全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 062427204
甘蓝型油菜陕 2A 细胞质雄性不育
的遗传及 RAPD 标记
张明龙　林宝刚　章徐鸯　崔海瑞　夏英武
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘　要 :本研究以甘蓝型油菜陕 2A 细胞质雄性不育系、保持系和 F2 分离群体为材料 ,对 F2 分
离群体的遗传分离情况进行分析 ,结果表明 ,可育与不育株花器存在明显差异 ,符合 3∶1 的分
离比例 ,因而推断细胞质雄性不育恢复基因受 1 对显性基因控制。利用分离群体分组分析法
(BSA) ,用 105 个随机引物对细胞质雄性不育恢复基因进行 RAPD 分析 ,发现有 6 个随机引物
扩增出多态性差异谱带。引物 S62和 S74在可育和不育基因池中扩增出单条特异性谱带所代表
的 DNA 序列 ,很可能与不育系的恢复基因连锁。
关键词 :甘蓝型油菜 ;细胞质雄性不育 ;F2 分离群体 ;分组分析法 ;RAPD 标记
STUDY ON INHERITANCE AND RESTORING GENE LINKED RAPD MARKERS OF
CYTOPLASMIC MALE STERILITY OF SHAN 2A( Brassica napus L. )
ZHANG Ming2long 　LIN Bao2gang 　ZHANG Xu2yang 　CUI Hai2rui 　XIA Ying2wu
( Institute of Nuclear Agricultural Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 310029)
Abstract :The inheritance of cytoplasmic male sterility (CMS) of Shan 2A( Brassica napus L) , were studied in F2
population. The results of the floral traits suggested that the ratio of the lengths of pistil to stamen could be used to
distinguish fertile from sterile plant . The 3∶1 segregation ratio of fertile to sterile in F2 population indicates that
there is only one dominant fertility2restoring gene which contributes to the regenesis of the fertility of Brassica napus
L. Bulked segregant analysis (BSA) was used to identify random amplified polymorphic DNA ( RAPD) markers
linked with the fertility2restoring gene of Cytoplasmic Male Sterility in Shan 2A. Totally 105 random 102mer primers
ware screened for both the DNA samples of fertile and sterile bulks. Six primers produced repeatable and differential
polymorphic bands between the paired bulks. The differential main bands produced by primers S62 and S74 could be
the DNA sequence which links the restoring gene.
Key words : Brassica napus L ; cytoplasmic male sterility ; F2 population ; bulked segregant analysis ; RAPD markers
收稿日期 :2003207231
基金项目 :浙江省科委重点攻关课题“杂交油菜”项目 ( G20010280)
作者简介 :张明龙 (1952～) ,男 ,浙江杭州人 ,副研究员 ,主要从事“作物诱变育种及油菜杂种优势利用”的研究。
陕 2A 细胞质雄性不育系是李殿荣 (1976) 继傅廷栋 (1972) 在甘蓝型油菜品种中首次发现波里马细
胞质雄性不育系 (Pol cms) 后取得的又一重大发现 ,用此配制的三系杂交种秦油 2 号 (陕 2A ×垦 C1) ,是
