全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551 (2000) 0420218207
模拟微重力条件下马铃薯的同工酶
检测及 RAPD 产物分析
薛　淮　刘　敏　王亚林　张纯花　李社荣
(中国科学院遗传研究所 ,北京　100101)
摘 　要 :为研究微重力条件下对植物生长发育的影响 ,本试验通过微重力仪连续改变
方向来获得模拟微重力条件 ,对该模拟条件下马铃薯的组培苗进行了过氧化物酶同
工酶谱及 RAPD 分子标记的实验。结果表明 ,微重力条件下马铃薯植株的过氧化物
同 Ⅰ酶谱出现了新的谱带且同工酶活性高于对照。RAPD 方法利用 10 碱基随机引
物扩增基因组 DNA ,结果说明其遗传物质没有发生变化。在微重力处理 1 周后检
测 ,发现处理与对照之间的过氧化物同 I 酶谱基本趋于一致 ,RAPD 检测两者之间遗
传物质一致。
关键词 :回转仪 ;微重力 ;过氧化物同工酶 ;RAPD
收稿日期 :2000203210
基金项目 :国家 863 基金资助 (863222722213)
作者简介 :薛淮 (19732) ,女 ,江苏常州人 ,中国科学院遗传研究所助理研究员 ,主要从事植物的细胞遗传与空间诱变方
面的研究工作。
宇宙空间中存在着微重力、高真空和各种不同能量的宇宙射线 ,与人类及各种动植物在地
球上的生存环境有着巨大的差异。这样的外界因素对生命物质的生存、生长和发育提供了一
个诱变的特殊场所。因此 ,空间环境对人类和各种生物的影响一直是科学家关注的问题[1 ] 。
而微重力作为空间环境的关键因素之一 ,向来是一个重要的研究内容。
有关微重力影响酶活性的研究报告并不太多 ,吴敦肃[2 ]等在研究水稻回转对水稻幼苗叶
细胞的影响时发现细胞质膜上 Ca2 +2A TP 酶活性消失。Rasmussen O 等[3 ]发现微重力条件下
细胞内可溶性蛋白浓度增加 ,但细胞质中过氧化物酶同工酶活性降低。而 Hoffmann E 等[4 ]以
烟草为材料 ,通过 SDS2PA GE 和免疫杂交反应研究蛋白类型 ,发现各种蛋白都没有表现出依
赖重力的效应。Hampp R 等[5 ]报道微重力状态下细胞聚合的行为改变 ,某些酶 (小麦的过氧
化物酶、酯酶等)的活性升高 ,并且指出酶活性的改变为生理性而非结构性的。
近年来 ,随着分子生物学技术的飞速发展 ,特别是 Williams[6 ]等 RAPD ( Random Amplified
Polymorphic DNA) 的建立 ,使从分子水平检测遗传物质的多态性成为可能。RAPD 是用一系
列随机排列的寡聚核苷酸单链为引物 ,对所研究的基因组 DNA 进行 PCR 扩增 ,进而分析整个
基因组的多态性。
有相当多的文献报道了经空间飞行后植物种子后代出现变异株 ,在对选育后的变异株进
行分子遗传学分析时 ,发现与对照样品有明显的差异[7～9 ] 。但在单纯的微重力作用下 (排除
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空间的真空状态、粒子辐射等因素) ,植物体的遗传物质是否发生变异则少有报道。Driss2
Ecole2D[10 ]在其研究报道中指出微重力影响 DNA 的合成水平 ,但微重力是否引起 DNA 的变
异的研究尚未开展。
目前除利用卫星塔载和高空气球外 ,还经常利用回转仪来进行模拟微重力的实验。本研
究对模拟微重力条件下的马铃薯进行过氧化物酶同工酶谱及 RAPD 分子标记的实验 ,检测其
在微重力条件下过氧化物酶同工酶活性及遗传物质的变化。
1 　材料与方法
111 　实验材料
马铃薯 ( Solanum t uberosum L . )组培苗由本实验室提供。
模拟微重力回转器是按重力补偿原理研制的回转装置 ,水平回转按 Silver 理论 ,在角速度
01209 弧度/ s (相当于 2rpm)的条件下 ,作用于植物的总重力为零。材料在水平回转仪上转动
168h。
取生长势相等的马铃薯试管苗 ,在超净台上将 1 瓶试管苗等分为数瓶 ,尽量使其苗高、茎
粗和生长势相等。一半作模拟微重力实验 ,一半作对照。
112 　过氧化物酶同工酶谱检测
11211 　样品制备 　称取样品 200mg ,经自来水、双蒸水冲洗后放在清洁纸上吸干 ,剪碎后置于
1ml 玻璃匀浆器中 ,加 112 倍体积的 Tris2柠檬酸缓冲液 ( 4165gTris + 013g 柠檬酸钠 +
dH2O300ml ,p H812)冰浴研磨成浆 ,后把提取液全部挤压入匀浆器的颈部 ,用 7 号针头的玻璃
