全 文 ：文章编号 :100028551 (2001) 0420199208
低能离子束介导水稻遗传转化的研究
李　红　吴丽芳　余增亮
(中国科学院等离子体物理研究所 离子束生物工程实验室　安徽 合肥　230031)
摘 　要 :为研究影响低能离子束介导水稻遗传转化效率的各种因素 ,以粳稻 02428、花
培 942鉴209、籼稻明恢 63 这 3 个水稻品种为实验材料 ,分析了离子的种类、能量、剂
量、剂量率等参数对遗传转化的影响 ,建立了有利于遗传转化的组织培养条件和筛选
程序。分子生物学检测证明 ,外源 GUS 报告基因已经整合到水稻基因组中 ,3 个水稻
品种获得抗性愈伤组织的转化率分别为 11 %、1114 %和 711 % ,获得再生试管苗的转
化率分别为 1152 %、1187 %和 1113 %。为应用离子束介导法进行其它对农杆菌不敏
感的禾谷类作物转基因提供了方法学的参照 ,并为深入研究离子束与生物体相互作
用机制打下了基础。
关键词 :低能离子束 ;水稻 ;遗传转化
收稿日期 :1999207207
基金项目 :本研究课题得到自然科学基金 (19890300)重大项目资助和国家重点科技攻关项目 (962538202201)资助
作者简介 :李　红 (1972～) ,女 ,安徽桐城人 ,中国科学院等离子体物理研究所核能科学与工程专业博士 ,从事低能离子
束介导植物遗传转化研究
1991 年中国科学院等离子体物理研究所余增亮研究员首次提出低能离子束处理植物细
胞能协助外源 DNA 导入细胞的设想 ,这一设想已得到不同实验小组研究成果的证实[1～5 ] 。为
了进一步探讨影响转化率的各种因素 ,建立一个稳定高效的水稻成熟胚转化系统 ,本研究选用
粳稻 02428、花培 942鉴209、籼稻明恢 63 这 3 个水稻品种 ,详细比较了离子种类能量、剂量、脉冲
剂量等对种胚出愈率的影响 ,对转化参数进行了分析和优化 ,得到了转基因试管苗。
1 　材料与方法
111 　水稻品种
转基因受体材料为广亲和粳稻 02428、花培 942鉴209 和籼稻明恢 63 ,其中花培 942鉴209 由
上海农业科学院陈若雷惠赠 ,其它品种由安徽省农业科学院水稻所惠赠。
112 　质粒及菌株
质粒 pCAMBIA1301 在大肠杆菌 E. Coli DH5α(基因型 supE44 hsdR17 recA endAlgyrA 96thi2
1relA1)中扩增 ;pCAMBIA1301 含有潮霉素 (hygromycin) 抗性基因 HYG(R) 和 GUS 报告基因 ,其
中 GUS 基因编码区有一内含子 ,使 GUS 基因只能在植物中表达而不会在细菌中表达[5 ] 。
991　核 农 学 报　2001 ,15 (4) :199～206Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
113 　酶与试剂
DNA 限制性内切酶、DNA 分子量参照物为 Promega 公司产品 ;凝胶中 DNA 片段回收与纯
化试剂盒为 Qiagene 公司产品 ,Taq DNA 聚合酶为上海 Sangon 产品 ,地高辛 DNA 高效标记及杂
交检测试剂盒为 Boehringer 公司产品 ,X2G1uc、潮霉素 Hygromycin B 为 Sigma 公司产品 ,其它均
为国产分析纯化学试剂。
114 　水稻组织培养
参考颜昌敬[6 ] 、程祝宽等[7 ]的方法。取发芽率 ≥98 %的成熟种子 ,常规消毒 ,接种于愈伤
诱导培养基 (MS 或 N6 培养基添加 2 ,42D 2mgΠL、水解酪蛋白 500mgΠL ,pH518) ,培养 1～2 周后
移入愈伤继代培养基 (粳稻 :MS 或 N6 培养基添加 2 ,42D 015mgΠL、62BA 012mgΠL、NAA 0105mgΠ
L、水解酷蛋白 500 mgΠL ,pH518) ,培养若干代后 ,移入分化培养基 (MS 或 N6 添加 62BA 2mgΠL ,
KT 1mgΠL、NAA 015mgΠL ,pH518) ,分化小苗长至 2～3cm 时 ,移入小苗培养基 (1Π2MS 添加
NAA012mgΠL ,pH518) 。因季节不宜移入田间的试管苗剪去根、叶 ,接种于保存培养基 (1Π2MS 添
