全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 042404206
小麦花药蛋白质组双向电泳技术体系的优化
陈蕊红　张改生　刘　卫　叶景秀　牛　娜
(西北农林科技大学 ,陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室Π小麦育种教育部工程研究中心 ,陕西 杨凌　712100)
摘 　要 :以小麦单核期花药为材料 ,比较了两种不同蛋白质提取方法 TCAΠ丙酮法和酚提取法及不同的蛋
白质裂解液组成对双向电泳的影响 ,并在蛋白质上样量和 SDS2PAGE 胶浓度等方面也进行了探索与优
化。结果表明 ,采用 TCAΠ丙酮提取法比用酚提取法提取的蛋白质所得的 22DE 胶图谱上蛋白质点数增
加 ,图谱背景也比较清晰 ;样品溶解于含有硫脲和 TBP 的蛋白质裂解液 Ⅱ中 ,可显著提高蛋白质的溶解
性 ,在 22DE图谱上可分辨出 554 个蛋白质点 ,比用蛋白质裂解液 Ⅰ提取的蛋白多 39 个点。以 TCA2丙酮
法提取小麦花药组织中的蛋白 ,用蛋白质裂解液 Ⅱ[ 7molΠL 尿素、2molΠL 硫脲、4 %CHAPS、2 % TBP、
65mmolΠL DTT、012 %载体两性电解质 (其中 011 % pH 3～10 ,011 % pH4～6) ]溶解蛋白 ,以 pH4～7 线性
17cm的 IPG胶条进行双向凝胶电泳 ,在上样量为 800μg ,13 %SDS2PAGE 胶浓度下 ,蛋白质得到了更好的
分离 ,22DE图谱上可分辨出 631 个蛋白点 ,图谱质量最佳。优化后的双向电泳技术体系 ,适合于小麦花
药全蛋白质的双向电泳分析。
关键词 :小麦 ;花药蛋白 ;蛋白质提取方法 ;蛋白质裂解液 ;双向电泳技术
OPTIMIZATION OF TWO2DIMENSIONAL GEL ELECTROPHORESIS FOR PROTEOME FROM WHEAT ANTHERS
CHEN Rui2hong 　ZHANG Gai2sheng 　LIU Wei 　YE Jing2xiu 　NIU Na
( Shaanxi Key Laboratory of Crop Heterosis ΠWheat Breeding Engineering Research Center ,
Ministry of Education , Northwest A & F University , Yangling , Shaanxi 712100)
Abstract : The effects of different protein extraction methods ( phenol extraction method and TCA2acetone precipitation
method) , and different lysis buffer on two2dimensional electrophoresis (22DE) gels were compared , the loading quantity of
sample and the gel concentrations were also optimized for the analysis of 22DE system on the monokaryotic stage anther of
wheat . The results showed that , samples prepared by TCAΠacetone precipitation had observed more protein spots than phenol
extraction method , and clearer background and protein spots were obtained in the 22DE map . The sample dissolved in the lysis
buffer Ⅱwhich contained thiourea and TBP , could enhanced the protein solubility ,and about 554 protein spots were detected
on the 22DE gels , which was 39 protein spots more than the lysis buffer Ⅰ. The proteins extracted by the TCAΠacetone
method , dissolved protein with the lysis buffer Ⅱ, with pH 4 ～ 7 17cm IPG scip , 800μg loading quantity and 13 %
concentrations of the SDS2PAGE gel , the proteins were well separated ,total 631 protein spots were detected. The optimized
condition of 22DE was suitable for proteomic analysis of wheat anthers.
