全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):513 ～ 517
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0513-05
魏紫牡丹腋芽组织培养的快速繁殖技术
刘会超 贾文庆
(河南科技学院园林学院，河南 新乡 453003)
摘 要:研究了消毒方式、平切刻伤、植物生长调节剂、AC、黑暗处理对魏紫牡丹侧芽污染、不定芽发生、
增殖与生根的影响。结果表明:用 2g /L 多菌灵溶剂浸泡侧芽、0. 1% 升汞消毒 7min，侧芽污染率降至
5%。诱导侧芽不定芽发生的最佳培养基为:MS + Ca2 + + 6-BA 2. 5mg /L + NAA 0. 2mg /L，萌芽率达
81. 13%。AC 对侧芽不定芽分化、枝条生长有明显影响。诱导牡丹侧芽增殖的最佳培养基为:WPM + 6-
BA 1. 0mg /L + NAA 0. 1mg /L，增殖系数可达到 7. 88。牡丹不定芽接种到 1 /2WPM + IBA 3. 0mg /L +
NAA1. 0mg /L 的诱导生根培养基上，黑暗处理 8d，生根率高达 85. 75%。
关键词:牡丹;侧芽;污染;增殖;生根
TISSUE CULTURE OF AXILLARY BUDS OF PEONY VARIATY WEIZI
LIU Hui-chao JIA Wen-qing
(Landscape department of Landscape college，Henan institute of science and technology，Xinxiang 453003)
Abstract:The axillary buds of peony Weizi were used as experimental explants to study the different disinfection methods
on contamination rates of lateral bud，and the effects of 6-BA，NAA and AC on adventitious bud occurrence and
multiplication. The results indicated that firstly immersion in 2g /L carbendazim solution and then kept in 0. 1%
mercuric chloride for 7min was an effective method to prevent contamination. The best medium for adventitious bud
occurrence was MS + Ca2 + + NAA 0. 2mg /L + 6-BA 2. 5mg /L，in which the bud germination rate reached 81. 13% .
AC had a notable effect on adventitious bud differentiation and shoot growth. The best medium for proliferation was WPM
+ 6-BA 1. 0mg /L + NAA 0. 1mg /L，and the proliferation rate reached 7. 88. When the peony shoots were cultured on
the 1 /4 WPM medium with NAA 1. 0mg /L and IBA 3. 0mg /L for 8 d under dark condition，the rooting rate was
85. 75% .
Key words:Paeonia suffruticosa;axillary buds;contamination;proliferation;rooting
收稿日期:2009-09-03 接受日期:2009-12-04
基金项目:河南省创新人才工程(2005 － 126 － 49)和河南科技学院博士基金(050106)，河南科技学院重点项目基金(050121)
作者简介:刘会超(1964-)，男，河南南阳人，博士，副教授，硕士生导师，主要研究方向为观赏植物生物技术。Tel:0373 － 3040384;E-mail:
liuhc918@ yahoo. com. cn