加 62BA 20mgΠL pH518) ,准备移栽前 1 个月移入生根壮苗培养基 (1Π2MS 添加 NAA015mgΠL、多
效唑 2mgΠL ,pH518) 。
115 　植物材料对潮霉素( Hygromycin , Hm)抗性检测
取相同生长状态的新鲜愈伤组织 ,移入 Hm 浓度分别为 0、10、20、40、60mgΠL 的愈伤继代培
养基上 ,记录愈伤组织的初始重量 W0 ,培养 3 周后记录重量 W1 ,计算愈伤重量增长率 r = (W1
- W0 )ΠW0 ,以抗生素为零的愈伤重量增长率 r0 为对照 ,计算其他浓度条件下愈伤相对重量增长
率 R = rΠr0 ;将愈伤组织移入相同抗生素浓度分化培养基上 ,统计再生出苗率 ,以确定不同品种使
用的筛选抗生素浓度。
116 　质粒 DNA 的扩增、提取和纯化
参照《分子克隆实验指南》[8 ] ,用碱法大量提取质粒 DNA ,经 PEG法纯化 ,用紫外分光光度
仪测定 OD260ΠOD280 = 118 ±0102 ,计算浓度后 ,以 50μgΠml 溶解于 011 ×SSC (15mM NaCl ,115mM
柠檬酸钠 ,pH710)缓冲液中备用。
117 　离子束注入处理
参照杨剑波等[1 ]的方法 (略有修改) 。将种子消毒后 ,在超净台上用无菌手术刀切下胚端
1Π3部分 ,将胚端向上均匀排列于无菌培养皿中 ,用不同能量和剂量氮离子 (N+ ) 或氩离子
(Ar + )进行间歇处理。在介导转基因实验中 ,离子束处理完成后立即将种胚浸入含有质粒
DNA(50μgΠml)和 2mgΠL 2 ,42D 的 011 ×SSC导入介质中 ,于 26 ℃温育 8～12h ,取出种胚用 011 ×
SSC溶液反复冲洗 3 次 ,用无菌滤纸吸干残存溶液 ,接种于 MS 诱导愈伤培养基上 (记作处理
T) 。同时设两个对照 ,一个将种胚放置于离子束注入环境中 ,但不接受离子注入处理 ,同样浸
入含质粒 DNA 导入介质中温育 ,记为 CK1 ;另一个将种胚用与处理相同的离子束处理 ,然后浸
于不含质粒 DNA 的导入介质中温育 ,记为 CK2 ,2 个对照其它操作均和处理相同。
118 　抗性愈伤组织的筛选培养及植株再生
处理及 2 个对照的种胚接种于愈伤诱导培养基上生长 4～6d 后 ,移到含有适宜浓度 Hm
的 MS 继代筛选培养基上筛选 3～4 代 (2 周Π代) ,将产生的 Hm 抗性愈伤组织移入分化培养基 ,
大约 4～6 周后分化出小苗。
002 核　农　学　报 15 卷
119 　转化频率的计算
筛选培养 2～3 代后 ,统计产生 Hm 抗性愈伤组织的种胚数 ;分化培养 1 个月后统计产生
Hm 抗性再生苗数 ,由下式计算转化率 :
转化率 Ⅰ= 产生 Hm 抗性愈伤组织的种胚数离子束处理的种胚总数 　转化率 Ⅱ=
产生 Hm 抗性再生植株系总数
离子束处理的种胚总数
1110 　GUS 组织化学染色分析
参照 Jefferson 等[9 ]的方法进行。
1111 　水稻基因组 DNA 提取
基因组 DNA 提取参照卢扬江等的方法[10 ] ,试管苗叶片 DNA 微量提取在 115ml Eppendorf
离心管中操作 ,加入液氮用细玻璃棒碾磨。提取的 DNA 溶解于 ddH2O 中 ,用紫外分光光度仪
测 OD260 ,计算浓度备用。
1112 　再生植株的 PCR 检测
PCR 反应引物为 : gusp1 : 5’2GGGAT CCATC GCAGC GTAAT G23’,gusp2 : 5’2GCCGA CAGCA
GTTTC ATC23’分别与质粒 pCAMBIA1301 上 GUS基因编码链和反义链互补 ,扩增出 563bp 的 DNA
片段 ,反应以质粒 pCAMBIA1301 为反应阳性对照 ,以未转化水稻基因组 DNA 为阴性对照。
PCR 反应系统包括 :10mMTris·HCl (pH814) ,50mM KCl ,115mM MgCl2 ,012mM dNTPs ,100ng
水稻总 DNA (或 10ng 质粒 DNA) ,2unit Taq DNA 聚合酶。反应总体积为 30μl ,反应条件 : (a)
94 ℃,2min , (b) 94 ℃,45s ,55 ℃,45s ,72 ℃,1min ,共 30 个循环 ; (c) 72 ℃,10min ,扩增产物取 10μl