Key words :wheat ; anther proteins ; protein extraction method ; protein lysis buffer ; two2dimensional electrophoresis
收稿日期 :2008203217 　接受日期 :2008205231
基金项目 :国家自然科学基金项目 (301705760) ;国家“863”重大专项计划 (2002AA207004) ;陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项 (2007ZDKG2
020)
作者简介 :陈蕊红 (19752) ,女 ,陕西渭南人 ,博士在读 ,主要从事小麦雄性不育机理的研究。E2mail :chen. ruih @yahoo. com. cn
通讯作者 :张改生(19512) ,男 ,陕西周至人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事小麦分子细胞遗传及其杂种优势利用研究。E2mail :zhanggsh @public. xa. sn. cn　　自 Wilkins 和 Williams 在 1994 年第一次提出蛋白 质组的概念以来 ,蛋白质组学 (proteomics ) 得到了空前
404　 核 农 学 报　2008 ,22 (4) :404～409Journal of Nuclear Agricultural Sciences
的发展 ,目前已成为功能基因组学的主要研究内容之
一。双向电泳凝胶 ( two2dimensional electrophoresis , 22
DE)作为最经典的蛋白质分离技术 ,经过 30 多年的不
断完善 ,已从最初的载体两性电解质管胶发展到 20 世
纪 80 年代的固相 pH 梯度凝胶电泳[1 ] ,大大提高了双
向电泳的分辨力和重复性 ,使得双向电泳技术几乎成
为开展蛋白质组学研究的首选 ,特别是对于表达蛋白
质组学研究是不可缺少的手段。
随着以 22DE2MS 为核心的蛋白质组学技术的不断
完善和成熟 ,植物蛋白质组学的研究有了长足的发展 ,
近几年 ,关于植物蛋白质组学研究的报道日益增
多[2～5 ] ,一些模式植物 ,如水稻、拟南芥等的花药、花粉
发育的蛋白质组特征也已逐步清晰[6～8 ] 。利用蛋白质
组学技术研究雄性不育系小麦花药发育关键时期 ,蛋
白质或多肽的表达与变化、蛋白质的修饰及互作关系 ,
可以更好地使我们理解花药发育的生理生化机制 ,但
由于小麦花药组织中蛋白质含量较低 ,加之小麦花药
在取材上相对较难 ,这为开展小麦花药双向电泳研究
增加了一定的难度 ,目前尚未见有关小麦花药蛋白质
双向电泳相关的研究工作报道。
本研究以 IPG2IEF 为第一向 , 垂直 SDS2PAGE 为
第二向 ,以小麦单核期花药为材料 ,比较了不同蛋白质
提取方法及蛋白质裂解液对小麦花药总蛋白的提取效
果 ,同时在蛋白质上样量及 SDS2PAGE 胶浓度的选择
上也作了进一步的优化 ,探索出一套适合于小麦花药
的双向电泳技术 ,为开展小麦雄性不育的蛋白质组学
研究提供技术支撑。
1 　材料和方法
111 　试验材料
供试小麦品种为西农 1376A ,于 2005 年秋种植于西
北农林科技大学试验农场 ,2006 年 4 月中旬在田间采集
幼穗 ,依据形态学和镜检特征来判断小孢子发育时期 ,
取单核期的幼穗 ,4 ℃剥取花药 ,置 - 70 ℃冰箱备用。
112 　仪器和试剂
PROTEAN IEF cell 等电聚焦系统 (美国 Bio2Rad 公
司) ,PROTE AN Ⅱxi Cell 垂直电泳系统 (美国 Bio2Rad
公司) ,PowerLook 2100XL 扫描仪 (美国 UMAX公司) 。
pH 4 ～ 7 线性 17cm IPG 干胶条、磷酸三丁酯
(TBP) 、载体两性电解质、矿物油均购自美国 Bio2Rad
公司 ;丙烯酰胺、N ,N′22 甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇
