全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 0120037205
太空诱变玉米核雄性不育材料的 cDNA2AFLP 分析
张琳碧　荣廷昭　潘光堂　曹墨菊
(四川农业大学玉米研究所Π作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室 ,四川 雅安　625014)
摘 　要 :利用 cDNA2AFLP 技术对太空诱变玉米核雄性不育材料的花药进行差异表达分析 ,并对差异片段
进行回收、克隆和测序 ,结合半定量 RT2PCR 方法 ,分析差异片段在可育株和不育株中的表达情况。利
用 16 对引物共回收得到 9 个差异序列 ,其中 2 个为来自不育株的特有片段 ,7 个为来自可育株的特有片
段。序列分析发现 ,来自不育株的 2 个 EST序列未检测到同源性较高的序列 ;来自可育株的 4 个 EST序
列分别与水稻上推断的查尔酮合成酶、脂酰 CoA 脱氢酶、蛋白激酶 PK12、甘氨酸脱羧酶具有较高的同源
性。这些物质可能参与小孢子发育过程中的物质代谢、能量代谢及信号传导等。半定量 RT2PCR 分析
表明 ,与查尔酮合成酶同源性较高的 Z3 片断在可育花药发育的早期有较高的表达 ;而与甘氨酸脱羧酶
同源性较高的片断 Z8 在可育花药发育的中间阶段呈增量表达。这可能与花药发育过程有较高的能量
和物质需求有关。
关键词 :玉米 ;太空诱变 ;雄性不育 ;cDNA2AFLP
DIFFERENTIAL EXPRESSION ANALYSIS OF GENIC MALE STERILITY BY cDNA2AFLP IN MAIZE
ZHANGLin2bi 　RONG Ting2zhao 　PAN Guang2tang 　CAO Mo2ju
( Maize Research InstituteΠKey Laboratory of Crop Genetic Resource and Improvement , Ministry of Education ,
Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan 　625014)
Abstract :The differential expression of male sterility induced by space flight with male fertility was studied using cDNA2AFLP
technology. Total RNA was isolated from anther of male sterility and male fertility. Nine differential expression cDNA
fragments were obtained with 16 primer combinations. The differential cDNA fragments were eluted , cloned and sequenced.
Then half2quantitative RT2PCR was used to study the differential expressions of 4 development stages between sterility and
fertility. Sequencing analysis shown 2 fragments from male sterility might be novel genes. Four fragments from male fertility
were homology as chalcone and stilbene synthases , putative acyl CoA dehydrogenase , putative protein kinases and putative
glycine decarboxylase. All these proteins might participate in the energy metabolisms , substance metabolisms or signal
transmission of gametophyte development . Half2quantitative RT2PCR shown Z3 had a high expression in the early stage of
pollen development , Z8 took on increasing expression during the middle period of pollen development . These results just met
the demand of more energy and more substance during the pollen development .
Key words :maize ; space flight ; male sterility ; cDNA2AFLP
收稿日期 :2008206212 　接受日期 :2008212214
基金项目 :教育部长江学者和创新团队发展计划 ( IRT0453) ,国家科技支撑计划 (2008BAD97B03) 。
作者简介 :张琳碧 (19812) ,女 ,重庆人 ,硕士研究生 ,研究方向为生物技术与玉米遗传育种。Tel :13876686336 ; E2mail :amee123 @1631com
通讯作者 :曹墨菊 (19652) ,女 ,河北邯郸人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事玉米遗传育种及分子生物学研究。Tel :083522882073 ; E2mail : caomj @
sicau. edu. cn
