全 文 ：小麦体细胞胚发生中 DNA、RNA
和蛋白质的合成动态
崔凯荣
(华中理工大学药物研究所　武昌　430074)
王晓哲　陈　雄　王亚馥
(兰州大学干旱农业生态国家重点实验室　兰洲　730000)
此文于 1996 年 8 月 4 日收到。
国家自然科学基金资助项目。
用普通小麦的幼胚在 N6B5MS Ⅰ培养基上诱导出胚性和非胚性愈伤组织 ,将这
两种愈伤组织分别转至 N6B5MS Ⅱ培养基后 ,胚性愈伤组织形成许多体细胞胚 ,非胚
性愈伤组织形成不定苗。胚性愈伤组织转入 N6B5MS Ⅱ培养基后 ,第 2～4d 形成胚
性细胞 ,二细胞、四细胞原胚 ,8d 后 ,则以多细胞原胚为主 ,12～24d 后 ,可见球形胚和
梨形胚 ,26d 后则多为成熟胚。利用放射性同位素液体闪烁计数技术结合核酸、蛋白
质合成抑制剂 ,研究了以小麦 ( T riticum aestiv um L . )幼胚为外植体诱导产生体细胞
胚的发生、发育过程中 DNA、RNA 和蛋白质的合成动态。发现 RNA、蛋白质的合成
分别在胚性愈伤组织培养后的第 4 和第 8d 就达到高峰 ,DNA 的合成也明显增加 ,但
变化平缓。而非胚性愈伤组织中的核酸和蛋白质的合成速率远远低于胚性愈伤组
织。加入抑制剂后 ,不仅抑制了核酸、蛋白质的合成 ,同时也抑制了胚性愈伤组织的
生长和体细胞胚的发生、发育 ,加入时间越早 ,抑制效应越明显。可见 ,DNA、RNA
和蛋白质是体细胞胚发生、发育的分子基础。
关键词 :小麦 　体细胞胚胎发生 　DNA 　RNA 　蛋白质合成
前 　　　言
禾谷类作物离体培养通过体细胞胚发生途径形成再生植株的报道较多[1 - 3 ] 。过去对小
麦幼穗和幼胚培养的胚性无性系建立[4 ] 、体细胞胚发生的细胞学及淀粉消长动态[5 ] 、蛋白质
组分和过氧化酶同工酶的变化[6 ]以及超微结构等[7 ]进行了较为系统的研究。在此基础上 ,本
文用放射性同位素液体闪烁计数技术 ,结合核酸、蛋白质合成抑制剂 ,研究了小麦体细胞胚发
生中 DNA、RNA 和蛋白质的合成动态及相应的抑制剂对这一发育途径的影响。
材 料 与 方 法
小麦体细胞胚发生的诱导 　以普通小麦 ( T riticum aestiv um L . )栽培品种陇春 13 号授粉
902　核 农 学 报　1997 ,11 (4) :209～214Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
后 5～7d 的幼胚为外植体 ,接种于附加有 2 ,42D 3mg/ L 、KT 015mg/ L 、甘氨酸 2mg/ L 、L H
300mg/ L 、蔗糖 3 %、p H518 的 N6B5MS Ⅱ培养基 (N6大量元素 + B5微量元素 + MS 有机物质和
铁盐)上 ,30d 后形成大量愈伤组织 ,继代培养 3～4 次后 ,得到大量淡黄色颗粒状和白色致密
状的两种愈伤组织。将它们分别转入 N6B5MS Ⅱ培养基 (2 ,42D 降为 015 mg/ L 、外加脯氨酸
4mmol/ L)后 ,前者形成许多体细胞胚 ,为典型的胚性愈伤组织 ,后者产生分生细胞团的不定
芽、根 ,为非胚性愈伤组织。
石蜡切片制样 　在胚性愈伤组织转移至 N6B5MS Ⅱ培养基后的第 2d 和第 8d ,分别加入
RNA 合成抑制剂放线菌素 D (AMD) 20μg/ L 和蛋白质合成抑制剂环已亚胺 (Cycloheximide ,简
称 CHM) 20μg/ L ,并在 0、2、4、6、8、12、16、20、24、26d 分别取加入抑制剂和未加抑制剂的胚性
愈伤组织以及非胚性愈伤组织 ,用 FAA 固定 24h ,70 % 乙醇冲洗 ,苏木精整体染色 3d ,常规石
蜡法制片 (厚为 7～8μm) ,在光学显微镜下观察、照相。