(DTT) 、CHAPS、尿素、硫脲、Tris、甘氨酸、过硫酸铵
(AP) 、碘乙酰胺、TEMED 均为 Sigma 公司进口分装试
剂。其他试剂为国产分析纯。
113 　花药总蛋白质的提取
采用以下 2 种方法提取花药总蛋白 :
TCAΠ丙酮法 :蛋白质提取参照 Damerval C 等的方
法[9 ] ,并略有改动。取新鲜剥取的花药 2g ,液氮中迅
速研磨成细粉 ,加入 2ml 于 - 20 ℃预冷的提取介质
[10 %TCA(WΠV)和含 0107 %巯基乙醇的丙酮溶液 (VΠ
V) ] , - 20 ℃沉淀过夜 ; 4 ℃, 20000g 离心 30min ,弃上
清 , 沉淀悬浮于 2ml - 20 ℃预冷的丙酮溶液 (含
0107 %巯基乙醇) 中 , - 20 ℃沉淀 1h ,同上离心。重复
洗涤沉淀 3～4 次至蛋白为纯白色 ,最后沉淀真空冷冻
干燥成干粉。 - 80 ℃冰箱保存备用。
酚提取法 :取新鲜剥取的花药 2g ,液氮中迅速研
磨成细粉。加入 2ml 的匀浆缓冲液 (20mmolΠL Tris2HCl
(pH 715) , 250mmolΠL 蔗糖 , 10mmolΠL EGTA , 1mmolΠL
PMSF ,1mmolΠL DTT ,和 1 %(VΠV) Triton X2100) ,继续研
磨为匀浆液 ,匀浆液在 20000g 离心 30min。在上清液
中加入等体积 pH 718 的 Tris2饱和酚 ,充分摇荡 ,混匀 ,
10000g ,4 ℃下离心 30min ,回收酚相 ,并加入 5 倍体积
含 011molΠL 乙酸铵的 - 20 ℃预冷甲醇 ,充分混匀 , -
20 ℃下过夜 ,20000g ,4 ℃下离心 20min 沉淀蛋白。沉淀
用含 011molΠL 乙酸铵的预冷丙酮溶液及预冷丙酮分
别洗 2 次 (每次洗后均于 - 20 ℃放置 1h ,然后 18000g ,
4 ℃离心 20min) 。沉淀真空冷冻干燥成干粉 , - 80 ℃冰
箱保存备用。
114 　蛋白质沉淀的溶解
分别称取 20mg 蛋白质干粉 ,以 1mg 蛋白加入 20μl
蛋白质裂解液的比例复溶蛋白 ,并于 37 ℃助溶 1h ,其
间振荡 2 次。采用的蛋白质裂解液如下 :
蛋白质裂解液 Ⅰ:9molΠL 尿素 ,4 %(WΠV) CHAPS ,
65mmolΠL DTT ,012 %(VΠV) 载体两性电解质 Biolyte (其
中 011 %pH 3～10 ,011 %pH 4～6) 。
蛋白质裂解液Ⅱ:7molΠL 尿素 ,2molΠL 硫脲 ,4 %(WΠV)
CHAPS ,2 %(WΠV) TBP ,65mmolΠL DTT ,012 %(VΠV)载体两
性电解质Biolyte (其中 011 %pH 3～10 ,011 %pH 4～6) 。
115 　蛋白质浓度测定
蛋白质浓度测定参考 Bradford 的方法[10 ] 。用 BSA
(牛血清蛋白)做标准曲线 ,依据标准曲线计算样品蛋
白质浓度。
116 　第一向等电聚焦电泳
采用 Protean IEF cell 等电聚焦系统 (Bio2Rad) 。主
要参照 GÊrg 等[11 ] 和 Bio2Rad 双向电泳实验指南进行 ,
取适量蛋白样品加裂解液至总体积为 350μl ,沿 IPG胶
条槽缓慢均匀加入 ,将 IPG胶条胶面朝下覆盖在样品
504　4 期 小麦花药蛋白质组双向电泳技术体系的优化
上 ,在胶面上加 2ml 矿物油 ,置于 Protean IEF Cell 型电
泳仪上 ,20 ℃恒温下进行 ,以 50V 低电压泡胀 12h 后 ,
按 250V 1h ,500V 1h ,1000V 1h ,4000V 1h , 8000V 4h ,最
后稳压在 8000V 进行等电聚焦 , 总电压时间积为
80000Vh 时结束电泳。第一向等电聚焦结束后 ,将 IPG
胶条放于 5ml 胶条平衡缓冲液 Ⅰ[6molΠL 尿素 ,2 %(WΠ
V) SDS ,01375molΠL Tris2HCL (pH818) ,20 % (VΠV) 甘油 ,