于 1 %琼脂糖凝胶电泳分析。
1113 　再生植株的 PCR2Southern、基因组 Southern 杂交检测
参照《分子克隆实验指南》[8 ] ,取 10μg 基因组 DNA 用 EcoRI 37 ℃酶切过夜 ,于 018 %agrose
凝胶电泳分离 ,采用毛细管转移法转移至尼龙膜。BamHIΠSaC Ⅰ双酶切质粒 pBI121 回收 GUS
基因片段为模板 ,经地高辛随机引物标记为杂交探针。
2 　结果与讨论
211 　高效水稻组织培养体系及抗生素敏感性试验
植物转基因包括外源基因导入植物细胞和转化细胞的再生两个重要环节 ,建立稳定高效
的组织培养体系和有效的抗生素筛选条件是植物转基因顺利进行的前提条件。本实验中采用
MS 和 N6 基本培养基添加相同的激素 ,对诱导 3 个水稻材料的成熟胚脱分化形成愈伤组织和
再分化生成植株没有明显差异。籼稻明恢 63 与粳稻 02428、花培 942鉴209 愈伤组织形态有所
区别 :明恢 63 愈伤组织多为质密团块 ,不易松散 ,分化多为单一再生苗 ;粳稻 02428、花培 942鉴209
愈伤组织多为松散的质密小颗粒状 ,分化时绿色芽点多 ,易产生丛生苗。
3 个水稻材料分别取生长状态一致的新鲜愈伤组织各 100 枚 ,接种于添加梯度浓度 Hm 的
MS愈伤继代培养基上 ,统计培养 2 代 (2 周Π代) 后愈伤组织的相对增长量 (图 2a) 及转移至相
同 Hm 浓度分化培养基上分化出绿苗的频率 (图 2b) ,结果表明 Hm 浓度的增加对愈伤组织生
长及分化再生植株有很强的抑制作用 ,籼稻明恢 63 比粳稻 02428、花培 942鉴209 对 Hm 更为敏
感 ;且在较高 Hm 浓度的培养基上分化的植株较弱小 ,不易成活。因此我们在转化实验中用于
筛选水稻 02428、花培 942鉴209、明恢 63 转化愈伤组织的 Hm 浓度分别为 40、30、20mgΠL ,分化时
102　4 期 低能离子束介导水稻遗传转化的研究
培养基中 Hm 浓度分别为 20、20、10mgΠL。
图 1 　3 个水稻品种在梯度浓度潮霉素培养基上愈伤组织的相对生长率 (a)和分化率 (b)的比较
Fig. 1 　Comparison of relative growth rate (a) and differentiation frequency(b) of
callus of 3 rice varieties on the medium with gradual concentration of hygromycin
212 　离子能量、剂量、脉冲处理剂量及离子种类的选择
影响转化率的因子有离子的能量、剂量、每次脉冲处理剂量、离子质量数和化学性质等。
慎枚[11 ]和余增亮[12 ]等通过实验证明 ,离子能量和剂量的增加有助于刻蚀样品产生微通道 ,注
入离子能量和剂量过高会引起靶材料遗传物质突变 ,适于诱变育种。但在植物转基因研究中 ,
要求各种处理及培养条件尽量减小不必要的突变 ,所以离子束能量和剂量并不是越高越好。
杨剑波等[1 ]建立的粳稻 8018 成熟胚转基因适宜的氮离子注入能量和剂量分别为 30keV、20 ×
1015 ionsΠcm2 ,本实验在此工作基础上 ,进一步分析了相近能量、剂量范围内氮离子和氩离子处
理样品对 3 个水稻品种出愈率的影响 ,以确定最适离子的注入参数。
21211 　注入离子能量对成熟胚出愈率的影响 　总处理剂量 (20 ×1015 ionsΠcm2 ) 和每次脉冲剂
量 (1 ×1015 ionsΠcm2 )保持不变 ,分别以 15、20、25、30keV 的氮离子束和氩离子束处理水稻成熟
胚 ,发现随着注入离子能量的升高 ,种胚出愈率分别下降至 95 %、93 %、91 %和 84 %左右。Ar+
处理和 N + 处理种胚的出愈率没有显著区别。
21212 　注入离子剂量对成熟胚出愈率的影响 　在 25keV 能量条件下 ,分别以剂量为 15 ×、20
×、25 ×1015Πcm2 的 Ar + 和 N + 处理种胚 ,N + 处理后种胚出愈率分别下降至 94 %、91 %和 82 %左
右 ,Ar + 处理后种胚出愈率分别下降至 92 %、90 %和 80 %左右 ,但愈伤的生长状态和生长速度
