全 文 ： 核 农 学 报 2004，18(2)：93—96
Acta Agricuhurae Nucleatae Sinica
文章编号 ：1000-8551(2004)02．093．04
重离子束注入小麦胚乳诱发的突变效应
颉红梅 卫增泉 李兴林 王浩瀚 赵莲芝 谢忠奎
(1．中国科学院近代物理研究所．甘肃 兰州 730000；2．甘肃省张掖地区农科所，甘肃 张掖 734000；
3．中国科 学院寒区旱区环境 与工 程研究所 ，甘肃 兰州 730000)
摘 要：采用 75MeV／u O“ 离子(降能至 36MeV／u，使其在胚乳 中的射程约为 2．4mm )，从种子
顶部垂直注入胚乳．通过“嫁接”技术后进行萌发。处理后观测结果表明，当代根尖细胞染色体
的微核率和畸变率与注入剂量呈正相关；测定了当代抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)含量和蛋白
质含量的变化 ；经多代 大田培育获得 了矮杆与各种穗型的变异，且具有遗传性。结果显示离子
注入胚乳不仅对生物的修复系统有较 大影响，而且能够诱发后代突变。
关键词：离子 注入 ；胚乳 ；突 变
M UTAGENIC EFFECTS oF ENDoSPERM oF Triticum aestivum
IMPLANTED BY HEAVY IoN BEAM S
93
XIE Hong—mei LI Xing．1in WEI Zeng quan‘ WANG Hao—han ZHAO Lian—zhi2 XIE Zhong．kui
(1．Institute ofModem Physics，Chinese Academ*ofSciences，Lanzhou．Gansu， 730000；
2．Zhangye，， t f眦P of Agricuhural Science，Zhangwe。Gansu， 734000：
3．，mfn眦e of Cold and Arid Enrironment and Engineering，the Chinese Academ)of Scienees，Lanzhou，Gansu， 730000)
Abstract：75 MeV／u O“ ions(degraded to 36MeV／u)were used to implant into endosperm about 2．4mm on top of
the seeds．Germination started after a ‘grafting’technique was employed．Chromosomal aberration frequency and
micronucleus frequency of the root·tip cells in M0 were measured．The results indicate that the frequencies were pro—
portional to implanted dose．Antioxidant enzyme activity，MDA content and protein content of present generation M0
were assayed．Farm culture was carried out in many generations．Short—stem and various variation of ear-type were
obtained and the variation possess heredity．It showed that the endosperm implanted by the ions not only afected bi—
ological repair system，but also induced the mutation of ofspring．
Key words：ion implantation；endosperm ；mutation
重离子束与7射线、中子和电子相比，在诱变生物学方面有独特优势，我们利用这一优势进行了重
离子束定位诱变育种的尝试 。 ，结果表明：(1)离子注人胚乳也会诱发突变，如矮杆和穗形变异，且具有
遗传性 ；(2)注入不 同部位诱发的突变具有特异性 ，如注人胚芽主要可以获得穗粒数增多、千粒重增大等
变异。传统遗传学说认为，胚乳只提供胚在种子萌发过程中所需要的营养物，而胚才是对遗传性变异起
作用的因素，与我们的结果存在较大分歧 。为 了进 一步证实上述获得 的新结果 ，本文采用离子注入胚
乳 ，通过“嫁接”技术后进行萌发。处理后对较重要的生物修复系统之一抗氧化酶系统进行 了测定 ，对具
有突变意义的根尖细胞染色体的微核率和畸变率进行了观测 ，为观察田间植株遗传性性状变异 ，进行了
多代大田培育，结果再次表明，离子注入胚乳不仅对生物的修复系统有着较大影响，而且能够诱发后代
收稿 日期 ：2002—10一l8
项目基金：甘肃省 自然科学基金(SJ970607)和中国科学院寒区旱区环境与工程研究所创新项目(210069)
作者简介：颉红梅(1952一)，女，甘肃省甘谷人，高级工程师，从事重离子物理应用研究。
维普资讯 http://www.cqvip.com
核 农 学 报 l8卷
变异 ，且具有遗传性。
1 材料和方法
1．1 材 料
选用甘肃张掖地区农科所提供的春小麦干种子 M。一。、M 、14615、86336和 82166，挑选其大小均匀 、
籽粒饱满 、无破损 、无霉菌污染的风干种子作为试样。
1．2 方法
1．2．1 辐照及剂量 实验在兰州重离子加速器国家实验室(NLHIAL)兰州重离子研究装置(HmFL)，IL．2
终端上进行 。它提供了75MeV／u O¨ 离子束，经扫描束流截面直径为4cm，通过真空隔离窗引入大气