2 %(WΠV) DTT(现加) ]中振荡平衡 15min ,再转入 5ml
胶条平衡缓冲液 Ⅱ[ 6molΠL 尿素 , 2 % ( WΠV) SDS ,
01375molΠL Tris2HCL (pH818) , 20 % (VΠV) 甘油 , 215 %
(WΠV)碘乙酰胺 (现加) ]中振荡平衡 15min。
117 　第二向 SDS2PAGE电泳
使用 PROTE AN Ⅱ xi Cell (Bio2Rad) 垂直电泳系
统。平衡完毕后将胶条转移到 SDS2PAGE 凝胶上 ,用
低熔点琼脂糖封胶 ,进行电泳 ,待溴酚蓝移至凝胶底部
时停止电泳。电泳结束后 ,凝胶染色采用胶体考马斯
亮蓝染色法[12 ] ,将凝胶立即置于固定液 [ 40 %(VΠV) 甲
醇 ,10 % (VΠV) 冰乙酸 ]中 ,固定 1h 以上 ;用 Millipore
H2O 漂洗 15min ,重复 4 次 ,洗涤完毕后置于胶体考马
斯亮蓝染色液〔0112 % (WΠV) G2考马斯亮蓝 ,10 % (WΠ
V)硫酸铵 ,10 %(VΠV)磷酸 ,20 %(VΠV) 甲醇〕中染色过
夜。用 Millipore 纯水漂洗脱色 ,直到蛋白点清晰为止。
118 　图像的扫描与分析
脱色后的凝胶在 Powerlook 2100XL 型光密度扫描
仪 ( Bio2Rad ) 上扫描照相 , 分辨率为 600 dpi ; 用
PDQuest81011 软件 (Bio2Rad)对图像进行分析。
2 　结果与分析
211 　不同蛋白质提取方法和蛋白质裂解液对 22DE 图
谱影响
分别用 TCAΠ丙酮法和酚提取法提取小麦单核期花
药总蛋白质 ,以蛋白质裂解液Ⅰ溶解蛋白 ,Bradford 法蛋
白定量 ,以 17cm、pH 4～7 IPG胶条 ,12 %SDS2PAGE 进行
双向电泳分离 ,胶体考马斯亮蓝染色 ,结果如图 1。
图 1 显示 ,用酚提取法提取的蛋白质 ,所得的 22
DE图谱 (图 12A) 蛋白点较模糊 ,分辨率低 ,横竖纹干
扰严重。同时因为样品中含有较多的盐离子等杂质 ,
等电聚焦时电流比较大。而 TCAΠ丙酮法所得的 22DE
胶图谱蛋白点分布均匀 ,蛋白点清晰呈圆形 ,凝胶背景
干净 ,横竖条纹干扰少 (图 12B) 。经 PDQuest810 软件
统计分析 ,在相同的参数设置条件下 ,酚提取法 ,在胶
面上可分辨出 333 个蛋白点 ,TCAΠ丙酮法则可检测到
519 个清晰的蛋白点 ,比酚提取法多 186 个蛋白点。在
等电点 615～710 区域内 ,酚提取法蛋白点模糊难辨 ,
横纹干扰严重 ,可检测到 48 个蛋白点 ,而 TCAΠ丙酮法
在此区域可检测到 67 个较清晰的蛋白点 ,比酚提取法
多 19 个 ;在分子量 75～95、55～75、35～55KD 范围内 ,
TCAΠ丙酮提取法比用酚提取法分别多 29、65、75 个点
(图 2) 。
图 1 　不同蛋白质提取方法和蛋白质裂解液的 22DE图谱比较 (17cm ,pH 4～7 ,胶体考马斯亮蓝染色)
Fig. 1 　22DE maps of different protein extraction methods and different solublilization buffers
(17cm ,pH 4～7 ,12 %SDS2PAGE ,colloidal coomassie G2250 staining)
A :酚提取法 + 蛋白质裂解液Ⅰ;B :TCAΠ丙酮法 + 蛋白质裂解液Ⅰ;C :TCAΠ丙酮法 + 蛋白裂解液Ⅱ。下图同
A :Phenol extraction and solubilization buffer Ⅰ; B :Trichloroacetic acidΠacetone precipitation and ansolubilization buffer Ⅰ;
C :Trichloroacetic acidΠacetone precipitation and solubilization buffer Ⅱ. The same as following Fig. 2.