　　航天诱变育种是我国科学工作者于 1987 年开创
的农作物诱变育种新途径 ,经过 20 多年的探索发展 ,
已取得可喜的成就[1 ] 。利用航天诱变技术已在除玉米
之外的其他作物上相继获得雄性不育突变体[2 ,3 ] 。植
物雄性不育现象在杂种优势利用上具有重要应用价
73　核 农 学 报　2009 ,23 (1) :37～41Journal of Nuclear Agricultural Sciences
值。对于自花授粉作物 ,雄性不育还可以作为进行轮
回选择和群体改良的桥梁工具[4 ] 。自然界种类繁多的
雄性不育材料也是研究植物花粉或花药发育的宝贵资
源。目前 ,在植物上已有少数几个雄性不育基因被克
隆[5 ,6 ] ,这对深入了解植物雄配子的发育进程具有重要
意义。但要全面认识植物雄性不育的发生过程及遗传
调控网络 ,还需要分离更多与雄配子发育有关的基因。
cDNA2AFLP 技术具有重复性高、假阳性低的优点 ,被广
泛用于鉴定和分离雄性不育差异表达基因。凌杏元
等[7 ]利用 cDNA2AFLP 技术比较了水稻红莲型细胞质
雄性不育系、保持系和杂种一代 mtRNA 的差异 ,筛选
出 6 个差异片段。王永勤[8 ] 利用 cDNA2AFLP 技术对
白菜核不育两用系可育株群和不育株群进行了差异分
析 ,表明 cDNA2AFLP 技术可以用于植物雄性不育表达
差异的研究。本试验所用材料是 1996 年经太空诱变
处理得到的玉米细胞核雄性不育突变体 ,其不育性状
是由一对隐性基因控制 ,对该材料已开展生理生化[9 ] 、
细胞学观察[10 ] 、基因定位[11 ] 等方面的研究 ,但从 RNA
水平对基因表达的研究尚未开展。本研究采用 cDNA2
AFLP 技术对太空诱变玉米核雄性不育材料的花药进
行差异表达分析 ,为进一步鉴定和分离育性相关基因 ,
阐述雄性不育的分子机理提供依据。
1 　材料和方法
111 　材料及试剂
本研究所用材料为四川农业大学从 1996 年卫星
搭载处理玉米川单 9 号后代选育而来 ,通过与地面对
照同步观察 ,在处理后代中获得 1 株雄性不育突变体 ,
经姊妹交保种获得该不育突变体的后代 ,经多年分别
在云南元江和四川雅安种植观察 ,该不育突变体的花
粉败育彻底 ,育性表现稳定 ,花粉粒镜检为无花粉的彻
底败育型 ,不育度 100 %。以该雄性不育突变体的姊
妹交 6 代育性分离群体为材料 ,2004 年春种植于四川
雅安 ,育苗移栽 ,5 行区 ,每行 7 窝 ,每窝 2 株 ,田间精
细管理 ,不间苗。所有植株挂牌编号 ,成株期调查育
性。根据雄穗发育状况 ,于抽雄前后分单株各取 4 个
不同发育时期的花药 ,分别为 :雄穗孕育完全但未抽出
(时期 1) ,雄穗刚抽出 (时期 2) ,雄穗抽出 2～3cm (时
期 3) ,雄穗完全抽出 (时期 4) 。 - 70 ℃保存备用。所
有取样植株同时保留一部分雄穗进行育性鉴定。
Trizol Reagent 购于 Invitrogent 公司 ;逆转录试剂购
于 TaKaRa 公司 ;Taq DNA 聚合酶、凝胶回收试剂盒购于
北京天为时代公司 ;Acrylamide、Bis2adrylamide 和 TEMED
购于 Promega 公司 ;pMD182T Vector 购于 TaKaRa 公司 ;引
物和接头由上海生物工程技术公司合成。
112 　总 RNA的提取与 cDNA合成
取 011～015g 花药在液氮中研磨成细粉状 ,加入
适量 Trizol ,按说明书提取总 RNA。试验中所用玻璃器
皿均经高温烘烤、塑料制品经 011 %DEPC 水处理以去
除 RNase。
提取的 RNA 经 DNase 处理后 ,用紫外分光光度计
测定 RNA 浓度并定量为 1μgΠμl ,根据育性调查结果 ,
分别将 8 个可育株、8 个不育株的 4 个不同发育时期
的总 RNA 等量混匀 ,得到可育 RNA 池和不育 RNA 池。
按照 M2MLV 逆转录说明书合成双链 cDNA ,提纯后于
- 20 ℃冰箱保存备用。
113 　cDNA2AFLP分析
AFLP 体系及程序参照 Mahewaran 等[12 ] 的方法略
有改动。cDNA2AFLP 所用接头和引物序列 (表 1) 由英
俊公司合成。电泳采用 6 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,1
×TBE电泳缓冲液 ,电压 75W ,银染显色。
表 1 　cDNA2AFLP中所用的引物和接头
Table 1 　Adapters and PCR primers used in cDNA2AFLP
所用接头和引物
adapters and primers
接头和引物的核苷酸序列
nucleotides sequence of adapters and primers
EcoR Ⅰ接头 EcoR Ⅰadaptor 5′2 CTCGTAGACTGCGTACC23′
5′2 AATTGGTACGCAGTC23′
EcoR Ⅰ引物核心序列 core sequence of EcoR Ⅰprimer 5′2 GACTGCGTACCAATTCE23′
EcoR Ⅰ中所用选择碱基 selective bases of EcoR Ⅰ A ,T ,G,C
Mse Ⅰ接头 Mse Ⅰadapter 5′2 GACGATGAGTCTGAG23′
5′2 TACTCAGACTCAT23′
Mse Ⅰ引物核心序列 core sequence of Mse Ⅰprimer 5′2GATGAGTCCTGAGTAAE23′
Mse Ⅰ中所用选择碱基 selective bases of Mse Ⅰ A ,T ,G,C
　　注 :cDNA2AFLP 引物为核心引物加一个选择碱基组成。
Note :the cDNA2AFLP primer includes core sequence of primer plus one selective base.