贾文庆(1979-)，男，河南淮阳人，硕士，讲师，主要研究方向为观赏植物生物技术。Tel:15936519769;E-mail:jiawq99@ 126. com
刘会超与贾文庆为并列第一作者。
牡丹(Paeonia suffruticosa)属毛茛科、芍药属多年
生落叶亚灌木植物，是我国传统名花［1］。牡丹主要以
分株繁殖和嫁接繁殖为主，其繁殖速度慢，苗木质量参
差不齐，限制了其苗木产业化和商品化生产。组织培
养是植物快速、高效繁殖的有效手段之一。有关学者
对牡丹的组织培养进行了大量研究，但以魏紫牡丹侧
芽作为外植体进行组织培养的成功报道还未见［2］。
牡丹侧芽的组织培养存在着诸如侧芽污染率高、易褐
化、生根困难等问题［2，3］。本研究主要集中在如何防
止侧芽真菌污染及褐化，以及不同植物生长调节剂对
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核 农 学 报 24 卷
牡丹侧芽不定芽诱导、增殖和生根的影响上，以期为牡
丹侧芽快繁技术及后续的转基因技术应用提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试牡丹品种为魏紫。2007 年 2 月 6 日于河南
科技学院牡丹资源圃采侧芽。采后将侧芽带回实验
室，挑选发育充实、芽体中等大小、没有伤害的侧芽作
为试材。
1. 2 方法
1. 2. 1 多菌灵(N-(2-苯骈咪唑基)-氨基甲酸甲酯)处
理 取 120 个侧芽均分为 3 份，1 份在 2g /L 的多菌灵
溶剂中浸泡 15min，1 份在 4g /L 的多菌灵溶剂中浸泡
15min，1 份为对照。所有侧芽放入稀释 100 倍的雕牌
洗洁精溶液中浸泡 20min，流水冲洗 10min，然后用 50
万 u /100ml 的青霉素浸泡 5min，蒸馏水冲洗 3 次，吸
水纸吸干水分置于超净工作台，用 75%酒精浸泡 30s，
无菌水冲洗 3 次，0. 1%升汞浸泡 7min，无菌水冲洗 6
次。用镊子将鳞片全部剥去，将雏芽基部切成斜面后
接种至培养基上。共接种 60 瓶，每处理 20 瓶，每瓶 2
个侧芽。接种 20d 后，统计 3 种处理真菌污染的百分
率。
污染率 =(接种污染的瓶数 /接种的总瓶数)× 100%
1. 2. 2 消毒时间 侧芽用 1. 2. 1 所得最佳方案处理
后，用蒸馏水冲洗 3 次，吸水纸吸干水分，置于超净工
作台上，用 75%酒精浸泡 30s，无菌水冲洗 3 次，材料
用 0. 1%升汞消毒时，设 5、7 和 9min 3 个处理，无菌水
冲洗 6 次，每处理接种 10 瓶，每瓶 2 个侧芽，经 15d 培
养后，分别统计 3 种消毒时间处理的污染率及幼苗生
长状况。
1. 2. 3 不定芽诱导 用 1. 2. 1 与 1. 2. 2 所得最佳消
毒方案处理后，将侧芽中的雏枝平切去 2 /3 并在其基
部刻 伤，接 种 到 基 本 培 养 基［MS + Ca2 + (CaSO4
187. 5mg /L，Ca3(PO4)2187. 5mg /L)，下同］上
［4］，附加
不同浓度 6-BA(0. 5、1. 0、1. 5、2. 0 和 2. 5mg /L)、NAA
(0、0. 1 和 0. 2mg /L)和 AC(0 和 0. 5mg /L)。3d 观察
1 次，记录侧芽萌动的时间、再生不定芽个数(高度
0. 3cm 记为 1 个芽)、叶片展开状况及分枝长度等指
标，40d 后采用 DPS 数据处理系统进行统计分析。
不定芽诱导率 = (接种 40d 产生不定芽的外植体数 /
接种总外植体数)× 100%;
再生不定芽数 =再生芽总数 /调查外植体数
1. 2. 4 不定芽增殖 将丛生芽切割成单芽接种到增
殖培养基上，采用正交试验设计(因素水平见表 3)，共
16 个处理。基本培养基为:1 /2MS、Ca2 + + MS、MS、
WPM，每处理重复 6 次。35d 后统计增殖系数。
增殖系数 =培养 35d 后丛生芽的总数(个)/接种时的
外植体总数(个)
将以上处理放置到温度为 22℃ ± 1℃，光照 16h /d
(7:00 ～ 23:00)，光强 2500lx(光源为 FL40S，植物组织
培养用日光灯)培养室中进行培养。
1. 2. 5 不同植物生长调节剂、继代次数及黑暗处理对
生根的影响 将 1. 2. 4 处理中形成的高于 1. 5cm 的有
效新梢接种到生根培养基上，生根培养基采用 1 /
2WPM 作为基本培养基，附加 IBA(2、3 和 4mg /L)，
NAA(0. 5、1 和 1. 5mg /L)，蔗糖 20g /L，琼脂 5. 4g /L，