604 核　农　学　报 22 卷
图 2 　不同蛋白质提取方法和蛋白质裂解液所得的蛋白点基于等电点和分子量范围的分布
Fig. 2 　The distribution of protein spots according to molecular weight (Mr) and isoelectric point (PI)
of different protein extraction methods and different lysis buffers
　　分别采用蛋白质裂解液 Ⅰ和蛋白质裂解液 Ⅱ溶解
蛋白 ,对 TCAΠ丙酮法提取的蛋白质进行双向电泳分
析 ,结果如图 12B、12C。用蛋白质裂解液 Ⅱ溶解的蛋
白 ,所得的 22DE图谱更清晰 ,蛋白点更丰富 ,分布更均
匀 ,22DE 图谱上可分辨出 554 个清晰的蛋白点 ,比用
蛋白质裂解液 Ⅰ提取的蛋白多 39 个点 (图 12C) 。在等
电点 515～610 KD 范围内 ,可分辨出 169 个点 ,比用蛋
白质裂解液 Ⅰ多 18 个点 ;在分子量 35～55、55～75 KD
范围内 ,比用蛋白质裂解液 Ⅰ分别多 11 个点和 9 个点
(图 2) 。以上比较分析表明 ,采用 TCAΠ丙酮法提取小
麦花药组织中的蛋白 ,并用蛋白质裂解液 Ⅱ溶解 ,可获
得更好的分离效果。
212 　不同上样量及 SDS2PAGE 胶浓度对 22DE 图谱的
影响
为了对提取的蛋白质进行更好的分离 ,对双向电
泳中蛋白质的上样量和 SDS2PAGE 胶浓度的选择做了
进一步比较分析。
以 TCAΠ丙酮法提取花药蛋白 ,裂解液 Ⅱ裂解蛋
白 ,选用 17cm、pH 4～7 IPG胶条 ,分别取 600、800 和
1000μg蛋白样品进行双向电泳 ,结果见图 3。在上样
量为 600μg 时 ,双向电泳图谱上蛋白点模糊不清 , 低
丰度蛋白因不能被检测而丢失 ,影响了双向电泳的准
确性和重复性 (图 32A) ;在上样量为 1000μg 时 ,蛋白点
数多 ,但高丰度蛋白点过大 , 出现饱和重叠现象 ,掩盖
了其余蛋白斑点 ,同时 22DE 胶图谱上横条纹比较明
显 ,影响了蛋白质点的分离与分析 (图 32C) ;蛋白上样
量为 800μg 时 ,蛋白点清晰 ,无横条纹干扰 ,聚焦效果
好 ,图谱质量最佳 (图 32B) 。
图 3 　不同上样量的 22DE图谱比较 (17cm ,pH 4～7 ,13 %SDS2PAGE ,胶体考马斯亮蓝染色)
Fig. 3 　22DE maps of different loading quantities (17cm ,pH 4～7 ,13 %SDS2PAGE ,colloidal coomassie G2250 staining)
A :600μg ;B :800μg ;C :1000μg
704　4 期 小麦花药蛋白质组双向电泳技术体系的优化
　　第二向 SDS2PAGE 胶浓度的不同 ,双向电泳分离
的效果也不同。分别以 12 %、13 %的 SDS2PAGE 胶浓
度对小麦花药蛋白质进行电泳分析 ,胶浓度为 12 %