正常环境中，室温下辐照 ，选定 照射 的剂量率为 3Gy／min，为达到离子注入胚乳 而不触及别的部位 的 目
的，辐照时将离子能量降至 36MeV／u左右，从种子顶部垂直注入胚乳，注入深度约为 2．4mm。离子辐照
剂量选为 ：8、11、16、32Gy。
1．2．2 样品处理 种子被离子注入后 ，切下该胚乳与切下的未经辐照的小麦胚部在含少量水 的培养皿
中对接，由于水的粘涨力两者贴得较紧，组成一完整麦粒种子(我们称其为 Mf’代，即当代)进行萌发，这
样做是为了确认该麦粒种子只有胚乳受到了离子的作用。同时 ，用均未受到辐照的原种 ，切下其胚乳与
胚“嫁接”，同样条件下萌发，作为对照，检验仅由“嫁接”是否造成损伤及它的表现与损伤程度。
将辐照种子 M 代和原种萌发，截其主根进行细胞学观测，包括微核率、染色体畸变类型及其畸变
率，研究离子注入胚乳诱发根尖细胞的变化。
1．2．3 室内萌发及细胞学观测 取不同品种各个剂量组处理(包括对照样品)的种子 25粒，放于培养
皿中萌发到胚根长至 1～2cm后 ，截取主根根尖，用卡诺氏固定液(无水乙醇 ：冰醋酸 =3：1)固定 24h，转
入70％乙醇中保存。
实验时 ，一次压片根尖 1～2条 ，在常温下 5mol／L HC1中解离 10min，蒸馏水 冲洗干净后 ，混合酶液
(含 2．5％纤维素酶和 2．5％果胶酶)酶解 10min，蒸馏水冲洗干净，用石炭酸品红液染色 15rain，最后分别
压成临时片，各组 l0个根尖，普通光镜下统计约 10，000个根尖细胞中的微核率及畸变率。
1．2．4 抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)和蛋白质含量的测定 称取 0．5g幼苗叶，加入液氮研磨至粉末，
加入 5倍提取缓冲液(W／V，50mmol／L PBS，pH7．8，10mmol／L巯基乙醇，0．1％不溶性 PVP)，于冰浴中研
磨；匀浆倒入 10 mL离心管中，在 10，000g、4。c下离心 10min，取上清液保存在4。c下待用；超氧化物歧化
酶(soo)活性测量按 Del I~ngo等的方法进行 ，活性单位为 U／g鲜重；过氧化物酶(POD)活性测量按
Kar和 Choudhuri的方法进行 J，酶活力单位为 U／mg蛋白；过氧化氢酶(CAT)活性测量按 Aebi的方法进
行 ]。酶活力单位以 U／mg蛋白表示 ；MDA的含量测量参照 Heath和 Packer的方法进行 ，含量单位以
nmol／g鲜重表示；蛋白质含量测定按 Bradford的方法进行 ，根据测得的 OD∞ 值，查标准曲线来计算样
品蛋白质含量，单位为 g，rIl蛋白。
1．2．5 田间试验 经重离子辐照处理的种子，首先观察其 M 代田间生物损伤效应，选择损伤植株，并
将其 M0代收获种子在云南秋季加代，得 M．代，将 M．代变异单株种成穗行，行长 1．5m，行距 15em，根据
种子数量的多少，每个处理 3 6行，对照种两行，行播量 50粒。M．代每个处理选单穗 30—50个，种成
M 代穗行，依次类推，连续进行了两年的系统选育，最后得第 5代 M 。在大田生长期间，除进行辐照损
伤、生物效应、生育期、植株性状变异等田间定向观察外，还进行了综合农艺性状选择。
2 结果
2．1 注入胚乳形成根尖细胞微核率及染色体畸变率随剂量的变化
细胞学实验主要是对当代 M。萌发种子的根尖细胞进行染色体观测，统计其微核率与总畸变率，结
维普资讯 http://www.cqvip.com
2期 重离子束注入小麦胚乳诱 发的突变效应 95
果如表 1(只显示了品种 14615的情况)。从镜检结果来看，染色体的微核率与畸变率都与辐照剂量有
关 ，剂量增大，微核率与畸变率增高 ，基本呈现正相关性。
表 1 “0B 离子对种子 14615注乳后 ，当代 IⅥ0根尖细胞 中染 色体 的变化
Table 1 Change of chromosomes in root—tip cells of present generation M0 after endosperms of
seed 14615 were implanted by。 0 ions
注 ：镜 检 细 胞 数 为 10000个 。
Note：Examined cell numbers weYe 10，000．
2．2 抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)和蛋白质含量的变化
春小麦种子通过 36MeV／u 0¨ 离子注入胚乳后．经萌发取其幼苗制备的酶液，测量其抗氧化酶活
性、丙二醛(MDA)和蛋 白质含量 ，其变化列于表 2(只显示 了品种 86336的情况)。同对照相 比，注乳 M
代的SOD活性降低不大(5．36％)，而 CAT活性、MDA含量和蛋白质含量却有明显下降，分别为31．7l％，
32．65％和 16．03％，但 POD活性提高了 53．13％。
表 2 “0B 离子对种子86336注乳后，当代 M。抗氧化酶活性、MDA和蛋白质含量的变化
Table 2 Change of antioxidant enzyme activity，MDA content and protein content of present generation Mo
after endosperms of seed 86336 were implanted by。 0 ions
注 ：变异翠(％)=l(平均值 一对照 )／对照j x 100％ Note：、_ariation Fate=l(iTlearl—contro1)／controlj x 100％．
2．3 大 田中植株性状的变异