黑暗处理 8d，40d 后统计不定根诱导率、分化数、根长。
同时观察新梢发育状态对诱导生根的效应［5］。
取不定芽增殖继代次数为 0、1、3 和 5 的新梢作外
植体接种到本文所得最佳生根培养基上，40d 后分析
继代次数对生根的影响。
前期黑暗处理分为 0、4、8、12 和 16d，处理条件为
23h 黑暗 /1h 光照。处理过后将材料放置于白天温度
20℃ ± 1℃、光照 14h /d、光强 2500lx、夜间温度 15℃ ±
1℃条件下进行培养。
2 结果与分析
2. 1 多菌灵及不同消毒时间对侧芽污染的影响
牡丹侧芽外有多层鳞片，芽体较大，组织培养容易
发生污染，探索消毒方法对牡丹侧芽的组织培养有重
要意义。本试验发现，对照处理的侧芽接种 20d 后，真
菌污染率达 55%。用 2g /L 多菌灵浸泡后的侧芽，接
种 20d 后真菌污染率只有 5%，而用 4g /L 多菌灵溶剂
浸泡的侧芽，没有观察到污染发生，但侧芽死亡率达
30%。由此可知，随着多菌灵浓度增加，侧芽污染率降
低，但同时侧芽死亡率也逐渐增加，因此 2g /L 多菌灵
处理较为适宜。
不同的外植体对升汞的耐受力区别较大［3］。由
表 1 可以看出，3 种不同消毒时间处理对侧芽污染率
有明显差异，0. 1% 升汞处理 5min 污染率达 30%，处
理 7 与 9min 污染率各为 5%，处理 5min 污染率明显高
于其他 2 种处理，但处理 9min 0. 1%升汞对侧芽的伤
害加重，30%的接种芽体出现严重褐化现象，因此侧芽
的消毒时间以 7min 为宜。
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3 期 魏紫牡丹腋芽组织培养的快速繁殖技术
表 1 不同消毒时间对侧芽污染率的影响
Table 1 The effect of different sterilization time on contamination rate of lateral bud
处理时间
treating time(min)
污染数
numbers of
pollution (bottle)
污染率
pollution rate(%)
生长状况
growth situation
5 9 /30 30 生长正常，少量最顶端叶片略显褐色 maintained normal growth，a few leaves at apex were brown
7 3 /30 5 有 5%侧芽死亡，部分最顶端叶片褐色 5% buds dead，partial leaves at apex were brown
9 3 /30 5 有 30%侧芽出现严重的褐化死亡现象 30% dead buds resulted from browning
2. 2 不定芽诱导
侧芽平切接种培养后 3d 芽开始萌发(图 1-A)。
9d 后有不定芽长出(图 1-B)。产生不定芽最多的为
侧芽在雏枝基部刻伤的部位，占不定芽产生总数量的
40. 5%(图 1-E)，其次是雏枝的枝杈刻伤处，占产生不
定芽总数量的 28. 20%(图 1-F);产生不定芽最少的部
位在平切枝杈的内面刻伤处，占 13. 40%(图 1-G)，其
余的是在侧芽的基部产生。
由表 2 可以看出，7 种组合中 6-BA 2. 5mg /L +
NAA 0. 2mg /L 激素组合诱导率最高，再生不定芽数最
多，诱导率和再生不定芽数分别为 81. 13%和 5. 9。方
差分析发现，各培养基诱导的效果差异显著。
AC 可以吸收组培过程中产生的酚类物质。从表
2 看出，接种 30d 后，培养基中加入 AC 的侧芽褐化率
仅为 3. 54% ～ 8. 04%，而未添加 AC 的侧芽褐化率在
18. 67% ～ 27. 03%之间，由此可见添加 0. 5g /L AC 对
防止侧芽褐化有很重要的作用。
AC 在吸收酚类物质有效防止褐化的同时，也吸收
培养基中的某些成分，造成部分营养缺乏，从而使枝条
徒长。从对芽萌发后抽生的分枝影响来看，添加 AC
的 A6 和 A7 培养基上的植株，分枝生长较快(图 1-
C)，叶片展开，分枝长度分别为 1 ～ 14. 1cm 和 1. 5 ～
16. 4cm，而没有添加 AC 的 A1 ～ A5 培养基上的芽，分
枝长度只是 A6、A7 培养基的 1 /2，15d 后叶片半展，分
枝粗壮。由此可知，AC 对不定芽徒长的发生有促进作
用。
表 2 6-BA、NAA 及 AC 对不定芽诱导及生长的影响