时 ,20KD 以下低分子量的蛋白因超出了胶所容纳的范
围 ,而未能在胶上得到分离 (图 12C) ,改用 13 %胶后 ,
增加了低分子量区的分离效果 ,20KD 以下低分子量区
蛋白得到了较好的分离 ,获得了较好的分离图谱 (图
3) ,避免了因蛋白丢失而使结果不准确的问题。　　
由此 ,以 TCAΠ丙酮法提取蛋白 ,蛋白质裂解液 Ⅱ
[7molΠL 尿素 ,2molΠL 硫脲 ,4 %CHAPS ,2 %TBP ,65mmolΠ
L DTT ,012 %载体两性电解质 (其中 011 %pH 3～10 ,
011 %pH 4～6) ]溶解 ,上样量为 800μg ,13 %SDS2PAGE
胶浓度优化的方法 ,更适合于小麦花药组织的蛋白质
分离 ,经 PDQuest81011 软件统计分析 ,可在 22DE 图谱
上分辨出 631 个蛋白点 (图 32B) ,蛋白点清晰呈圆形 ,
无横条纹干扰问题 ,表明优化后的方法更适合于小麦
花药组织蛋白质组双向电泳技术。
3 　讨论
样品制备是双向电泳的第一步 ,不同的样品应根
据其本身的特性 ,选用最合适的制备方法。样品制备
可分为蛋白质提取、裂解液配方的选择、杂质的去除等
步骤。本试验中 ,分别以酚提取法和 TCAΠ丙酮法提取
蛋白 ,在相同的蛋白质裂解液条件下 ,经双向电泳分
析 ,酚提取法提取所得的 22DE 胶图谱蛋白质点模糊 ,
横纹较多 ,而 TCAΠ丙酮法所得的 22DE 胶图谱蛋白点
清晰呈圆形 ,分布均匀 ,凝胶背景干净 ,横竖条纹干扰
少。表明 TCAΠ丙酮法更适合于小麦花药蛋白的提取。
在蛋白质提取过程中 ,经常受植物组织中色素、酚
类、醌类等次生代谢物质的干扰 ,我们通过在液氮中加
入少量 PVP , 吸附花药组织中的色素和酚类物质 ,同
时也可保证样品在液氮中的充分研磨 ,这样有利于通
过增加丙酮洗涤蛋白沉淀的次数而尽可能多的去除上
述杂质。在蛋白质提取过程中要保证低温操作 ,以免
蛋白质的降解与修饰。
理想的样品制备 ,应尽可能地在避免蛋白质的损
失与降解条件下 ,保证样品的最大程度的溶解状态 ,因
此选择合适的裂解液也十分重要。样品裂解液一般包
括促溶剂、去污剂、还原剂和两性电解质。尿素作为一
种常用的离液剂 ,通过改变或破坏氢键等次级键的结
构 ,使得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲的使用可
提高蛋白质的溶解性能 ,特别是膜蛋白的溶解性 ,但由
于其不溶于水的特性 ,在使用时 ,需与高浓度的尿素联
用。还原剂主要是用来断裂蛋白质分子中的二硫键 ,
增加蛋白质的溶解性 ,DTT 是较广泛使用的一种还原
剂 ,但 DTT 在碱性 pH 值下 ,会发生去质子化 ,在等电
聚焦时 ,向阳极发生迁移 ,使得阴极的 DTT 因损耗而
不足[13 ] ,而非离子型 TBP 的使用则比 DTT 更加有效 ,
能大大增加蛋白质的溶解性 ,并可帮助蛋白质从第一
向到第二向的转移。本研究通过比较二维电泳图谱质
量 ,发现硫脲和尿素联用 ,可大大增加蛋白质的溶解
性 ,比单独使用尿素的效果好 ,在裂解液中加入非离子