愈伤组织的同位素掺入测定 　掺入测定参照 Fujimura[8 ]的方法 ,并略加改进。取加入与
未加入抑制剂的各个时期 (0、2、4、6、8、12、16、20、24、26d)的愈伤组织各 100mg ,分别加入比活
度为 5μCi/ ml 的 1ml3 H2胸腺嘧啶核苷、523 H2尿嘧啶核苷、DL2(4 ,523 H)2亮氨酸 (均为中国科学
院上海原子核研究所产品)标记液 ,标记 5h (25 ℃) ,标记液用无激素液体 N6B5MS Ⅱ培养基配
制。然后用同样液体培养液冲洗 2 次 ,80～90 ℃烘干后 ,加入消化剂 0108ml (高氯酸∶过氧化
氢 1∶1) ,80～90 ℃消化 5～6h ,完全消化后转入闪烁瓶 ,加入闪烁液 ( PPO 014 % + POPOP
0101 %溶于二甲苯) 6ml 及无水乙醇 4ml ,摇匀 ,在 FJ22101 双道液闪计数器上测 cpm。另取
100mg 愈伤组织 ,沸水加热杀死后加入同位素标记液 ,使其尽量分散 ,作为本底扣除 ,一切操作
同上 ,取 3 次重复实验平均值作图。
胚性愈伤组织生长量测定 　在胚性愈伤组织转入 N6B5MS Ⅱ培养基后的 0、2、4、6、8、12、
16、20、24、26、28、30d ,分别随机取未加入抑制剂与加入抑制剂的胚性愈伤组织各 8 块称鲜重 ,
重复 3 次 ,取平均值作图。
结 　　　果
(一)小麦体细胞胚发生
根据细胞学观察 ,将小麦愈伤组织生长发育分为诱导期、增殖期和分化期。诱导期约 2～
4d ,4d 后大部分细胞进入分裂增殖期 ,3 周后形成大量淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织和白色
致密的非胚性愈伤组织。切片观察表明 :非胚性细胞细胞核小、细胞质浅 (图版 Ⅰ21) ,而胚性
愈伤组织转入 N6B5MS Ⅱ培养基后第 2～4d ,形成的胚性细胞则核大、质浓 (图版 Ⅰ22) ,此时已
有一些胚性细胞分裂形成 2～4 细胞原胚 (图版 Ⅰ23 ,4) 。8d 后 ,则以多细胞原胚为主 (图版 Ⅰ2
5) 。12～24d 后可见各个不同发育时期的体细胞胚 ,其中以球形胚和梨形胚为主 (图版 Ⅰ26～
8) 。26d 后则多为成熟胚 (图版 Ⅰ29) ,30d 左右形成再生苗。
(二)小麦体细胞胚发生中 D NA、RNA 和蛋白质的合成动态　
分别测定不同时期和不同处理的愈伤组织 3 种放射性同位素前体掺入量 ,以计算细胞中
DNA、RNA 和蛋白质的合成速率。结果表明 :在转入 N6B5MS Ⅱ培养基后 0～4d ,胚性愈伤组
织的 DNA、RNA 和蛋白质的合成速率迅速增加 ,尤其是在第 4d , RNA 就达到高峰 ,为 0d 的
313 倍。随后其合成速率虽有所下降 ,但在体细胞胚发育过程中一直保持较高水平 (图 12a) 。
012 核　农　学　报 11 卷
图版 Ⅰ　　Plate Ⅰ
1. 非胚性愈伤组织　2. 单个胚性细胞　3 ,4. 二、四细胞原胚　5. 多细胞原胚　6. 球形胚　7 ,8. 梨形胚　9. 成熟胚
1. The non2embryonic callus 　2. The single embryonic cells 　3 ,4. The two2four cells proembryo 　5. The multicelluar proembry2
o 　6. The globular2shaped embryo 　7 ,8. The pear2shaped embryo 　9. The mature embryo
蛋白质在第 8d 达到高峰 ,合成速率为 0d 的 317 倍 ,其后也保持较高水平 (图 22a) ,同时 ,
胚性愈伤组织的 RNA 和蛋白质合成速率均明显高于非胚性愈伤组织 (图 12a ,b 和图 22a ,b) 。