Table 2 The effects of 6-BA，NAA and AC on adventitious bud induction and their growth
培养基
medium
6-BA
(mg /L)
NAA
(mg /L)
AC
(g /L)
诱导率
induction rate(%)
再生不定芽数
adventitious
bud number
褐化率
browning rate
(%)
分枝长
shoot length
(cm)
叶片
leaf status
分枝状况
shoot status
A1 2. 0 0. 2 0 71. 00 ± 0. 28 Cc 4. 61 ± 0. 06Bb 20. 92 ± 0. 30BCc 1 ～ 7 半展
half unfolding
粗壮
strong
A2 2. 5 0. 2 0 81. 13 ± 0. 74 Aa 5. 90 ± 0. 01Aa 22. 46 ± 0. 46Bb 1-5. 2 半展
half unfolding
粗壮
strong
A3 1. 5 0. 1 0 59. 93 ± 0. 81Dd 3. 16 ± 0. 06Dd 18. 67 ± 0. 03Dd 1 ～ 8. 2 半展
half unfolding
粗壮
strong
A4 1. 0 0. 1 0 46. 09 ± 0. 58Ee 2. 66 ± 0. 05Ee 19. 19 ± 0. 25CDd 1 ～ 8. 5 半展
half unfolding
粗壮
strong
A5 0. 5 0. 1 0 45. 71 ± 0. 71Ee 1. 50 ± 0. 02Gg 27. 03 ± 0. 65Aa 1 ～ 9. 5 半展
half unfolding
粗壮
strong
A6 2. 0 0. 2 0. 5 76. 53 ± 0. 25Bb 4. 13 ± 0. 04Cc 8. 04 ± 0. 30Ee 1 ～ 14. 1 展开
unfolding
细长
slender
A7 1. 0 0. 1 0. 5 36. 90 ± 1. 56Ff 1. 11 ± 0. 01Ff 3. 54 ± 0. 34Ef 1. 5 ～ 16. 4 展开
unfolding
细长
slender
注:数字后不同大小写字母表示差异达 1%和 5%显著水平，下表同。
Note:Different small and capital letters mean difference at 0. 05 and 0. 01 levels，respetively. The same as following tables.
2. 3 不定芽增殖
从表 3 可知，不同处理组合对丛生芽的增殖影响
有很大差异，6 号培养基的试管苗增殖率较高，其增殖
系数高，达 7. 88，且试管苗生长发育良好(图 1 － D)。
其次为 2 号及 9 号处理，增殖系数分别为 5. 06 和
4. 78;12 号的试管苗增殖系数最低，仅为 1. 53。总的
看来，6 － BA 浓度 0. 5 ～ 2. 0mg /L 并附加 0. 1mg /L 的
NAA 或 AC 时增殖系数较高，有利于丛生芽的增殖。
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核 农 学 报 24 卷
图 1 魏紫牡丹侧芽组织培养
Fig. 1 Tissue culture of axillary buds of peony Weizi
A:侧芽萌动;B:不定芽分化;C:枝条纤细的牡丹无根苗;D:丛生芽;E:不定芽从侧芽基部刻伤处产生;
F:不定芽从枝杈刻伤处产生;G:不定芽在平切枝杈的内面分化产生;H:生根
A:axillary bud germination;B:adventitious bud differentiation;C:rootless plant with tenuity branches;D:multiple shoot;E:adventitious buds from
basal cutting part of axillary buds;F:adventitious buds from cutting part of branch axils;
G:adventitious buds from inner face of branch axils;H:rooting
表 3 不同培养基对试管苗增殖的影响
Table 3 The effects of different medium on plantlet multiplication in vitro
序号
NO.