器将提取液吸入 115ml 离心管中 ,再向匀浆器中加等体积的 10 %甘油 ,并匀浆数次。测定每
管中样品的紫外吸收光值 ,计算总蛋白含量。将离心管放置低温冰箱保存备用。
11212 　聚丙烯酰胺凝胶储液的制备、凝胶板的制备、电泳及染色 　参照牛敏英和赵孟莲[11 ]的
方法 ,采用 7 %的分离胶和 4 %的浓缩胶。
11213 　记录 　用光密度计扫描记录。
113 　PAPD 分子标记检测
11311 　DNA 提取 　取叶片 012g 左右剪碎后放入匀浆器中 ,加入 600～800μl 的 DNA 提取液
( Tris2HCI200mmol/ L ,NaCl 250mmol/ L , ED TA25mmol/ L ,015 %SDS) 冰浴中研磨成浆 ,将匀
浆转入 115ml 离心管中。加入等量酚∶氯仿抽提液 ,混匀后处理 15～20min ,离心 ,取上清液至
另一新离心管 ;加入等体积氯仿∶异醇 (24∶1)抽取 2 次 ;取上清液加入 2 倍体积冰乙醇 ,低温冰
箱中过夜后离心 ,倾去乙醇 ,并加入 75 %乙醇洗涤 2～ 3 次 ; 倾去乙醇 ,室温凉干 ,溶于
200μl TE ,并测定 DNA 含量。
11312 　DNA 扩增反应 　引物购自华美公司 ,为 Operon 公司生产的 10 碱基的随机引物 ,碱基
序列如下 :
912　4 期 模拟微重力条件下马铃薯的同工酶检测及 RAPD 产物分析
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KL TD
　　D201 　ACCGCGAAGG　D211 　AGCGCCATTG
　　D202 　GGACCCAACC 　D212 　AGCGCCATTG
　　D203 　GTCGCCGTCA 　D213 　GGGGTGACGA
　　D204 　TCTGCTGAGG　D214 　CTTCCCCAAG
　　D205 　TGAGCGGACA 　D215 　CATCCGTGCT
　　D206 　ACCTGAACGG　D216 　AGGGCGTAAG
　　D207 　TTGGCACGGG　D217 　TTTCCCACCG
　　D208 　GTGTGCCCCA 　D218 　GAGAGCCAAC
　　D209 　CTCTGGAGAC 　D219 　CTGGGGACTT
　　D210 　GGTCTACACC 　D220 　ACCCGGTCAC KL TO 　　0201 　GGCACGTAAG　0211 　GACAGGAGGT0202 　ACGATGCGTC 　0212 　CAGTGGTCTG0203 　CTGTTGCTAC 　0213 　CTCAGAGTCC0204 　AAGTCCGCTC 　0214 　AGCATGGCTC0205 　CCCAGTCACT 　0215 　TGGCGTCCTT0206 　CCACGGGAAG　0216 　TCGGCGGTTC0207 　CAGCACTGAC 　0217 　GGCTTATGCC0208 　CCTCCAGTGT 　0218 　CTCGCTATCC0209 　TCCCACGCAA 　0219 　GGTGCACGTT0210 　TCAGAGCGCC 　0220 　ACACACGCTG
25μl 扩增体系 : Tris2HCl 100mmol/ L ( p H813 ) , KCl 50mmol/ L , MgCl2 15mmol/ L , dN TP
200nM ,100ng 引物 ,110 单位 TaqDNA 聚合酶和 50～500ng 模板 DNA。反应程序 :92 ℃预变
性 3min ,反应过程为 35 个循环 ,包括 37 ℃复性 1min ,72 ℃延伸 2min ,92 ℃变性 1min ,完成最
后一个周期后在 72 ℃保温 1min ,样品取出后迅速放入 4 ℃低温冰箱保存。
11313 　电泳检测 　取 10μl 扩增物与 2μl 溴酚蓝 (0125 %溴酚蓝 ,40 %蔗糖水溶液) 混匀 ,点入
含 EB 015ng/ ml 的 112 %琼脂糖凝胶中 ,电泳缓冲液为 1 ×TAE( Tris2HCl 0104mol/ L , , ED TA
01001mol/ L) ,在 5V/ cm 电泳强度下电泳约 1h。
11314 　照相 　取出凝胶 ,在紫外灯下观察并照相。
2 　结果与分析
211 　模拟微重力条件对马铃薯过氧化物酶同工酶谱的影响
表 1 　微重力处理后过氧化物酶同工酶谱的扫描分析