与对照没有明显差异。相同能量和剂量条件下 Ar + 处理比 N + 处理种胚的出愈率略有降低。
21213 　注入离子脉冲处理剂量对成熟胚出愈率的影响 　固定离子能量和剂量分别为 25keV
和 20 ×1015 ionsΠcm2 ,以每次脉冲剂量 015 ×、1 ×、2 ×、3 ×1015 ionsΠcm2 处理材料。N + 处理后种
胚出愈率分别下降至 92 %、91 %、79 %和 71 %左右 ,Ar + 处理后种胚出愈率分别下降至 92 %、
91 %、80 %和 72 %左右 ,可见随着脉冲处理剂量的增大 ,种胚出愈率下降趋势较能量、剂量的增
加更为显著。这可能由于种子是电的不良导体 ,连续大剂量离子注入在其表面积累大量电荷 ,
到一定程度发生放电击穿 ,造成样品不可逆的损伤和生活力的下降[13 ] 。
以上实验表明离子束能量、剂量增加造成种子出愈率降低 ,这与以前的研究结果是一致
的。尽管有研究表明离子注入会有助于改善愈伤的生长和分化[14 ] ,但是在植物转基因实验
202 核　农　学　报 15 卷
中 ,为了尽量减小各种处理及培养条件造成不必要突变的可能性 ,我们选用确保种胚出愈率 ≥
90 %的最大离子能量 25keV、脉冲处理剂量 1 ×1015 ionsΠcm2 和总处理剂量 20 ×1015 ionsΠcm2 作为
转化条件。
21214 　离子种类的选择 　根据上述实验结果 ,相同能量和剂量的 N+ 和 Ar + 处理对水稻出愈
率的影响没有明显区别 ,根据黄卫东等[15 ] 、王相勤等[16 ,17 ]的实验结果 ,N + 注入可以掺入靶分子
形成新的化合物 ,因而可能会产生较多的后期效应和后代效应。程备久等通过 H+ 、N + 、Ar +
注入棉花种胚的遗传学分析表明 ,3 种离子造成 M1 代损伤度依次为 H+ > N + > Ar + 。因此 ,在
植物转基因试验中 ,我们倾向于选择质量数较大、化学性质不活泼的惰性元素 Ar+ 作为注入离
子 ,以减少产生不必要突变的可能性。
213 　氩离子注入对水稻种胚表面的刻蚀作用
以前研究离子在生物材料内穿行深度的实验采用的离子能量多为 30keV ,剂量为 (5～100)
×1015 ionsΠcm2 不等 ,为了研究本实验所确立的能量和剂量条件是否能够刻蚀水稻成熟胚产生
微通道 ,我们以能量和剂量分别为 25keV 和 20 ×1015 ionsΠcm2 的氩离子束处理水稻成熟胚外表
面和内切面 ,在扫描电镜下观察 ,种胚表层细胞出现不同程度的裂纹和裂缝 ,胚内切面由光滑
的凹凸结构变为不规则碎片状 ,这说明所确立的处理条件能够造成细胞表面的刻蚀变薄 ,并可
能在离子径迹方向形成畅通的微孔 ,成为外源基因进入的通道。
2. 4 　离子束介导外源 DNA 转化水稻及再生植株的获得
各水稻品种分别取一定数目种胚 ,经 25keV、20 ×1015 ionsΠcm2 Ar + 处理后 ,立即浸入含有
pCAMBIA1301 质粒 DNA 的溶液中 ,于 26 ℃温育 8～12h ,并在溶液中加入 2mgΠL 2 ,42D ,以促进
细胞脱分化。处理及 2 个对照的种胚接种于愈伤诱导培养基上生长 4～6d ,从成熟胚盾片部
位长出大小约 2 ×2 ×2mm3 的愈伤组织 ,移到含有适宜浓度 Hm 的 MS 继代培养基上筛选 2～3
代 (2 周Π代) ,培养至大约 4 周左右 ,大部分愈伤组织仍然增长 ,但色泽从鲜亮的淡黄色逐渐变
暗黄褐色 ,生长显著受到抑制 ,最终死亡或不能分化 ;部分愈伤组织从轻微褐化的组织中又生
长出新鲜淡黄色的细胞团 ,将较大的愈伤组织块适当分成小块进行继代筛选培养 ,2 周后移入
分化培养基 ,大约 4～6 周后分化出小苗。获得 Hm 抗性愈伤组织和再生植株的转化频率见表
6。各品种的 2 个对照组各 100 枚种胚在同步筛选培养基上生长 ,愈伤组织逐渐褐化 ,没有分
化再生植株。这再次证明离子束介导转基因技术与种子浸泡转基因方法有本质的区别。在本
实验的 DNA 溶液浓度下使用浸泡法 (即 CK1)无法获得转化子 ,而离子注入处理导致种胚表面
刻蚀穿孔、电荷 (电性)变化以及细胞内 DNA 的损伤修复 ,这种综合作用能有效地协助外源基
因进入植物细胞。
215 　抗性愈伤组织及再生植株 GUS 活性组织化学染色检测