83 核　农　学　报 23 卷
114 　差异条带的回收、克隆和测序
依据《分子克隆实验指南》[13 ] 用煮沸法从聚丙烯
酰胺凝胶中回收具有明显差异的条带 ,并在相应的
AFLP 反应条件下进行第二次扩增 ,112 %琼脂糖凝胶
电泳检测。选用北京天为时代公司离心柱型琼脂糖凝
胶回收纯化试剂盒进行第二次回收。回收产物与
pMD182T Vector 连接 ,转化 DH5a 感受态细胞 ,经蓝白
斑筛选 ,提取质粒 ,PCR 扩增鉴定为阳性克隆后交由上
海生物工程技术公司测序。
115 　序列分析
将测序得到的序列去除载体和接头序列后 ,核苷
酸序列和推导的氨基酸序列分别在 Maizegdb 和 NCBI
上应用 Blast 程序进行同源性比对。
116 　差异片段的半定量 RT2PCR分析
以可育株和不育株 4 个不同发育时期的单链
cDNA 为模板 ,使用紫外分光光度计测定模板浓度后 ,
利用 肌 动 蛋 白 基 因 Actin ( GeneBank 序 列 号 :
AY108616) 进行 PCR 分析 ,确定模板浓度一致后 ,再根
据差异片段的序列设计特异引物进行 RT2PCR 分析。
2 　结果与分析
供试姊妹交后代的育性分离群体为 67 株 ,成株期
育性调查结果显示可育株 35 株 ,不育株 32 株。不育
株无花药外露 ,败育彻底 ,为典型的完全不育型。
211 　cDNA2AFLP分析
选用 4 条 EcoR I选扩引物和 4 条 Mse I 选扩引物
对可育株与不育株的花药 cDNA 进行 AFLP 扩增 ,扩增
产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ,银染显色。
结果显示 ,绝大多数引物组合能扩增出稳定、清晰的条
带 ,且可育花药扩增的条带数目要多于不育花药 (图
1) 。
当差异片段能被重复检测到后 ,回收其中的 9 个
差异片段 ,分别命名为 Z12Z9。其中 Z1、Z9 为不育花药
特有带 ,其余 7 个为可育花药特有带。
212 　序列分析和相似性比较
将克隆得到的 9 个 EST 序列在 Maizegdb 和 NCBI
数据库中比对 ,结果见表 1。Blastx 比对发现 ,有 4 个
序列与已知蛋白相似性较高 ,另外 5 个克隆是未知基
因序列。
Z2 序列与玉米基因组中的 CF273017 序列相似性
为 91 % , 与 gi46981881 序列 ( Zea mays putative zinc
finger)相似性为 88 %。
Z3 序列与玉米基因组中的 CK370314 序列同源性
图 1 　cDNA2AFLP聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
1 ,3 为可育 ;2 ,4 为不育。1 ,2 为引物 E + TCΠM + TG;
3 ,4 为引物 E + GGΠM + TG。
Fig. 1 　Partial amplication2results of cDNA2AFLP
1 ,3 indicated fertility ; lanes 2 ,4 indicated sterility.
The primers of 1 ,2 was E + TCΠM + TG;
The primers of 3 ,4 was E + GGΠM + TG.
