全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 042255204
水稻类病变突变体 lmm1 的诱发与初步分析
王忠华1 ,2 　贾育林2
(11 浙江万里学院生物技术研究所 , 浙江 宁波　315100 ; 21USDA2ARS Dale Bumpers National Rice Research Center , Stuttgart , AR 　72160)
摘 　要 :用 110 %化学诱变剂 EMS 处理抗稻瘟病水稻品种 Katy ,获得一个水稻类病变坏死突变体 ,命名为
lmm1。与对照 Katy 相比 ,该突变体的主要农艺性状表型发生了显著变异 :植株变矮 ,分蘖数和千粒重显
著减少。遗传学分析研究表明 ,该突变为单基因细胞核隐性突变。经稻瘟病与纹枯病真菌人工接种实
验 ,结果表明该突变体比对照 Katy 具有更强的广谱抗性 ,表明 lmm1 对于提高水稻广谱抗性具有一定的
价值。
关键词 :水稻 ;类病变突变体 ;诱发 ;评价
INDUCTION AND PRELIMINARY ANALYSIS OF A RICE LESION MIMIC MUTANT lmm1
WANG Zhong2hua1 ,2 　J IA Yu2lin2
(11 Institute of Biotechnology , Zhejiang Wanli University , Ningbo , Zhejiang 　315100 ;
21 USDA2ARS Dale Bumpers National Rice Research Center , Stuttgart , AR 72160 , USA)
Abstract :A lesion mimic mutant of rice ( Oryza sativa L. ) , named as lmm1 , was induced from a Japonica rice variety Katy
with 110 % ethyl methane2sulfonate ( EMS) treatment . Phenotype of mutant was comparatively characterized along with the
original parent Katy. The height , the number of tillers and one2thousand2grain weight of mutant were significantly reduced
compared with those of Katy. Genetic analysis indicated that the mutation is controlled by single recessive gene. Pathogenicity
test showed that the mutant exhibited significant enhanced resistance to rice blast and sheath blight . The results suggest that
the lesion mimic mutation in rice be involved in disease resistance , and cloning of the gene may provide a clue to developing
broad2spectrum resistance to diverse pathogens.
Key words :rice ( Oryza sativa L. ) ; lesion mimic mutant ; induction ; evaluation
收稿日期 :2005209219
基金项目 :浙江省教育厅专项任务基金 (20050218)
作者简介 :王忠华 (19722) , 男 , 浙江开化人 , 博士、副教授 , 主要从事植物诱变与生物技术研究。Tel & Fax : 0574 88222851 ; Email : wang1972 @
zwu. edu. cn
　　研究发现 ,在无明显逆境、损伤或病原物侵染等条
件下 ,植物叶片或叶鞘能自发形成坏死斑 ,其症状与病
原菌侵染后形成的病斑非常相近。人们将这类表型称