随机取部分 Hm 抗性愈伤组织和再生苗做 GUS 组织化学染色 ,处理过的样品显蓝色 ,对照
不加筛选压力的愈伤组织不显蓝色 (图版 Ⅰa～c) ;某些抗性愈伤组织的 GUS 组织化学染色显
示出 Hm 抗性愈伤中存在嵌合体现象 (图版 Ⅰd ,e) ,这可能由于转化的细胞表达 HYGr 基因解
除了培养基中的潮霉素毒性、使毗邻的非转化细胞得以存活的缘故。因此在进行继代筛选培
养时适当将抗性愈伤组织分成小块 ,有助于得到较为均一的转化子。从抗性愈伤组织分化的
小苗 GUS 染色显示出 GUS 基因在整体植株中都有表达 (图版 Ⅰ) 。
302　4 期 低能离子束介导水稻遗传转化的研究
表 1 　25keV、20 ×1015Πcm2 Ar + 离子束处理 3 个水稻品种的转化率
Tabel 1 　Transformation efficiency of 3 rice varieties treated with 25keV ,20 ×1015Πcm2 Ar + ions
品　种
variety
批次
batch
种胚数
number of
embryo
抗性愈伤
细胞系
Hmr calli
转化率Ⅰ
transfor2
mation
efficiency(TE)
Ⅰ( %)
平均转
化率Ⅰ
average
TE Ⅰ
( %)
分化出绿色
芽点愈伤数
number of
differentiated
calli
再生植株
regenerated
plant
转化率Ⅱ
transformation
efficiency(TE)
Ⅱ
( %)
平均转
化率Ⅱ
average
TE Ⅱ
( %)
02428 1 T 260 28 1018
CK1 100 0 0
CK2 100 0 0
2 T 134 15 1112
CK1 100 0 0
CK2 100 0 0
1110 9 4 11540 0 00 0 0
5 2 1149
0 0 0
0 0 0
1152
花培 942
鉴209
Huapei294
jian209 1 T 262 31 1118CK1 100 0 0CK2 100 0 02 T 109 12 1110
CK1 100 0 0
CK2 100 0 0
1114 12 5 11910 0 00 0 0
4 2 1183
0 0 0
0 0 0
1187
明恢 63
Minghui63
1 T 266 19 711
CK1 100 0 0
CK2 100 0 0
711 7 3 11130 0 0
0 0 0
1113
图版 Ⅰ　潮霉素抗性愈伤组织及再生苗中 GUS的基因的表达
Plate Ⅰ　Expression of GUS gene in hygromycinr callus and regeneration plant
(a)未经离子注入、经 DNA 溶液浸泡的种胚愈伤 , (b)经离子注入、未经 DNA 溶液浸泡的种胚愈伤 , (c)经离子注入及 DNA
溶液浸泡的种胚愈伤 , (d)转化嵌合愈伤 , (e)纯合转化愈伤 , (f)转化植株及植株横切面
(a) callus from embryo treated by DNA imbibition without ion beam implantation , (b) callus from embryo treated by ion beam implantation
without DNA imbibition , (c) callus from embryo treated by ion beam implantation and DNA imbibition , (d) mosaic transgenic callus ,
(e) pure transgenic callus , (f) transgenic plant and shoot cross2section
216 　转基因植株总 DNA 的分子鉴定
以质粒 pCAMBIA1301 为阳性对照 ,以 02428 基因组 DNA 为阴性对照 ,提取部分转化再生
402 核　农　学　报 15 卷
苗叶片 DNA 作 PCR 检测 ,均扩增出 0156kb GUS 片段。PCR2Southern 及基因组 DNA Southern 杂