AMD 对 RNA 合成及 CHM 对蛋白质合成都具有显著的抑制效应 ,而且加入时间越早 ,抑制效
应越明显 (图 12c ,d 和图 22c ,d) 。
DNA 合成速率的变化虽不很显著 ,第 16d 才达到较高水平 ,但也明显高于非胚性愈伤组
织。可见 ,随着胚性细胞的增殖 ,DNA 的复制量增加 ,为其细胞分裂奠定了基础。同时 ,从图
3 可看出 ,AMD 对 DNA 合成速率也有一定的抑制效应。
(三) AMD 和 CHM 对小麦胚性愈伤组织生长量和体细胞胚发生、发育的影响
从图 4 可见 ,胚性愈伤组织转入 N6B5MS Ⅱ培养基后 ,开始生长缓慢 ,但在第 4d 后增长明
显。加入 AMD 或 CHM ,明显地抑制其生长量 ,特别是早期加入抑制剂 ,几乎完全抑制了胚性
愈伤组织的生长 ,8d 后加入 ,其抑制效应则明显减弱 ,而且越早加入抑制剂 ,对体细胞胚发生
频率的影响越明显 ,大量愈伤组织中几乎未见有体细胞胚的发生。培养至第 8d 加入抑制剂 ,
虽有胚性细胞及胚性细胞团形成 ,但体细胞胚发生频率很低 ,有的产生畸形胚。
112　4 期 小麦体细胞胚发生中 DNA、RNA 和蛋白质的合成动态
图 1 　小麦体细胞胚发生中 RNA 的合成动态
Fig. 1 　Changes in the activities of RNA synthesis
during somatic embryogenesis of wheat
　　　a. 胚性愈伤组织 (未加 AMD)
b. 非胚性愈伤组织 (未加 AMD)
c. 胚性愈伤组织 (第 2d 加 AMD)
d. 胚性愈伤组织 (第 8d 加 AMD)
a. Embryonic callus ( without adding AMD ) . b.
Non2embryonic callus ( without adding AMD) , c.
Embryonic callus ( AMD was added at the 2nd
day) ,d. Embryonc callus ( AMD was added at the
8th day) .
图 2 　小麦体细胞胚发生中蛋白质的合成动态
Fig. 2 　Changes in the activities of protein syn2
thesis during somatic embryogenesis of wheat
　　　a. 胚性愈伤组织 (未加 CHM)
b. 非胚性愈伤组织 (未加 CHM)
c. 胚性愈伤组织 (第 2d 加 CHM)
d. 胚性愈伤组织 (第 8d 加 CHM)
a. Embryonic callus ( without adding CHM ) . b.
Non2embryonic callus ( without adding CHM) , c.
Embryonic callus ( CHM was added at the 2nd
day) ,d. Embryonc callus ( CHM was added at the
8th day) .
图 3 　小麦体细胞胚发生中 DNA 的合成动态
Fig. 3 　Changes in the activities of DNA synthesis
during somatic embryogenesis of wheat
　　　a. 胚性愈伤组织 (未加 AMD)
b. 非胚性愈伤组织 (未加 AMD)
c. 胚性愈伤组织 (第 2d 加 AMD)
d. 胚性愈伤组织 (第 8d 加 AMD)
a. Embryonic callus ( without adding AMD ) . b.
Non2embryonic callus ( without adding AMD) , c.