型 TBP ,可提高蛋白质的溶解性 ,特别是膜蛋白和疏水
蛋白的溶解性 ,比用裂解液 Ⅰ得到的蛋白质溶解性大 ,
表现在 22DE 胶上可获得比裂解液 Ⅰ更多的蛋白点。
载体两性电解质的加入能够促进蛋白质的溶解 ,并可
吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子 ,一定浓
度的两性电解质 ,会提高蛋白质溶解性 ,在等电聚焦
时 ,提高极性端蛋白质的聚焦效果。在本试验中 ,两种
不同 pH范围的两性电解质按一定比例加入 ,使其在
pH 4～7 等电点范围内重叠 ,增加了蛋白质的溶解性 ,
使得蛋白质点更分散更丰富 ,提高了双向凝胶电泳图
谱的分辨率。
样品中的盐离子可干扰电泳过程 ,导致 IPG胶条
中溶液的电导率增大并引起电内渗[14 ] , 当样品溶液中
的盐离子浓度超过 100mmolΠL 时 ,将严重影响等电聚
焦的进行 ,在双向图谱中造成横向拖尾或蛋白丢失。
在电泳过程中 ,应尽可能保持盐离子低浓度或加以清
除 ,本研究中蛋白样品在没有经过特殊的除盐处理情
况下 ,通过增加低电压过程、延长低电压 IEF 的除盐时
间及在 1000V 后增加一个 4000V 1h 的电压梯度 ,采用
逐步升压的方法 ,使蛋白样品在等电聚焦时能顺利达
到预设的聚焦高电压 ,获得了满意的蛋白聚焦过程 ,通
常 ,在总电压时间积为 80000V·h 即可充分聚焦。
GÊrg 等报道 ,采用窄范围 pH 梯度胶条对蛋白质
进行分离 ,可以提高蛋白的分辨率 ,增加该 pH 值范围
内所检测到的蛋白数[11 ,15 ] 。本研究首先采用 pH 3～10
的非线性胶条对花药蛋白质进行分离 ,发现大部分蛋
白质集中在 pH 4～8 范围内 (结果未列) , 再改用 pH 4
～7 范围的线性胶条进行双向电泳分离 ,大大地提高
了在此区域的分辨率 ,这与文李等[16 ] 在水稻花药中的
结论一致。
进行第二向 SDS2PAGE 垂直板凝胶电泳时 ,本研
究采用恒流的办法 ,先用小电流 (10mAΠ胶) , 50min 后
改成大电流 (20mAΠ胶) ,5～6h ,结束电泳 ,在第二向电
泳时最好要有冷循环水装置 ,否则蛋白质点会因电泳
时温度过高而畸变。
804 核　农　学　报 22 卷
合适的上样量在双向电泳中也是非常重要的 ,而
蛋白质上样量 , 不仅与 IPG胶条的长度、pH 值范围有
关 ,同时也与蛋白质染色方法有关。本研究采用一种
新的蛋白质染色方法2胶体考马斯亮蓝染色法 ,结合了
传统的考马斯亮蓝染色法和硝酸银染色法的优点 ,其
检测灵敏度高 ,上样量小 ,同时能很好地与质谱兼容 ,
在选用 17cm、pH 4～7 IPG胶条 ,采用该种蛋白质染色
方法后 ,通过分析比较 ,在蛋白上样量为 800μg 时 ,就
能获得很好的 22DE 图谱效果 ,22DE 胶背景干净。因
蛋白质斑点清晰 ,背景浅 ,故易脱色 ,不需脱色液仅用
去离子水便能获得很好的脱色效果 ,该方法已被广泛
采用[17 ,18 ] 。
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