交分析表明 ,GUS 报告基因已整合到再生植株基因组中 (图版 Ⅱ, Ⅲ) 。
图版 Ⅱ　R0 转基因植株基因组 DNA
的 PCR2Southern 检测
Plate Ⅱ　PCR2Southern analysis of 02428
R0 transgenic plants
λ:λDNAΠHind Ⅲ+ EcoRI 分子量标记 ,
M:1kbDNA 分子量标记 ,1 :阳性对照 ;2 :阴性对照 ;
3～6 :024280 代转化植株 ;下同。
λ:λDNAΠHind Ⅲ+ EcoRI marker ,M:1kb marker ,
1 :positive check ,
2 :negative check ,3～6 :R0 transgenic plants
of 02428 ;the same as the following
图版 Ⅲ　R0 转基因植株基因 DNA 的
Southern 检测
Plate Ⅲ　PCR2Southern analysis of
02428 R0 transgenic plant
　　根据 3 个水稻品种的实验结果 ,我们认为 : (1) 低能离子束介导水稻转基因技术具有良好
的稳定性和重复性。从出发材料到获得转基因试管苗的周期一般在 3～4 个月 ; (2) 低能离子
束介导水稻转基因的转化效率主要取决于试验材料的组织培养和筛选体系以及离子束处理参
数的优化。与农杆菌介导的转化系统相比 ,离子束介导法对材料基因型的依赖性小 ;与 PEG
介导法和电激法等以原生质体为材料的转化方法相比 ,离子束介导法取材容易、操作方便 ,再
生频率高 ; (3) 离子束介导水稻成熟胚转化效率在 1 %～2 %之间 ,与高效的农杆菌转化系统和
基因枪转化法相比 ,其转化效率还比较低。但由于水稻成熟胚取材不受季节限制 ,操作方便 ,
可同时进行大批量材料处理 ,仍然能够得到较多数量的转化植株。采用本实验转化体系将抗
病的几丁质酶基因 ,导入籼稻明恢 63 及栽培品种粳稻花培 942鉴209、D9055、M3122、中粳 63 已
获得大量再生植株 (另文报道) 。
502　4 期 低能离子束介导水稻遗传转化的研究
参考文献 :
[ 1 ] 　杨剑波 ,等. 应用低能离子束介导法获得水稻转基因植株. 科学通报 ,1994 ,39 (16) :1530～1534
[ 2 ] 　杨剑波 ,等. 低能离子束介导外源基因进入水稻细胞的研究. 安徽农业大学学报 ,1994 ,21 (3) :330～335
[ 3 ] 　程备久 ,等. 离子注入法导入外源 DNA 引起陆地棉性状变异的研究. 核农学报 ,1996 ,10 (3) :150～154
[ 4 ] 　余增亮. 离子束生物技术引论. 合肥 :安徽科技出版社 ,1999 ,264～267
[ 5 ] 　Ohta S , et al . Construction and expression in tobucco of aβ2glucuronidase ( GUS) reporter gene containing an intron within the coding
sequence. Plant Cell Physiol ,1990 ,31 :805～813
[ 6 ] 　颜昌敬主编. 农作物组织培养. 上海 :上海科学技术出版社 ,1991
[ 7 ] 　程祝宽 ,顾铭洪 ,等. 水稻实生苗及腋芽苗试管快速速繁殖技术的研究. 江苏农学院院报 ,1995 ,16 (1) :21～25
[ 8 ] 　Sambrook J , et al . In :Molecular Cloning : A Laboratory Manual ,2nd. ed. Cold Springer Harbor Laboratory. Cold Springer , NY. 1989
[ 9 ] 　Jefferson R A , et al . GUS fusion :β2Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant . EMBO J . ,1987 ,
6 :3901～3907
[10 ] 　卢扬江 ,郑康乐. 提取水稻 DNA 的一种简易方法. 中国水稻科学 ,1996 ,10 (4) :241～242