离子注入胚乳后，在大田中植株性状的变异主要有：矮秆(最多可降低 20cm)、穗部形状发生明显变
异(如由圆柱形变为纺锤形 ，长方形等)；麦芒变异 (有 的从有芒到无芒 ，或者由无芒变成 了顶芒 ，而且有
的芒色从黄色变成了棕黑色等)(见图 1)。这些变异从第2代开始直至第 5代仍然表现，具有稳定的遗
传性。
3 讨论
本研究发现了离子注入小麦种子胚乳会造成矮秆和穗型的变异 ，而且具有遗传性 。在研究 中，为了
确保变异是胚乳受损引起，我们特地将离子注入的胚乳切下嫁接到未处理的种子胚上，以保证萌发种子
的胚没有受到辐射影响，而且还用均未受到辐照的原种，切下其胚乳与胚自我“嫁接”，在同样条件下萌
维普资讯 http://www.cqvip.com
Acta AgricuIturaeNac／eame S／n／ca
2004。18(2)：93～96
图 l 离子注入胚乳后在大田中得到的后代突变株
Fig．1 Mutants of offspring in the fields from endosperms implanted by heavy ions。
1：对照，株高 110—120cm，圆柱穗型；2、3、4：突变体，矮杆．株高 lOOcm以下，穗型突变为纺锤形、长方形；5、6：突变体，矮杆，
株高 9Ocm左右；7：对照，有芒；8、9：突变体，无芒；10：突变体．株高变得稍高．长芒；11：对照，无芒；12：突变体，有芒，且是棕黑色芒。
1．control，plant—height，cylindrical ear-type；2、3、4．mutants．short stem，plant—height，ear-type：spindle shape、rectangle shape：
5、6．mutan~，short stem，plant·height；7．control，awo；8、9．mutants．non·aWl；10 mutant，plant slight higher，long algo；11．control，non—alga；
l2．mutan t，awn．hea~w brown awn．
发，作为对照，检验仅由“嫁接”是否造成损伤及它的表现与损伤程度。结果表明，离子注入胚乳的根尖
细胞微核率和染色体畸变率随着注入剂量的增大而增加，存活的当代幼苗和植株变矮，在第 2代仍显矮
杆并发现穗型和芒型发生变异 ，而且这种变异能持续到第5代(本实验仅到第5代)，这意味着离子注
入小麦种子胚乳能够诱发后代变异，且具有遗传性。当然，要想得到遗传物质改变的直接证据，还应该
对后代进行分子鉴定。
另一方面 ，我们还关注着较为重要 的生物修复系统之一抗氧化酶 (SOD酶、POD酶和 CAT酶 )活性
的变化及 MDA和蛋白质含量的变化，因为抗氧化酶在清除自由基、降低过氧化物浓度等方面有重要作
用。MDA含量是间接反映过氧化物降解的程度。蛋 白质含量却反映了细胞 内基 因表达 的水平。实验
表明，离子注入胚乳后这些生化物质也发生了较大的变化，而这些变化是根尖细胞中微核率与染色体畸
变率显著提高和植株性状发生遗传变异的重要原因之一，说明诱变胚乳对未受辐射作用的胚细胞的生
理和遗传载体影响很大，由此可以认为，在胚乳诱变中必然存在着间接效应。
可见，不同模式离子辐照生物效应的机理是不一样的，也是比较复杂的，有待进一步研究。
参考文献 ：
[1] 颉红梅，卫增泉，李文建，等 ．中能离子束注入与贯穿辐射对小麦种子萌发生长的影响．辐射研究与辐射工艺学报，1996，14(1)：50
— 54
[2] 颉红梅，王浩瀚，王菊芳，等．重离子束定点诱变育种初探．原子核物理评论，2001，18(3)：174 176
[3] 卫增泉，刘玉岩，王桂玲，等．研究重离子生物效应的辐照装置 核技术，1991，14(6)：341～346
[4] Del Longo 0 T，Gonsales C A，Postorl G M，et aI．Antio~dant defenses under hyperoxygenic and hyperosraotic conditions in leaves of two lines of
maize with diferential sensitivity to drought．Plant Cel Physio1．1993，34：1023—1028
【5 J Kar P K，Choudhuri M A．Possible mechanisms of light·induced chlorophyl degradation in senescing leaves of Hydrila verticiUata．Physiol Plant，
1987，70：729—734
[6] Aebi H．Catalase in vitro．Meth．Enzymo1．，1984，105：121—126
[7] Heath R，Packer L L．Photoperoxidation in i~lated ch【nmplas【s．I Kinetics and stoichiomet~of faty acid peroxidation，Arch Biochem Biophys，
1968，12(5)：189 198
【8] Bredford M M．A rapid and sensitve method for quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle 0f protein dye bin曲培，Anal
-
Bioehem．，1976，72：248—254
[9] 李兴林，卫增泉，王晓娟，等． c6 注Ad,麦种子胚乳引起 Ml代的变化．激光生物学报，2000，9(4)：5～8
维普资讯 http://www.cqvip.com