为类病变 ,突变体被称为类病变坏死突变体 ( lesion
mimic or lesion resembling disease mutant) [1 ] 。目前 ,在拟
南芥、玉米、大麦和水稻等植物中均已发现这类突变
体[2 ,3 ] 。根据该类突变体的表型 ,又可将其细分为扩散
型 (Propagation class)和起始型 ( Initiation class) 2 类[3～5 ] 。
其中前者又称蔓延型突变体 ,是指叶片某一点的细胞
坏死一旦产生 ,便很快扩散到整个叶片甚至茎杆或整
个植株中。玉米中获得的致死性叶斑 (lethal leaf spot ,
lls1)突变体[6 ]及在拟南芥中诱发获得的对细胞死亡控
制减弱的模仿抗病坏死 ( lesions simulating disease
resistance response , lsd ) 突 变 体 和 加 速 细 胞 死 亡
(accelerated cell death , acd) 突变体[7～12 ] 都属于蔓延型
类病变突变体。除玉米与拟南芥外 ,目前在水稻中也
发现和诱发产生了该类突变体 ,包括自发形成和人工
诱变的坏死 (Sekiguchi lethal , Sl) 突变体[13～15 ] 、lmi 突变
体[16 ]和 lrd 突变体[17 ] 等。而起始型突变体是指在植
物未受到病原物侵染时 ,细胞坏死就能自发和随机在
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叶片或植株中形成特定大小的坏死斑。目前在大麦中
获得的 mlo 突变体和玉米中诱发产生的 23 个显性功
能获得型类病变突变体中的绝大多数都属于该类突变
体[18 ,19 ] 。遗传分析结果表明 ,前者一般以隐性方式遗
传 ,而后者则以显性方式遗传[20 ] 。
本研究利用不同浓度化学诱变剂 EMS 处理高抗
稻瘟病水稻品种 Katy 干种子 ,获得一个水稻类病变坏
死突变体 lmm1 ,并对其遗传特征与抗病反应进行了初
步研究。
1 　材料与方法
111 　供试材料
选用美国南部主要水稻品种 Katy 为材料 ,它是由
美国阿肯色大学农业研究和推广中心的 Moldenhauer
等人选育成功的抗稻瘟病粳稻品种[21 ] 。
112 　诱变处理与突变体筛选
分别用 018 %、110 %和 112 % EMS 处理 50g 干种
子 48h。将 M1 种子直播在美国国家水稻研究中心试
验田中 ,成熟后单株收获 M2 。突变体筛选在美国国家
水稻研究中心的温室进行。每个单株选取 3～5 粒饱
满、健康的种子 ,置于带水的 115ml 离心管中 ,在 30 ℃
恒温箱中进行浸种催芽。2d 后取出 ,再移栽到温室的
试验小区中 (生长条件 :温度 24 ℃～30 ℃,光照每天
16h) 。3～4 周后 (4 叶期) ,用稻瘟病菌株 ZN19 进行稻
瘟病真菌人工接种 ,方法参照 Valent 等[22 ] 的标准喷雾
接种法进行。接种完成 1 周内调查结果 ,获得一个水
稻抗病突变体 ,随后该突变体出现类似于病变的坏死。
将其种子收获后 ,继续对抗病突变体进行浸种催芽、移
栽与跟踪观察 ,发现不经接种处理也会出现类似于病
变的坏死症状。经过连续加代 2 次 ,获得能稳定遗传
的纯合突变体。
113 　农艺性状调查
分别选取 10～20 粒饱满、健康的纯合突变体
lmm1 和对照 Katy 种子 ,均匀置于带浸润滤纸的培养
皿内 ,将培养皿转到 30 ℃恒温箱中进行浸种催芽。2d
后取出 ,移栽到温室的大盆钵中 ,盆钵中的土必须先进
行消毒。种 10 钵 ,每钵种 1 株。成熟前在温室观察与
测定播始历期 (自播种至见穗历期) 、株高和单株分蘖
数 ;成熟后在室内测定千粒重。
114 　突变体遗传分析
分别以纯合突变体 lmm1 与对照 Katy 为亲本进行
正反交试验。杂交时 ,选取正处于开花期的亲本稻穗 ,
用 44 ℃温水去雄 ,再用另一亲本花粉进行授粉。收获
F1 代种子 ,按上述方法进行催芽浸种与移栽 ,自交留
种。
115 　抗病性测试与组织化学分析
稻瘟病菌和纹枯病菌系由阿肯色大学植物病理学
家 Fleet 博士提供 ,都是美国水稻主产地的优势生理小
种 ,致病能力较强。特别是稻瘟病菌 ZN19 和 IH1 对抗