Embryonic callus ( AMD was added at the 2nd
day) ,d. Embryonc callus ( AMD was added at the
8th day) .
图 4 　不同处理培养条件下胚性愈
伤组织生长曲线
Fig. 4 　Growth curve of embryonic callus
under the different treatment and culture condition
　　　a. 胚性愈伤组织 (未加任何抑制剂)
b. 胚性愈伤组织 (第 2d 加 AMD)
c. 胚性愈伤组织 (第 2d 加 CHM)
d. 胚性愈伤组织 (第 8d 加 AMD)
e. 胚性愈伤组织 (第 8d 加 CHM)
a. Embryonic callus ( without adding any in2
hibitors) ,b. Embryonic callus (AMD was added at
the 2nd day) ,c. Embryonic callus(CHM was added
at the 2nd day) , d. Embryonic callus ( AMD was
added at the 8th day) , e. Embryonic callus ( CHM
was added at the 8th day) .
212 核　农　学　报 11 卷
讨 　　　论
细胞的生长分化和发育均有赖于生物大分子的合成和它们之间的相互作用 ,而且细胞中
这些大分子的代谢变化总是先于组织形态上可见的变化 ,其中核酸和蛋白质是两类最重要的
生物大分子。小麦体细胞胚发生的超微结构研究发现 ,早期的胚性细胞核大、核仁明显 ,一般
具有两个以上的核仁 ,同时细胞中核糖体含量丰富 ,且以多聚核糖体形式存在 ,说明胚性细胞
早期就有大量 RNA 和蛋白质的合成[7 ] 。Sengupta 等也发现 ,胡萝卜体细胞胚发生过程中 ,
RNA 的合成始于胚性培养的第 2～4h ,两天后细胞分裂加快 ,总 RNA、蛋白质含量增加 ,而且
在胚性细胞中主要合成 Poly (A) + RNA。因此 ,它的出现被认为是体细胞胚分化的重要遗传
信息[9 ,10 ] 。
本实验中 ,当胚性愈伤组织转至 N6B5 MS Ⅱ培养基后 ,RNA 和蛋白质的合成速率明显增
加 ,分别在第 4d 和第 8d 达到高峰 ,这也正是小麦胚性细胞和胚性细胞团大量形成的时期 ,而
DNA 的合成速率则相对缓慢地增加 ,到 16d 才达到较高水平 ,与胚性愈伤组织生长速度在 16
～18d 达到最高相一致。而且 ,在体细胞胚发育过程中 ,3 H2尿苷和3 H2亮氨酸掺入量一直保持
较高水平 ,远高于非胚性愈伤组织。这些结果表明 ,体细胞胚发生发育需要大量的 RNA 和蛋
白质的合成。一些生理生化的分析也证明了这一点 ,小麦体细胞胚发生过程中 ,胚性愈伤组织
的蛋白质含量高于非胚性愈伤组织 ,同时有特异性蛋白质合成[6 ] 。表明胚性愈伤组织和非胚
性愈伤组织的核酸、蛋白质代谢不单是合成活跃程度不同 ,而且还有质的不同 ,即特异性基因
的表达。当加入核酸、蛋白质合成抑制剂后 ,不仅抑制了核酸、蛋白质的合成 ,而且同时抑制了
体细胞胚的发生与发育 ,且加入时间越早效果越明显。进一步说明 DNA、RNA 和蛋白质的合
成是体细胞胚发生的分子基础。
另外 ,从实验结果可见 ,RNA 的合成峰值最先达到 ,蛋白质次之 ,这恰是胚性细胞和胚性
细胞团大量形成时期 ,而 DNA 的合成动态和愈伤组织生长曲线相符。可以说明 RNA 和蛋白
质是胚性细胞形成的基础 ,而 DNA 主要是细胞分裂增殖的基础。
参 考 文 献
1 　Ozias2Akins P et al. Plant regeneration from cultrued immature embryos and inflorescences of Triticum aestiv um L . wheat : Ev2
idence of somatic embryogenesis. Protoplasma ,1982 ,110 :95～105
2 　Vasil V et al. Somatic embryogenesis long term culture of Zea mays L . ( Gramineae) . Amer J Bot , 1984 ,71 :158～161
3 　Vasil V et al. Characterization of an embryonic cell suspension culture derived from culture infloescences of Penniset um ameri2
canum . Amer J Bot , 1982 ,69 :1441～1449
4 　王仑山 ,高清祥 ,王亚馥. 小麦体细胞胚性无性系的建立. 兰州大学学报 ,1993 ,29 (4) :208～211
5 　王亚馥 ,崔凯荣 ,高清祥. 小麦组织培养中体细胞胚胎发生的细胞学及淀粉消长动态的研究. 实验生物学报 ,1993 ,26 (3) :
259～267
6 　王亚馥 ,崔凯荣 ,汪丽虹. 小麦体细胞胚发生中蛋白质组分和过氧化物酶同工酶的变化. 兰州大学学报 ,1993 ,29 (3) :189
～193
7 　王亚馥 ,崔凯荣 ,王丽虹. 小麦体细胞胚发生的超微结构研究. 植物学报 ,1994 ,36 (6) :418～421
8 　Fujimura T et al. Aspects of DNA ,RNA and protein synthesis during somatic embryogenesis in a carrot cell suspension culture.