Table 1 　Peroxidase isoenzymes analysis of potato under simulated microgravity
样品
sample
M G CK
迁移率 (mm)
braid mobility
M G CK
条带百分比
braid constitution
percentage ( %)
M G CK
光密度值
OD(Z)
M G CK
光密度值差百分比
percentage of
OD difference
CK2M G
CK ×100 %
1 4190 11232 01378
2 1’ 10100 10130 41000 19167 01415 01318 30150 %
3 16110 11611 01424
4 24160 311861 01644
5 2’ 27140 28110 221980 321750 01567 01394 43191 %
6 29170 1515000 01500
7 3’ 31160 32110 101355 271296 01442 01347 27138 %
8 4’ 3418 35120 11471 71528 01281 01240 4188 %
9 5’ 38160 39100 31664 01968 01265 01142 86162 %
10 6’ 41140 41140 71326 121287 01238 01165 44124 %
　　注 :M G—为经微重力处理的样品 ;CK—为地面对照
　　Note :M G—Under simulated microgravity ;CK—Control
　　从图版 Ⅰ、表 1 可以看出 ,对照出现 6 条过氧化物酶同工酶谱带 ,而经模拟微重力处理后 ,
谱带数增加为 10 条 ,其中 2、5、7、8、9 和 10 带分别对应于对照的 1～6 条带 ,具有相似的迁移
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率。1、3、4 和 6 带在对照上没有相应的带 ,为新出现的带。尤其第 4、6 带在处理中各占有
31186 %和 1515 %的比例 ,与对照相比差异明显。
另外 ,从 OD 值差异百分比可以看出两者的 OD 值也有很大的差别 ,处理较对照所有的谱
带活性都强 ,第 9 带与对照的差异高达 86162 % ,主带第 5 带也比对照高 43191 %。
因此 ,从同工酶谱的扫描分析来看 ,微重力处理下的马铃薯的过氧化物酶同工酶活性大大
增强 ,并且有新的谱带出现。
为了检测微重力对植物生长发育的影响是否能长久保持 ,本实验在微重力处理后将处理
与对照继续培养 1 周 ,然后再比较两者在各方面的差异。
图版 Ⅰ 微重力条件下马铃薯的过氧化物酶同工酶谱
Plate. Ⅰ　Comarison of peroxidaes
isoenzymes of potato
微重力处理 1 周 (1 ,2CK ,3 ,4M G)
Under simulated microgravity one week
脱离微重力 1 周后 (5 ,6CK ,7 ,8M G)
A week after get out of microgravity
图版 Ⅱ　微重力条件下马铃薯的 RAPD
Plate. Ⅱ　PAPD photographs of potato
under simulated microgravity
CK:1 ,2 ,5 ,6 ,9 ,10 　　M G:3 ,4 ,7 ,8 ,11 ,12
图版 Ⅲ　微重力条件下马铃薯的 RAPD
Plate. Ⅲ　PAPD photographs of potato under simulated microgravity
CK:1 ,2 ,5 ,6 　　M G:3 ,4 ,7 ,8
122　4 期 模拟微重力条件下马铃薯的同工酶检测及 RAPD 产物分析
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表 2 　脱离微重力 1 周后马铃薯过氧化物酶同工酶谱扫描分析
Table 2 　Peroxidase isoenzymes analysis of potato a week after get out of microgravity
样品
sample
M G CK
迁移率
braid mobility
(mm)
M G CK
条带百分比
braid constitution
percentage ( %)
M G CK
光密度值
OD(Z)
M G CK
光密度值差异百分比