稻瘟病品种 Katy 具有侵染能力。抗稻瘟病和纹枯病
测试分别参照 Jia 等[23 ]和周而勋[24 ]的离体叶片接种法
进行。纯合突变体 lmm1 和对照 Katy 各检测 5 株。
组织化学分析采用台盼蓝染色法 , 方法参照
Bowling 等[25 ]进行。
2 　结果与分析
211 　类病变突变体的表型变化
跟踪试验结果发现未接种的抗病突变体通常在播
种后 3～4 周 ,幼苗生长至 4 叶期时 ,叶片开始出现褐
色坏死斑点 ,随着植株的生长 ,斑点逐渐扩大 ,独立的
坏死斑点数目也越来越多 ,并向叶尖和基部发展 ,之后
大约 2～3 周整个叶片枯死。在营养生长期间 ,每个分
蘖上仅有新生的 2～3 个叶片无可见的坏死斑点 ,老叶
片均出现不同程度的坏死 ,这是典型的蔓延型类病变
坏死突变体 ,笔者将其命名为 lmm1 (见图 1) 。
图 1 　水稻类病变突变体的表型变化
Fig. 1 　Phenotype variation of a rice lesion mimic mutant
在成熟期 ,调查 lmm1 纯合突变体及其对照 Katy
的主要农艺性状。与对照相比 ,类病变突变体 lmm1
的主要农艺性状表型发生了显著变异 :植株变矮 ,分蘖
数和千粒重显著减少。这可能与类病变突变体 lmm1
的叶片发生部分坏死而大大降低植株的光合效率有
关。
212 　突变体的组织化学分析
台盼蓝染色法是检测细胞死亡和细胞膜不可逆性
破坏的一种重要的组织学方法[7 ] 。从图 2 可看出 ,类
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病变突变体 lmm1 经稻瘟病菌 ZN19 人工接种后发生
了明显的细胞死亡 ,而对照 Katy 则无明显变化。
图 2 　ZN19 接种后台盼蓝染色后的叶片局部反应
Fig. 2 　Partial leaf reaction of trypan blue staining
after ZN19 inoculation
图中箭头所指为坏死部分 ,arrows in fig. indicate the death part in leaf
213 　突变体的遗传分析
为确定 lmm1 突变体的遗传特性 ,分别以纯合突
变体与对照 Katy 为亲本进行正反交试验。结果发现 ,
无论是正交还是反交 ,所有 F1 植株均表现正常 ,由此
表明该突变性状是由隐性核基因控制的。在分别含有
274 和 301 株的 2 个 F2 分离群体中 ,正常植株和突变
植株的比例均呈现一对基因控制的 3∶1 分离 (表 1) ,
表明该突变性状是由单隐性核基因控制的。
表 1 　lmm1 类病变突变性状的遗传分析
Table 1 　Genetic analysis of lesion mimic trait
杂交组合
crosses
F1 表型
F1 phenotype
F2 中正常植株数
No. of normal
plants
F2 中突变植
株数
No. of mutant
比例
ratio X
2
KatyΠlmm1 正常 normal 204 70 2. 91 :1 0. 04
lmm1ΠKaty 正常 normal 223 78 2. 86 :1 0. 13
214 　突变体的抗性反应
为评价 lmm1 突变体的抗病反应 ,分别用 ZN02、
ZN04、ZN18、ZN19、ZN35、ZN39、ZN57、ZN61、IB54 和 IH1
等 10 种稻瘟病菌株与 RR102、RR107、RR113 三种纹枯
病菌株进行了离体叶片法人工接种试验 ,结果发现 ,与
对照 Katy 相比 ,该突变体不仅提高了对稻瘟病的抗
性 ,对纹枯病也具有一定的抗病性 (表 2 和图 3) 。
表 2 　水稻类病变突变体对稻瘟病的抗病性反应
Table 2 　Resistance to rice blast of a lesion mimic mutant
ZN02 ZN04 ZN18 ZN19 ZN35 ZN39 ZN57 ZN61 IB54 IH1
Katy R R R S R R R R R S
lmm1 R R R R R R R R R R
注 :R : 抗病 ;S : 感病。
Note : R : Resistant ; S : Susceptible.