国际上第 1 个通过品种审定并大面积应用于生产的三系杂交种[1～4 ] 。伊岚等[5 ] 对陕 2A 和陕 2B 的脂酶
及过氧化物酶同工酶特征进行了研究。杨光圣等[6 ]提出 ,甘蓝型油菜陕 2A 细胞质雄性不育的主效恢复
基因存在于白菜型、甘蓝型、和芥菜型油菜中 ;育性半恢复基因存在于白菜型和甘蓝型油菜中。
Marshall (1994)等利用 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA ,随机扩增多态性 DNA) 技术成功地
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检测油菜杂交种的纯度[7 ,8 ] 。段院生等用 RAPD 标记鉴定甘蓝型油菜杂种纯度 ,结果与田间育性调查结
果完全一致[9 ,10 ] 。但利用 RAPD 标记油菜 CMS 育性恢复基因报道较少 ,对陕 2A CMS 育性恢复基因标记
尚未见报道。本研究以我国杂交油菜生产上广泛应用的陕 2A CMS 体系为材料 ,研究其 F2 群体地遗传
分离情况 ,寻找与油菜 CMS 育性恢复基因相关的 RAPD 标记 ,为今后利用分子标记鉴定陕 2A CMS 杂
种 ,改良不育系 ,选育优良保持系和恢复系打下基础。
1 　材料与方法
111 　材料
以陕 2A 细胞质雄性不育类型的垦油 2 号杂交种及其相应的不育系 026A ,保持系 026B 及恢复系
NK3 和其后代 F2 分离群体为研究材料。dNTP、10 ×buffer、marker、10bp 的随机引物和 Tag 酶均购自上海
Sangon 生物技术公司。
112 　方法
11211 　群体的获得和育性调查 　所有供试材料于 2000 年 10 月 5 日育苗 ,11 月 5 日田间定植 ,026A、
026B 和 NK3 各移栽 50 株。2001 年对 F2 分离群体在花期挂牌标记 ,取定点植株测定花器形态 ,同时进
行田间育性调查 ,统计可育株和不育株的分离比例。
11212 　RAPD 群体构建 　将分离群体中的个体依据育性分成两组 ,分别取可育株和不育株各 12 株的嫩
叶 ,在每一组群中将所取各单株材料的 DNA 等量混合 ,形成可育基因和不育基因 DNA 混合池。
11213 　油菜 DNA 提取 　参照改良的 CTAB 法提取叶片总 DNA[11 ] 。用紫外分光光度计测定 OD260 (计算
样品 DNA 含量)和 OD280 ,并计算 OD260ΠOD280 ,确保 DNA 的纯度。
11214 　PCR 反应 　25μl 的 PCR 反应体系包括 :10 ×Buffer 215μl、MgCl2 (15mmolΠL) 215μl、dNTP (215mmolΠ
L) 215μl、Taq 酶 1μl、引物 (20ngΠμl ) 1μl、模板 DNA (10ngΠμl ) 2μl 和超纯水 1315μl。PCR 反应程序包括 :
94 ℃5min ;然后进行 35 个循环 ,每个循环包括 94 ℃45s ,36 ℃90s ,72 ℃90s ,最后在 72 ℃下延伸 7min ,4 ℃
保存。
11215 　琼脂糖电泳分离 　扩增后的产物加入含有溴酚兰的上样缓冲液 ,然后通过 112 %的琼脂糖凝胶
(含 EB 015μgΠmL)在 60V 电压上进行电泳分离 ,检测扩增产物的多态性。在紫外灯下观察并拍照。
2 　结果与分析
211 　不育系的育性鉴定与 F2 分离群体遗传分析
傅廷栋、余凤群等[6 ]对陕 2A CMS 系的不育机理从细胞学、遗传学等方面进行了研究 ,确定陕 2A
CMS系的败育时期为孢原细胞分化期 ,败育的典型特征是不能形成花粉囊。本实验室曾对该材料不育
系、保持系以及恢复系花器做了详细的调查和研究工作 ,对三系花器雌雄蕊比例进行方差分析。结果表
明不育系与保持系、恢复系雌雄蕊比例差异显著 ,而恢复系与保持系之间无差异 ,因此 ,可以用雄蕊Π雌
蕊值来判定育性。本研究中 F2 分离群体的所有不育株的花器均比可育株小得多 ,雄蕊的花丝短 ,花药
内极少或无花粉粒。不育株雄蕊Π雌蕊值在 0140 左右 ,均小于 0155 ;而可育株雄蕊Π雌蕊值在 110 左右 ,
均大于 0182 ,其比值显著大于不育株。不育株与可育株从表型上很容易辨别。本研究根据花器调查结
果和表型观察 ,划分不育株和可育株 ,统计分析 F2 分离群体的分离情况 (表 1) 。群体中共出现了 75 株
可育株 ,29 株不育株 (卡方分析 x2 = 014615 , x20105 = 3184) ,符合 3∶1 的分离比例 ,表明陕 2A 胞质雄性不
育系其育性恢复受一对显性基因控制。
212 　集团间多态性引物的筛选
研究中用来扩增检测可育和不育 DNA 池的多态性所用的 105 个核苷酸随机引物中 ,50 个随机引物