percentage of
OD difference
CK2M G
CK ×100 %
1 1’ 4120 4120 11002 11047 01568 01534 314 %
2 2’ 9180 9151 91324 91807 01525 01473 512 %
3 3’ 25171 25182 291936 321002 01591 01578 113 %
4 4’ 30111 30132 541562 541107 01660 01578 714 %
5 34172 21753 01229
6 5’ 39102 40123 21424 11037 01162 01120 712 %
从图版 1、表 2 可以看出 ,脱离微重力 1 周后 ,处理样品出现了 6 条带 ,对照样品有 5 条带 ,除了
第 5 带外 ,处理的谱带都对应于对照有相似的迁移率 ,且 OD 值相差不大 (最大仅为 714 %) ,因
此认为这 5 条带相同。处理的第 5 带的条带百分比为 21753 % ,是一条弱带。
从同工酶谱的扫描分析看来 ,微重力处理下的马铃薯在脱离微重力 1 周后的过氧化物酶
活性基本与对照相同 ,带型趋于一致 ,可以认为植物在脱离微重力处理 1 周后生理状态发生了
恢复。
212 　模拟微重力对马铃薯的 PAPD 分子检测结果的影响
利用 40 个 10 碱基的随机引物对马铃薯的 DNA 进行 PCR 扩增 ,有 29 个引物扩增出了片
段 (D201、D203、D204、D205、D206、D207、D208、D209、D10、D211、D212、D214、D215、D216、D218、D2
19、D220、0201、0202、0204、0206、0207、0209、0211、0212、0215、0216、0218) ,片段大小在 300～
2000bp 之间。为了保证实验的可重复性 ,每次扩增时对照和处理样品均为双份 ,带型观察表
明 ,无论是带的多少还是强弱 ,处理与对照的扩增片段均没有表现出明显的多态性。
脱离微重力 1 周后检测与微重力仪处理完后立刻检测结果相同。
图版 Ⅱ、Ⅲ分别是部分扩增产物的照片。
3 　讨 　论
马铃薯作为一种重要的粮食作物 ,其产量高、用途广 ,是必不可少的食物来源和重要的工
业原料 ,在国民经济中占有重要地位。因此如果能够研究其空间生长规律 ,利用空间育种获得
优良品种 ,将具有重大的社会效益和经济效益。
在本实验所用的微重力模拟回转器中 ,植物垂直于地球重力做慢速转动 ,由于植物对重力
的感受 ,要求有一定的时间[12 ] 。当重力沿一个方向持续作用的时间未达所要求的时间长度之
前就通过回转器的回转改变作用方向以达到模拟失重的效果。这种模拟装置在国际上已被广
泛用做空间实验前的技术准备和空间实验后深入研究的手段[13 ] 。
过氧化物同工酶谱的变化 ,无论是新带出现还是酶活性增强 ,都可以从一个方面反映出微
重力下植物生长发育的变化。过氧化物酶一般被认为是一类能利用 H2O2 氧化供氢体的酶。
在高等植物中 ,过氧化物酶广泛而大量的存在并且是高度多型的 ,其功能是多种多样而又互异
的 ,在植物不同的生长发育期 ,过氧化物酶同工酶的数量和活性都会有很大的变化 ,植物激素
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也会影响它的酶谱 ,另外感病、辐射、乙烯处理也会导致过氧化物酶活性迅速增加。由此可见 ,
微重力对植物过氧化物酶的影响类似于感病、辐射等不利条件。植物正常的生活环境改变后 ,
它的正常生理活动肯定要受到影响 ,微重力条件下过氧化物酶同工酶发生变化 ,正是植物对环
境变化作出的反应之一。由于 RAPD 检测其遗传物质没有变化 ,因此推测 ,变化最早只能是
发生在酶合成的转录过程或以后至蛋白的后加工过程 ,而不会是因为基因的改变导致酶合成
变化。运用 RAPD 技术分析基因组之间的差异 ,样品用量少 ,多态性强 ,容易检测 ,但是也有
对试验条件过于敏感 ,重复性差的缺点。本试验表明 ,只要严格控制 RAPD 反应的步骤和试
验条件 ,完全可以得到令人满意的重复性。实验结果表明 ,微重力下植物的遗传物质没有发生
明显变化。而本实验室曾利用 RAPD 方法检测太空搭载的甜椒和黄瓜 ,结果都表明太空搭载
的样品在遗传物质上与地面对照有差异。微重力下处理与对照的遗传物质的一致 ,一是可能
处理时间太短 ,植物没来得及在 DNA 水平上作出反应 ,二是可能单纯的微重力不会引起植物