图 3 　水稻类病变突变体对纹枯病的抗病性反应
Fig. 3 　Resistance to rice sheath blight of
a lesion mimic mutant
3 　讨论
在植物中已发现存在大量的类病变突变体。尽管
大多数突变体的农艺性状与对照相比都出现不同程度
的衰减现象 ,但明显提高了对生物或非生物胁迫的抵
抗作用 ,特别是对许多病原菌提高了抗性。因此 ,它作
为抗病机理与相关的信号传导研究的材料 ,备受国内
外学者关注。目前 ,许多类病变突变基因已被定位与
克隆 ,包括水稻中的 Spl7 和 Spl11[1 ,26 ] 。本研究中
lmm1 突变体明显提高了水稻对稻瘟病菌和纹枯病菌
的抗性 ,且受一对隐性核基因控制。笔者正在构建
lmm1 的基因定位群体 ,在分离 lmm1 基因的基础上研
究水稻细胞死亡的调控及其与抗病性激发的关系。
研究表明 ,引起类病变坏死突变的原因非常复杂 ,
既有植物内部基因的作用 ,也存在许多环境诱发因素 ,
如光、温度、湿度和养分等[1 ] 。在本研究中 , lmm1 的表
型与水稻中的 Sl 突变体和 spl 突变体的表型十分相
似。类病变性状与发育相关。当水稻植株生长至四叶
期时 ,开始出现坏死症状 ,在此后的各个发育时期均出
现细胞坏死表型。由此表明 , lmm1 基因的功能可能从
水稻四叶期开始启动。这与刘道峰等人报道的 lmi 突
变体类似[27 ] 。环境因素是否会加速或延缓 lmm1 突变
体细胞坏死症状的发生有待于进一步研究。另外 ,
lmm1 突变体与已报道的水稻 lrdΠspl 突变体的等位性
尚不清楚。
致谢 :本研究的部分工作在美国国家水稻研究中心植
物分子病理实验室完成 ,该实验室的所有成员在本试
验中给予了极大的帮助 ,在此一并致谢。
752　4 期 水稻类病变突变体 lmm1 的诱发与初步分析
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参考文献 :
[ 1 ] 　王忠华. 植物类病变突变体的诱发与突变机理. 细胞生物学杂
志 , 2005 , 27 (5) : 530～534
[ 2 ] 　Hammond2Kosack K E , Jones J D G. Resistance gene2dependent plant
defense responses. Plant Cell , 1996 , 8 :1773～1791
[ 3 ] 　Dangl J L , Dietrich R A , Richberg M H. Death don’t have no mercy :
cell death programs in plant2microbe interactions. Plant Cell , 1996. 8 :
1793～1807
[ 4 ] 　Neuffer M G, Calvert O H. Dominant disease lesion mimics in maize. J
Hered , 1975 , 66 : 265～270
[ 5 ] 　Shirasu K, Schulze2Lefert P. Regulators of cell death in disease
resistance. Plant Mol Biol , 2000 , 44 : 371～385
[ 6 ] 　Simmons C , Hantke S , Grant S , et al . The maize lethal leaf spot 1
mutant has elevated resistance to fungal infection at the leaf epidermis.
