ELISA对链霉素 的 ICSO值
Table 1 IC50 of mouse serum indirectly—competed—ELISA toward streptomycin (OD)
图 1 ELISA法测定细胞培养上清及腹水效价
Fig．1 ELISA titers of cell supemate and ascites
图 2 几种抗生 素对 SM McAb的竞 争性 ELISA
Fig．2 ELISA of several antibiotics
2．3．2 灵敏度及特异性测定 以3B 一C。一C 细胞株的腹水抗体做竞争性 ELISA，测定链霉素、双氢链霉
素 、庆大霉素、卡那霉素的50％抑制浓度(IC 。)。由图 2可以得出，链霉素 IC 为 20ng，双氢链霉素 IC 为
10ng左右 ，庆大霉素和卡那霉素 IC 均远远大于 100ng：计算表明双氢链霉素对链霉素的交叉反应率为
200％，而庆大霉素和卡那霉素的交又反应率均小于 0．001 同类药物双氢链霉素对制备的 SM—McAb有
甚之更大的交叉反应，而其它类抗生素与其交叉反应均很小 ，考虑到双氢链霉素同样列为兽用安检药 ，
因此，所制备的 SM McAb可用于建立链霉素及双氢链霉素残留的 ELISA检测。
2．3．3 3B，一C。一C 细胞株分泌的单抗亚类鉴定 ELISA法检测 3B，一C ．C 细胞株分泌 的抗体亚类 ，结果
为 IgG．。
表 2 抗体亚类鉴定
Table 2 Identification of antibody isotype
王春奕等用微生物法在鸡蛋中检出链霉素最高残留量达 0．7mg／kg，检出率为 20％ 。马北莉等在
猪 肾和猪脾脏中检出严重超标的链霉素(分别为 1．44和 1．56mg／kg)，检 出率分别为 94．6％和 100％ 。
吴国娟等年对北京市售消毒纯牛奶中抗菌药物残留情况做了检测，在随机采集的50份样品中，链霉素
阳性率为 22％，是所检抗生素中检出率最高的 。而按农业部 2001年发布实施的无公害食品的行业标
准中牛奶的卫生要求，链霉素最高允许残留标准为 200ng／ml(牛奶)。由此看来，链霉素滥用还是比较普
遍的问题，建立一种准确、快速的监测方法势在必行。本试验已成功建立起一株能稳定分泌抗链霉素和
双氢链霉素的单克隆抗体 ，且特异性较好 ，为链霉素 ELISA检测试剂盒的开发奠定 了基础。
参考文献：
(下转第 157页)
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Acta agricdturae Nucleatae Sinica 157
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食糜内 s与非氨态氮比例、食糜微生物部分 s与非氮态氮比例及食糜氮在消化道内的流通量，即可计
算出微生物氮产量 ，是一种直接测定方法。而尿液嘌呤衍生物法，是通过测定尿液中嘌呤衍生物含
量，利用经验公式计算微生物氮产量，是一种间接方法。由此可见，尿液嘌呤衍生物法对微生物氮估测
结果依赖于经验公式。P6rez 研究表明，嘌呤衍生物法较 N法估测的微生物氮合成量低。由于利用
嘌呤衍生物估测微生物氮合成不需要瘘管动物，收集尿液即可测定，使其在生产中大规模估测微生物氮
合成量成为可能，特别适用于比较研究u 。
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