为 91 % , Blastx 比对发现与查尔酮合成酶 ( chalcone
synthase)有一定的相似性。
Z4 序列 Blastn 比对未找到相似性较高的核苷酸
序列 ,但 Blastx 比对发现它在 69 个氨基酸水平上与推
断的水稻脂酰 CoA 脱氢酶 (acyl CoA dehydrogenase) 同
源性为 76 %。
Z5 的核苷酸序列与水稻基因组的克隆 BU582076
相似性为 99 % ,Blastx 比对发现在 115 个氨基酸水平上
与推断的水稻蛋白激酶 AFC3、PK12 同源性较高为
91 %。在 EST数据库中将其延伸为长 1035bp 的序列 ,
Blastx 比对发现在 215 个氨基酸水平上与推断的水稻
蛋白激酶 AFC3、PK12 同源性为 89 %。
Z8 的核苷酸序列与玉米基因组中相似性在 99 %
以上的序列很多 ,Blastx 比对发现它与水稻上推断的甘
氨酸脱羧酶的 H 蛋白 (glycine decarboxylase , H2protein)
同源性为 78 %。在 EST 数据库中将其延伸为一长
921bp 的序列 ,Blastx 比对发现它在 140 个氨基酸水平
上与水稻上推断的甘氨酸脱羧酶的 H 蛋白 (glycine
decarboxylase , H2protein)同源性为 88 %。
213 　差异片段的半定量 RT2PCR结果
半定量 RT2PCR 分析结果表明 ,Z3 只在可育雄穗
刚抽出时表达 (图 2A) ; Z8 是一个上调表达的基因 ,在
雄穗抽出 2～3cm 时起始表达 ,雄穗完全抽出时表达量
达到最大 (图 2B) ;
利用肌动蛋白对 8 个材料进行定量 (图 2C) ,结果
表明模板浓度基本一致。
93　1 期 太空诱变玉米核雄性不育材料的 cDNA2AFLP 分析
表 2 　cDNA2AFLP法分离的 cDNA 片段的特性
Table 2 　Characteristic of cloned cDNAs isolated by cDNA2AFLP
克隆
clone
长度
length (bp)
来源
origin
核苷酸同源比较
nucleic acid homology
相似性
similarity( %)
分值
score
E值
E2value 氨基酸同源比较amino acid homology 相似性similarity( %) 分值score E值E2value
Z1 135 不育 未知 - - - 未知 - - -
sterility unknown unknown
Z2 102 可育 CF273017 91 90 5e217 未知 - - -
fertility unknown
Z3 425 可育 CK370314 91 579 e2164 chalcone and stilbene 55 140 1e232
fertility synthases gi77551242
putative chalcone 55 141 2e231
synthase gi50935727
Z4 196 可育 未知 - - - putative acyl CoA 76 109 3e223
fertility unknown dehydrogenase gi56477494
Z5 338 可育 BU582076 99 678 0 putative protein kinases 91 218 1e255
fertility AFC3Πgi34912246、PK12Πgi53791573
Z6 167 可育 未知 - - - 未知 - - -
fertility unknown unknown
Z7 188 可育 未知 - - - 未知 - - -
fertility unknown unknown
Z8 325 可育 BM080673 99 644 0 putative glycine 78 6319 4e209
fertility decarboxylase gi50905585
Z9 188 不育 未知 - - - 未知 - - -
sterility unknown unknown
图 2 　回收片段和内参基因的 RT2PCR 分析
Fig. 2 　The fragments of differential development stages
in anther by half quantitative RT2PCR
F、S分别表示可育和不育 ;a、b、c、d 表示花药
发育的 4 个时期 ;A、B、C表示 Z3、Z8 和肌动蛋白