Mol . Plant2Microbe Interact , 1998 , 11 : 1110～1118
[ 7 ] 　Dietrich R A , Delaney T P , Uknes S J , et al . Arabidopsis mutants
stimulating disease resistance response. Cell , 1994 , 77 : 565～577
[ 8 ] 　Jabs T , Dietrich R A , Dangl J L. Initiation of runaway cell death in an
Arabidopsis mutant by extracellular superoxide. Science , 1996 , 273 :
1853～1856
[ 9 ] 　Greenberg J T , Ausubel F M. Arabidopsis mutants compromised for the
control of cellular damage during pathogenesis and aging. Plant J , 1993 ,
4 : 327～342
[10 ] 　Greenberg J T , Guo A , Klessig D F , et al . Programmed cell death in
plants : A pathogen2triggered response activated coordinately with multiple
defense functions. Cell , 1994 , 77 : 551～563
[11 ] 　Rate D N , Cuenca J V , Bowman G R , et al . The gain2in2function
Arabidopsis acd6 mutant reveals novel regulation and function of the
dalicylic acid signaling pathway in controlling cell death , defenses , and
cell growth. Plant Cell , 1999 , 11 : 1695～1708
[12 ] 　Brodersen P , Petersen M , Pike H M , et al . Knockout of Arabidopsis
accelerated2cell2death 11 encoding a sphingosine transfer protein causes
activation of programmed cell death and defense. Gene Dev , 2002 , 16 :
490～502
[13 ] 　Kiyosawa S. Inheritance of a particular sensitivity of the rice variety ,
Sekiguchi Asahi , to pathogens and chemicals , and linkage relationship
with blast resistance genes. Bull Nat Inst Agri Sci . (Jpn) Ser. D ,
Physiol Genet , 1970 , 21 : 61～71
[14 ] 　Marchetti M A , Bollich C N , Uecker F A. Spontaneous occurrence of the
Sekiguchi lesion in two American rice lines : Its induction , inheritance ,
and utilization. Phytopathology , 1983 , 73 : 603～606
[ 15 ] 　Arase S , Zhao C M , Akimiysu K, et al . A recessive lesion mimic mutant
of rice with elevated resistance to fungal pathogen. J Gen Plant
Pathology , 2000 , 66 : 109～116
[16 ] 　Cheng Z K, Gu M H. Morphology and inheritance of a new rice leaf
death mutant . Chinese Rice Research Newl , 1998 , 6 : 2
[17 ] 　Johal G S , Hulbert S , Brigga S P. Disease lesion mutations of maize : A
model for cell death in plants. BioEssays , 1995 , 17 : 685～692
[18 ] 　王建军 , 朱旭东 , 等. 水稻类病斑突变体的生理与遗传分析. 植
物生理与分子生物学学报 , 2004 , 30 (3) : 331～338
[19 ] 　Wolter M , Hollricher K H , Salamini F , et al . The mlo resistance alleles
to powdery mildew infection in barley trigger a developmentally controlled
defense mimic phenotype. Mol . Gen. Genet . , 1993 , 239 : 122～128
[20 ] 　刘国振 , 朱立煌. 植物2病原物互作中的细胞程序化死亡. 科学
通报 , 1997 , 42 : 1129～1134
[21 ] 　Moldenhauer K A K, Lee F N , Norman R J , et al . Registration of ’
Katy’rice. Crop Science , 1990 , 30 :747～748
[22 ] 　Valent B , Farrall L , Chumley F G. Magnaporthe grisea genes for
pathogenicity and virulence identified through a series of backcrosses.
Genetics , 1991 , 127 : 87～101
[23 ] 　Jia Y, Valent B , Lee F N. Determination of host responses to
Magnaporthe grisea on detached rice leaves using a spot inoculation
method. Plant Disease , 2003 ,87 :129～133
[24 ] 　易润华 , 朱西儒 , 周而勋. 水稻纹枯病菌人工接种方法的研究.
广州大学学报 (自然科学版) , 2003 , 2 (3) : 224～227
[25 ] 　Bowling S A , Clarke J D , Liu Y, et al . The cpr25 mutant of Arabidopsis
expresses both NPR12dependent and NPR12independent resistance. Plant
Cell , 1997 , 9 : 1573～1584
[26 ] 　Zeng L2R , Qu S , Bordeos A , et al . Spotted leaf11 , a Negative
Regulator of Plant Cell Death and Defense , Encodes a U2BoxΠArmadillo
Repeat Protein Endowed with E3 Ubiquitin Ligase Activity. Plant Cell ,
2004 , 16 : 2795～2808
[27 ] 　刘道峰 , 程祝宽 , 等. 水稻类病变突变体 lmi 的鉴定及其基因定
位. 科学通报 , 2003 , 48 : 831～835
852 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (4) :255～258
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net