没有扩增出任何条带 ,55 个随机引物扩增出多态性条带 ,占引物总数的 5214 % ,共扩增出 346 条多态性
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带 ,平均每条引物扩增出 3130 条。扩增出的条带中 ,大部分引物在两基因池间的带型完全相同 ,但其中
有 6 个随机引物在两基因池间扩增出了差异的条带 ,6 个引物的碱基序列见下表 2。
表 1 　F2 分离群体( 026A ×NK3 )遗传分析
Table 1 　Inheritance analysis of F2 population
(026A ×NK3 )
育性
fertility
实际株数
actual
plants
理论概率
theoretical
probability
理论株数
theoretical
plants
雄性可育
male fertile
75 0175 78
雄性不育
male sterile
29 0125 26
合计
total
104 1. 00 104
表 2 　6引物对 F2 分离群体中不育和可育基因池的扩增结果
Table 2 　6 primers amplified results 6 primers of
sterile and fertile gene bank in F2 population
引物
primer
碱基序列
base sequence
可育基因池带数
band’s number of
fertile gene pool
不育基因池带数
band’s number of
sterile gene pool
S83 GAGCCCTCCA 10 6
S76 CACACTCCAG 0 6
S74 TGGGTGGTG 1 0
S62 GTGAGGCGTC 2 1
S42 GGACCCAACC 0 1
UBC69 GAGGGCAAGA 2 2
213 　甘蓝型油菜陕 2A cms 系统不育恢复基因的 RAPD 标记
表 2 中 6 个引物在两个基因池间扩增出的多态性条带在数目、位置以及强弱上存在明显差异。这
些差异可分为以下 4 个类型 (图 1) 。
图 1 　引物 S42 、S74 、S76 、S83 、UBC69和 S62 RAPD 电泳图谱
Fig. 1 　Profile of RAPD products amplified with primers S42 、S74 、S76 、S83 、UBC69 and S62
1、3、5、7、9、12 分别为引物 S42、S74、. S76、S83 和 UBC69 对可育基因池的扩增结果 ;2、4、6、8、10、13 分别为以上引物对不育基因池的扩
增结果 ;11 :marker
Lane 1、3、5、7、9、12 are amplified results of fertile gene pool with primers S42、S74、S76、S83 and UBC69 ; Lane 2、4、6、8、10、13 are amplified results
of sterile gene pool with above primers ; 11 :marker
　
21311 　谱带类型 Ⅰ　可育基因池比不育基因池多一条主带 ,引物 S62和 S74属此类型。从图 12b 可看出 ,
S62在不育基因池中扩增出 1 条主带 ,而可育基因池有 2 条 ,1 条为两基因池共有带 ,而另外 1 条为不育
基因池所没有的特异主带。图 12a 中 S74在可育基因池中扩增出 1 条谱带 ,不育基因池中没有扩增出任
何谱带。因此 ,这 2 条特异主带所代表的 DNA 序列可能与甘蓝型油菜陕 2A 细胞质雄性不育的恢复基
因相连锁。
21312 　谱带类型 Ⅱ　可育基因池没有扩增出条带 ,而不育基因池扩增出多条主带 ,如引物 S42 和 S76 。
S42在可育基因池扩增出的主带数为 0 ,在不育基因池却有 5 条 ,分子量分别约为 2500、2000、900、800 和
600bp ,其中 ,分子量最大的两条亮度也最大。S76在可育基因池没有扩增出条带 ,但不育基因池扩增出了
6 条主带 ,其中 1 条大小约为 1200bp 左右的主带最亮 ,另外还有 1 条大小约为 1030bp 的主带。
21313 　谱带类型 Ⅲ　两基因池均扩增出较多主带 ,而且主带的数目和位置均呈现出较大差异。引物
S83在两个基因池间扩增出的差异性条带较复杂。不仅在主带的数目上有所差异 ,几条主带的位置也表
现出较大的差异。可育基因池扩增出 10 条主带 ,而不育基因池有 6 条主带 ,除了 1 条分子量约为
924　6 期 甘蓝型油菜陕 2A 细胞质雄性不育的遗传及 RAPD 标记
2000bp 的主带为二者共用外 ,其余条带的位置均不相同。
21314 　谱带类型 Ⅳ　两基因池扩增出的多态性带数目相同 ,但带的位置不同。引物 UBC69对两基因池