培养基
the medium
增殖系数
proliferation rate
1 1 /2MS + 6-BA 0. 5mg /L 1. 59 ± 0. 01HIkl
2 Ca2 + + MS + 6-BA 0. 5mg /L + NAA 0. 1mg /L + AC 0. 5g /L 5. 06 ± 0. 08Bb
3 MS + 6-BA 0. 5mg /L + NAA 0. 3mg /L + AC 1. 0g /L 1. 85 ± 0. 07GHij
4 WPM + 6-BA 0. 5mg /L + NAA 0. 5mg /L + AC 1. 5g /L 3. 23 ± 0. 04Ef
5 MS + 6-BA 1. 0mg /L + AC 0. 5g /L 2. 03 ± 0. 04Gi
6 WPM + 6-BA 1. 0mg /L + NAA 0. 1mg /L 7. 88 ± 0. 11Aa
7 1 /2MS + 6-BA 1. 0mg /L + NAA 0. 3mg /L + AC 1. 5g /L 3. 05 ± 0. 07Efg
8 Ca2 + + MS + 6-BA 1. 0mg /L + NAA 0. 5mg /L + AC 1. 0g /L 2. 53 ± 0. 04Fh
9 WPM + 6-BA 1. 5mg /L + AC 1. 0g /L 4. 78 ± 0. 329Bc
10 MS + 6-BA 1. 5mg /L + NAA 0. 1mg /L + AC 1. 5g /L 2. 97 ± 0. 04Eg
11 Ca2 + + MS + 6-BA 1. 5mg /L + NAA 0. 3mg /L 4. 48 ± 0. 04Cd
12 1 /2MS + 6-BA 1. 5mg /L + NAA 0. 5mg /L + AC 0. 5g /L 1. 53 ± 0. 04Il
13 Ca2 + + MS + 6-BA 2. 0mg /L + AC 1. 5g /L 3. 23 ± 0. 03Ef
14 1 /2MS + 6-BA 2. 0mg /L + NAA 0. 1mg /L + AC 1. 0g /L 4. 05 ± 0. 07De
15 WPM + 6-BA 2. 0mg /L + NAA 0. 3mg /L + AC 0. 5g /L 4. 45 ± 0. 08Cd
16 MS + 6-BA 2. 0mg /L + NAA 0. 5mg /L 1. 79 ± 0. 01GHIjk
2. 4 不同植物生长调节剂组合和继代次数对新梢生
根的影响
将新梢转接至生根培养基上，最早在第 10 天可观
察到不定根发生，茎芽生长势良好，30d 均可长达 3cm
以上。由表 4 可知，培养基中添加适宜浓度的 IBA 可
获得较理想的生根效果，添加 3. 0mg /L 的 IBA 主根呈
放射状，须根数量多，最多达 6 根(图 1 － H)主根长达
5. 2cm，利于移栽成活。合适浓度的 NAA 对不定根的
分化有明显促进作用。NAA 1mg /L + IBA 3mg /L 的培
养基比 NAA 1. 5mg /L + IBA 3mg /L 的培养基不定根诱
导率增加 17. 25%，根数增加 31. 25%。愈伤组织与生
根有一定联系，从表 4 可以看出，不定根诱导率高，愈
伤组织的量也多，这表明愈伤组织的产生对不定根的
分化有促进的作用。
为确定继代培养对牡丹离体新梢生根的影响，分
别取继代 0、1、3 和 5 次的新梢作外植体，分析继代次
数对生根的影响。结果显示，随继代次数的增加，牡丹
的生根能力显著上升，继代 5 次后其生根率最高，比没
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有继代的对照高 32. 50%，差异极显著。
表 4 不同植物生长调节剂组合对牡丹新梢生根的影响
Table 4 Effects of different plant growth regulator