Physiol Plant ,1980 ,49 :255～260
9 　Sengupta C et al. Somatic embryogenesis in carrot cell suspension. I. Pattern of protein and nucleic acid synthesis. J Exper Bot ,
312　4 期 小麦体细胞胚发生中 DNA、RNA 和蛋白质的合成动态
1980 ,31 :247～258
10 　Sengupta C et al. Somatic embryogenesis in carrot cell suspension. Ⅱ. Synthesis of ribosomal RNA and poly (A) RNA. J Expe
Bot , 1980 ,31 :259～268
CHANGES IN THE SYNTHESIS OF D NA , RNA AND PROTEIN D URING
SOMATIC EMBRYOGENESIS IN WHEAT( T ritocum aestiv um L . )
Cui Kairong
( Pharmaceutical Research Instit ute of Huaz hong U niversity of Science and Technology , W uchang 430074)
Wang Xiaozhe 　Chen Xiong 　Wang Yafu
( The S tate Key L aboratory of A rid A groecology , L anz hou U niversity , L anz hou 730000)
ABSTRACT
Embryogenic and non2embryogenic callus formed from immature embryo of wheat
( Triticum aestivum L. ) in N6 B5MS medium Ⅰ supplemented with 2 ,42D 2mg/ L , KT 015 mg/
L , L H 300mg/ L , sucrose 3 % were sub2cultured and transferred respectively to N6 B5MS medium
Ⅱ( 2 ,42D was decreased to 015mg/ L and 4mol/ L prol ine was added) . Somatic embryos obtained
from embryogenic callus ,and plantlet formed from non2embryogenic callus through organogene2
sis respectively.
By incorporation of 3 H2thymidine , 3 H2uridine and 3 H2leucine into D NA , RNA and protein
respectively ,the rate of synthesis of D NA , RNA and protein during somatic embryogenesis were
measured. A large amount of RNA and protein synthesized during the early somatic embryogene2
sis. The activities of RNA and protein synthesis reached the peak on the 4th and the 8th day re2
spectively ,then decreased a l ittle , but kept a high level . The synthesis of D NA increased appar2
ently during the early stage. No apparent change occurred when the embryogenic cell masses
formed. The synthesis rate of RNA and protein in non2embryogenic callus were much less than
that in embryogenic callus. Actinomycin and cycloheximide inhibited not only the synthesis of
nucleic acid and protein ,but also the growth of embryogenic callus and somatic embryogenesis.
The earl ier the inhibitors were added ,the greater the influnence was caused. The results indicate
that the active expression of corresponding genes of wheat is the molecular base of somatic em2
bryogenesis.
Key words :Wheat ,somatic embryogenesis ,synthesis of DNA ,RNA and protein
412 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1997 ,11 (4) :209～214