扩增出的多态性带数目均为 2 条 ,但带的位置明显不同。
3 　讨论
对甘蓝型油菜陕 2A CMS 的 F2 分离群体植株进行的田间花器形态观察和育性调查显示 ,F2 分离群
体的育性分离符合 3∶1 的比例 ,表明育性恢复基因受 1 对显性基因控制。用 105 个随机引物对可育基
因和不育基因混合池进行扩增 ,S62和 S74等 6 个引物在两基因池间扩增出了可能与不育系恢复基因连锁
的特异性谱带 ,用引物 S62对分离群体的不同个体单株 DNA 进行 RAPD 分析 ,进一步证实了 S62扩增的特
异性谱带所代表的 DNA 序列与恢复基因连锁。
311 　RAPD 标记转换的必要性及方法
RAPD 分析是以 PCR 技术为基础 ,在全基因组水平上检测 DNA 变异的一种简单、快速、有效的分析
方法 ,灵敏度高 ,但稳定性差 ,有时需要通过多次重复才能确定差异的可靠性。另外 ,RAPD 标记多为显
性标记 ,不能将显性纯合体与杂合体基因型区别开来。因此 ,有必要将 RAPD 标记转换为 RFLP 标记、
STS 标记 (Sequence - tagged Site)和 SCAR[12 ] (Sequence Characterized Amplified Region) 。
312 　群体构建方法
利用分离群体分组分析法 (BSA 法)把 F2 分离群体分成可育和不育 2 组 ,然后把 2 组中植株叶片的
DNA 混合 ,形成可育和不育 DNA 混合池。由于分组时仅对育性性状进行选择 ,因此 ,两混合基因池间理
论上就只有在育性基因区段存在差异。BSA 法是从近等基因系分析法演化而来的 ,它克服了许多作物
没有或难以创建相应的 NIL 的限制 ,在自交和异交物种中均有广泛的应用前景。它不用连续回交培育
近等基因系 ,大大缩短了获得分子标记的时间。
参考文献 :
[ 1 ] 　田志宏. 油菜细胞质雄性不育及杂种优势利用研究进展. 湖北农学院学报 , 1997 , 17 (2) : 151～158
[ 2 ] 　傅廷栋 , 杨光圣 , 杨小牛 ,等. 甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育的研究与利用. 作物研究 , 1990 , 4 (3) : 9～12
[ 3 ] 　刘公社 , 赵泓 , 刘杰 ,等. 分子标记技术及其在芸薹属植物研究中的应用. 植物学通报 , 1998 , 15 (2) : 67～72
[ 4 ] 　王永飞 , 马三梅 , 王 鸣 ,等. 油菜 Polima 和陕 2A 细胞质雄性不育系相关基因的序列比较. 科学通报 ,2001 , 46 (18) :1559～1564
[ 5 ] 　伊岚 , 李殿荣. 甘兰型油菜细胞质雄性不育系陕 2A 和保持系陕 2B 的生化比较. 西北农业学报 , 1997 , 6 (2) : 39～41
[ 6 ] 　余凤群 ,傅廷栋. 甘蓝型油菜几个雄性不育系花药发育的细胞形态学研究. 武汉植物学研究 ,1990 , (3) :209～216
[ 7 ] 　Marsharll P. Marchand M.Lisieczko Z. A simple method to estimate the percentage of hybridity in canola ( Brassica napus) F1 hybrids Theor.
Appl . Genet . 1994. 89 :853～858
[ 8 ] 　Handa H , Nakajima K. Different organization and altered transcription of the mitochondrial atop gene in the male sterile cytoplasm of rapeseed
( Brassica napus L. ) . Current Genetics. 1992 , 21 :153～159
[ 9 ] 　段院生 ,刘平武 , 杨光圣. 用 RAPD 标记鉴定甘蓝型油菜杂种 H9909 的纯度. 华中农业大学报 , 2002 , 4 (21) ,301～305
[10 ] 　王道杰 , 王灏 ,杨翠玲 ,等. 油菜雄性不育分子机理研究进展. 中国农学通报 , 2001 ,17 (2) :43～46
[11 ] 　宋国立 ,崔荣霞 ,王坤波 ,等. 改良 CTAB 法快速提取棉花 DNA. 棉花学报 , 1998 ,10 (5) :273～275
[12 ] 　王俊霞 ,杨光圣 ,傅廷栋 ,等. 甘蓝型油菜 Pol CMS育性恢复基因的 RAPD 标记. 作物学报 , 2000 , 26 (5) :575～578
034 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2004 ,18 (6) :427～430