在 DNA 水平上发生变异 ,也就是可能单纯微重力下的变异仅仅是生理上的变异。
Grigor’ev AI[14 ]曾指出在长期微重力状态下 ,生物机体会建立一种相对稳定的动态平衡。
但无论国外还是国内 ,都未见有植物在微重力状态下的变化在脱离微重力后继续保持还是恢
复的报道。本实验发现在脱离微重力 1 周后 ,过氧化物酶同工酶原来的显著差异趋向消失 ,也
就是说 ,植物在 1 周的时间内出现了不同程度或者完全的恢复。这种现象还未见报道。有可
能因为微重力处理没有影响植物的 DNA ,而仅仅从生理方面给予类似胁迫的作用 ,结果是在
微重力消失后植物逐渐恢复了正常。王琳清等[15 ]提出多细胞机体中空间诱变产生的损伤具
有随机的性质 ,有的细胞可能受严重损伤而死亡 ,有的受损伤轻微 ,也有的没有什么损伤 ,有机
体在受空间条件作用后有修复、恢复的能力 ,甚至在细胞群间、未受损的细胞对受损细胞以及
一个细胞内不受损的部分对受损部分 ,也有“接管”的代谢过程 ,并使其恢复到正常水平的能
力。
关于微重力影响植物生长发育的机制 ,现在一般认为 :当外界微重力信号被细胞膜表面受
体分子识别后 ,可通过调节质膜上 Ca2 + 转运系统 ,或经过磷酸肌醇信使系统把刺激信号传递
给细胞内贮钙体 ,引起贮钙体内 Ca2 + 的释放 ,使细胞质内 Ca2 + 浓度发生改变 ,从而影响与一
些钙受体蛋白的结合 ,其中最重要的是 CaM (钙调蛋白) 。Ca2 +2CaM 是 A TP 酶和蛋白质激酶
等植物体内多种重要酶的活性调节剂 ,是位于多种细胞信息传递中心的 Ca2 + 第二信使系统的
重要组成成分[16 ] 。
但是 ,关于微重力影响植物生长发育的机制的假说还缺乏足够的实验支持 ,对微重力的诱
变效应的研究也多侧重于直观描述 ,应深入探讨植物在微重力下的生化和分子生物学机理 ,研
究各因素间的相互作用 ,从而在空间育种方面更好的了解并利用微重力。
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PEROXIDASE ISOENZYMES ANALYSIS AND RAPD MOL ECULAR
DETECTION ON POTATO UNDER SIMULATED MICROGRAVITY
XU E Huai 　L IU Min 　WAN G Ya2lin 　ZHAN G Chun2hua 　L I She2rong
( Instit ute of Genetics , Chinese Academy of Sciences , Beiji ng ,100101)
ABSTRACT :To Study the effects of microgravity on plant growth and development , the biologi2
cal differences were analysed in potato grown respectively in the simulated microgravity condi2
tions and their correspondent ground controls.
Isonenzymes analysis indicated that the microgravity samples showed differences in peroxi2
dase :some new isoenzymes appeared and the activity of peroxidase increased. However , RAPD
exhibited that genomes are not altered under simulated microgravity , one week after the treat2
ment of microgravity , the peroxidase bet ween the control and treatment samples tend to resem2
blances. RAPD detection indicated that genomes of control and treatment samples are the same.
Key words :clinostat ; microgravity ;peroxidase isoenzymes ; RAPD
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2000 ,14 (4) :218～224