[11 ] 　慎玫等. 离子注入水稻种子的细胞生物学效应. 安徽农业大学学报 ,1994 ,3 :265～268
[12 ] 　余增亮 ,等. 离子刻蚀生物样品的初步研究. 安徽农业大学学报 ,1994 ,3 :260～264
[13 ] 　韩建伟 ,余增亮. 低能离子对番茄果皮刻蚀与穿透作用的研究. 生物物理学报 ,1998 ,Vol . 14 ,No. 4 :757～761
[14 ] 　夏英武 ,等. 氮离子注入水稻机理与效应研究 ,安徽农业大学学报 ,1994 ,3 :241～245
[15 ] 　黄卫东 ,余增亮. 氮离子束注入固体甘氨酸和酷氨酸研究. 安徽农业大学学报 ,1994 ,21 (3) :342～348
[16 ] 　王相勤 ,等. 低能离子注入固态甲酸钠的质能沉积效应. 物理化学学报 ,1998 ,Vol . 14 ,No. 8 :715～718
[17 ] 　王相勤 ,等. 低能氮离子注入乙酸钠的质量沉积效应. 辐射研究与辐射工艺学报 ,198 ,Vol . 16 ,No. 2 :126～128
STUDY ON RICE TRANSFORMATION MEDIATED
BY LOW ENERGY ION BEAM IMPLANTATION
LI Hong 　WU Li2fang 　YU Zeng2liang
( Ion beam Bio2engineering Laboratory , Institute of Plasma Physics , Chinese Academy of Science , Hefei , Anhui prov . 　230031)
ABSTRACT :Delivery of foreign DNA into rice via ion beam was first reported in 1994. In recent
years we have aimed to set up efficient transformation system mediated by low energy ion beam.
The factors that influence the transformation including type of ion , parameters of ion energy ,
dose and dose rate , plant genotype , composition of media , concentration of hormones and antibi2
otics were carefully investigated. Treated with 25keV Ar + , the transformation eff iciencies of the
mature embryos of rice variety 02428 , Huapei942jian209 and Minghui63 reached 11 %, 1114 %
and 711 % measured by produced antibiotic resistant callus and 1152 %, 1187 %and 1113 % mea2
sured by regenerated plants respectively. PCR detection and Southern blot analysis showed that
GUS report gene had inserted in rice genome. Low energy ion beam mediated gene transfer will
be extended to other cereal recalcitrant to Agrobacterium tumefaciens as soon as methodological
parameters were optimized.
Key words :low energy; ion beam implantation ; rice ; transformation
602 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2001 ,15 (4) :199～206