F and S indicated fertile and sterile respectively ;
a ,b ,c ,d indicated the development stages of anther ;
A ,B ,C showed the results of Z3 ,Z8 and Actin
3 　讨论
本研究所用的太空诱变玉米细胞核雄性不育材料
是由一对隐性基因控制[14 ] 。但在不育和可育花药之
间却检测到多个差异表达片段 ,且可育花药产生的条
带数多于不育花药。其中 ,Z3、Z5 和 Z8 是可育花药特
有的片段 ,在水稻或玉米基因组中可找到高度同源的
核苷酸序列。
Z3 与水稻上推断的查尔酮合成酶 ( chalcone
synthase)有 54 %的同源性。本研究中检测到该基因只
在可育材料雄穗刚抽出时表达。查尔酮合成酶是苯丙
氨酸代谢途径中的关键酶 ,在类黄酮的合成中起着关
键作用。类黄酮化合物参与植物的许多生理过程 ,其
中包括花粉的育性 ,这在水稻、拟南芥等植物的研究中
已得到证实[15～17 ] 。类黄酮在花粉中的主要合成部位
是绒毡层。张毅研究证明 ,在水稻花药中特异表达的
类查尔酮合成酶基因 D5 mRNA 的积累在四分体时期
达到高峰并持续到小孢子时期 ,而这一时期与花粉外
壁的形成密切相关[18 ] 。类黄酮与花粉发育的关系在
玉米、矮牵牛中已有报道[19 ,20 ] 。类黄酮与植物育性的
关系通过查尔酮合成酶基因的基因工程研究也得到印
证。
Z5 与推断的水稻蛋白激酶 AFC3、PK12 同源性为
91 %。蛋白激酶 AFC3、PK12 属于LAMMER 激酶家族 ,
可使丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化。Guido[21 ] 研究发
现 PK12 具有传递乙烯信号的功能。Z5 在可育材料雄
穗抽出的 3 个时期都表达 ,而在不育材料中仅雄穗完
全抽出时表达 ,这一现象有待进一步研究。
Z8 与水稻上推断的甘氨酸脱羧酶的 H 蛋白
( GDC ,H2protein)同源性为 78 %。在本研究中 ,该基因
在可育雄穗抽出 2cm 时起始表达 ,在雄穗完全抽出时
增强表达 ,而在不育材料中检测不到表达。GDC 是一
04 核　农　学　报 23 卷
个定位于线粒体基质中的多酶复合物[22 ] ,是形成丝氨
酸的一个关键酶[23 ] 。甘氨酸和丝氨酸是植物中主要
的代谢物质。正常光呼吸的乙醛酸代谢途径是在
GDC作用下 2 个甘氨酸脱羧形成一个丝氨酸 ,而由甘
氨酸到丝氨酸的反应中生成的 NADH能被线粒体呼吸
链用作能量生成。抑制甘氨酸脱羧酶 ( GDC) 以后 ,会
诱导乙醛酸代谢的旁路反应合成丝氨酸。可育花粉的
正常发育通常需要很高的能量 ,这可在 GDC 作用下通
过正常乙醛酸代谢所产生。本研究在不育材料中未检
测到 GDC 基因的表达 ,可能意味着甘氨酸通过乙醛酸
代谢的旁路反应合成丝氨酸 ,但这个交替过程会使胞
质中的 ATP 和 NAD ( P) H 库减少 ,且积累和释放大量
的有害物质 —乙醛酸和 H2O2 [24 ] ,从而影响到雄穗的正
常发育。
本试验所用材料是经姊妹交 6 代的育性分离群
体 ,该分离群体的不育株和可育株遗传背景较为一致 ;
供试材料的不育性状是由单基因控制的质量性状。这
些因素决定了不育和可育之间的差异是有限的。本研
究在回收差异片断时首先考虑选择重复性好且差异明
显的条带 ,另外也考虑片段的大小等问题 ,因此只回收
了其中的 9 个差异片段并进行研究。通过分析发现 ,
Z3、Z8、Z5 可能通过参与小孢子发育过程中的物质、能
量代谢和信号传递等过程来影响雄穗的发育。其中
Z3 片段与查尔酮合成酶有较高的同源性 ,而查尔酮合
成酶基因与植物花粉育性的关系已在很多作物上报
道。在回收差异片段时 ,因为有选择 ,所以不排除存在
有意义的差异片段漏选问题。也有学者认为表达量差
异小或差异片段较短 ,往往可能是一些基因表达的调
控因子。因此 ,今后还需加强对这些方面的研究。
本研究的 cDNA2AFLP 分析发现不育花药的条带
少于可育花药 ,说明由于细胞程序化死亡而导致的雄
配子败育 ,体现在与雄配子发育有关的物质、能量代谢
和信号转导等途径受阻。对这些基因进行克隆和功能
分析将有助于进一步了解雄配子的发育过程 ,为阐明
雄性不育的发生机理提供参考。
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