combinations on rooting of new shoots
植物生长调节剂
plant growth regulator
IBA NAA
生根率
rooting
rate(%)
根条量(条)
root number
根长
root
length
(cm)
愈伤组织
callus
2 0. 5 30. 50 2. 25 ± 0. 25 Ef 3. 0 +
2 1 40. 25 2. 50 ± 0. 5 Dd 2. 8 +
2 1. 5 59. 25 2. 50 ± 0. 00 Dd 2. 5 + +
3 0. 5 70. 25 3. 50 ± 0. 50Cc 2. 7 +
3 1 85. 75 5. 25 ± 0. 75 Aa 2. 5 + +
3 1. 5 68. 50 4. 00 ± 0. 25 Bb 2. 8 + +
4 0. 5 71. 00 3. 25 ± 0. 50 Cc 2. 0 －
4 1 70. 50 3. 50 ± 0. 50 Cc 1. 7 －
4 1. 5 55. 20 2. 75 ± 0. 75Dd 1. 5 +
注:+ +表示愈伤组织质量较好，+ 表示愈伤组织质量好，－ 表示
愈伤组织质量差。
Note:+ +，+，－ means the state of callus were very good，good and
bad，respectively.
2. 5 黑暗处理对牡丹新梢生根的影响
从图 2 可知，没有经过黑暗处理的新梢外植体生
根率为 38. 5%，黑暗处理 12d 后，牡丹的生根率上升
到 85. 4%，与不经黑暗处理的对照相比生根率提高了
1. 22 倍。黑暗处理 8 和 12d 的 2 个处理之间生根率
差异不显著。黑暗处理时间超过 12d，幼苗黄化、瘦
弱，且生长势降低，幼苗移栽成活率相应降低。因此牡
丹试管苗离体生根的最佳黑暗处理时间为 8 ～ 12d。
图 2 黑暗处理对不定芽生根率的影响
Fig. 2 Effect of dark treatment on rooting rate of peony
3 结论与讨论
本试验首次采用将侧芽中雏枝切去 2 /3 高度的方
法，与之前将完整侧芽作为外植体相比［6］，不定芽诱
导率及增殖率均有大幅提高，可能是平切去部分雏枝，
使侧芽营养更容易集中，另外雏枝基部刻伤也可能刺
激了不定芽分化。其确切机理还有待进一步研究。本
试验结果还发现单独使用 6 － BA 增殖率很低，只有与
适当浓度的 NAA 配合使用，才有利于牡丹侧芽增殖，
Bouza［5］，Roberts［7］等在牡丹组培研究中也发现了类似
的现象，原因可能是 6 － BA 有助细胞分裂，继而影响
器官的分化，但 6 － BA 需要与生长素类物质配合，其
刺激细胞分裂与分化的作用更加显著。
研究表明［8 ～ 10］，幼龄态外植体较易诱导细胞脱分
化和再分化形成不定器官原基，嫩茎的生根能力极显
著地强于木质化的老茎。从植物解剖学的角度分析，
不定根的发生取决于根原基的有无和分化的程度，所
以在培养中组织分化程度高的外植体很少出现根原
基，不定根的发生率降低。Welander［11］研究发现，试
管内连续多次继代培养能使成龄树体复幼，恢复其不
定根发生的能力。本试验结果也表明，继代 5 次的新
梢发生不定根的能力显著高于对照。
生根培养是木本植物组织培养的关键，牡丹无根
苗接种到培养基 (1 /2WPM + IBA 3. 0mg /L + NAA
1. 0mg /L)上，黑暗处理 8 ～ 12d 后，在白天温度 20℃ ±
1℃、光照时数 14h /d、光强 2500lx、夜间温度 15℃ ±
1℃条件下进行培养，生根率达 85. 75%，从而建立了
牡丹侧芽再生体系，为以后的牡丹快繁、遗传转化技术
在牡丹育种中的应用奠定了基础。
参考文献:
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(责任编辑 王媛媛)
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