全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 012068204
烟粉虱内共生菌 groEL 基因的 PCR 扩增与测序
谭周进1 　谢丙炎2 　肖启明3 　杨宇红2 　冯兰香2
(11 湖南农业大学生物安全科技学院 ,湖南 长沙　410128 ;21 中国农业科学院蔬菜花卉
研究所 ,北京　100081 ;31 湖南农业大学植物保护学院 ,湖南 长沙　410128)
摘 　要 :烟粉虱内共生菌 groEL 基因编码一种 63KD 的 GroEL 蛋白 ,属于分子伴侣 cpn60 家族成
员 ,与烟粉虱传播植物病毒病关系密切。通过 PCR 对长期生活在甘蓝上的烟粉虱体内 groEL
基因进行了 PCR 扩增 ,序列测定表明其长度为 1668bp ,编码 555 个氨基酸 ,与 Genebank 中烟粉
虱内共生菌 groEL (AF130421)的核苷酸同源性为 99182 % ,氨基酸同源性为 99164 %。
关键词 :内共生细菌 ;烟粉虱 ; groEL ,PCR 扩增
PCR AMPLIFYING AND SEQUENCING OF GgroEL GENE FROM ENDOSYMBIONTS
IN Bemisia tabaci
TAN Zhou2jin1 　XIE Bing2yan2 3 　XIAO Qi2ming3 　YANG Yu2hong2 　FENGLan2xiang2
(11 College of Bio2safety Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan , 410128 ;
21 Institute of Vegetable and Flower , China Academy of Agricultural Science , Beijing , 100081 ;
31 College of Plant Protection , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan , 410128)
Abstract :GroEL ,one member of chaperon cpn60 family , a kind of 63KD protein coded by groEL gene from
endosymbionts of Bemisia tabaci ,plays important role in virus disease transmitted by Bemisia tabaci . The product of
groEL gene is a kind of viral binding protein ,which from endosymbionts of Bemisia tabaci on cabbage was amplified
by PCR and cloned. The completed nucleotide sequence of the gene was determined. and it has 1668bp nucleotides
and encodes 555 amino acids. Comparison showed that this gene has 99182 % similarity on nucleotides level and
99164 % similarity on amino acid level to AF130421 ,one groEL gene from endosymbionts of Bemisia tabaci in
Genebank.
Key words :endosymbiont ; Bemisia tabaci ; groEL ; PCR amplifying
收稿日期 :2003212216
基金项目 :国家重点基础研究发展规划项目 (2002CB111400) ;农业部农作物病虫草害生物防治资源研究与利用重点开放实验室开放
基金 (LOBCR22003201)
作者简介 :谭周进 (1969 - ) ,男 ,湖南涟源人 ,博士 ,副教授 ,研究方向为微生物生态学与发酵工程。E2mail :tanzhjin @yahoo. com. cn。
谢丙炎为通讯作者。
烟粉虱 ( Bemisia tabaci)属同翅目 ,是一种重要的农业害虫 ,寄主植物有 74 科 500 余种[1 ] 。在我国广
州地区的寄主植物达 46 科 123 属 176 种 (变种) [2 ,3 ] ,B 型烟粉虱在我国属于入侵种群。研究表明 ,烟粉
虱能传播 WFT 联体病毒等多种植物病毒 ,还能够传播植物细菌病和真菌病 [4 ] 。双联体病毒属
( Geminivirus)只能由烟粉虱传播 ,仅烟粉虱传播的双联体病毒属的病毒病在多米尼加这一小国于 1995
年造成的减产就达 95 % ,经济损失高达 1000 万美元[5 ] 。
几乎所有昆虫都有内共生菌 ,可能影响昆虫的正常生活 ,产生细胞质不相容现象 ,影响昆虫的繁殖
力[6 ] 。内共生菌产生的 GroEL 蛋白能保护病毒在进入体腔中免遭降解 ,维持病毒在昆虫体内的持久
性[7 ,8 ] 。对蚜虫的研究表明 ,用抑制原核生物蛋白质合成的抗生素处理 Myzus persicae 时 ,可以显著降低
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血淋巴中的 Buchnera GroEL ,导致 PLRV(马铃薯卷叶病毒) 不能传播 ,同时也影响病毒衣壳的完整性[9 ] 。
先让禾谷缢管蚜、二叉蚜和麦长管蚜在薄膜上取食青霉素 - 蔗糖溶液 1h 后 ,进行正常饲喂和传毒 ,传大
麦黄矮病毒的特性与效率因此而降低[10 ] 。吴云锋等分离到了禾谷缢管蚜体内的一种与传毒有关的
63kD 的病毒结合蛋白 ,属于分子伴侣 cpn60 家族[11 ] 。另外 ,用蚜虫 Buchnera GroEL 抗血清在携毒之前饲
喂烟粉虱 ,烟粉虱传 TYLCV2Is 番茄黄化卷叶病毒 (马铃薯卷叶病毒) 的几率下降 80 %以上[12 ] 。Morin
等[13 ]用酵母双杂交试验对 TYLCV2Is 与 AbMV2Is 衣壳蛋白 (CP)与烟粉虱 GroEL 的互作研究证明 ,这两种
病毒的 CP 都能够与 GroEL 有效联结 ,但 TYLCV2Is 能被烟粉虱传播 ,而 AbMV2Is 则不能被烟粉虱传播。
这些都说明内共生菌产生的 GroEL 蛋白对病毒起着保护作用 ,使病毒在进入昆虫体内的过程中免遭降
解 ,同时 GroEL 也在一定程度上影响昆虫传播病毒的种类。由于内共生菌不能人工培养 ,获得大量的内
共生菌代谢产物也就比较困难 ,而在体外进行蛋白表达是一条研究基因产物特性与功能的好途径 ,蚜虫
Buchnera groEL 的原核表达已有报道[10 ,11 ,14 ,15 ] ,烟粉虱内共生菌 groEL 也在酵母菌中进行了表达[13 ] 。为
了弄清烟粉虱 GroEL 蛋白在昆虫体内的具体功能 ,特别是其与烟粉虱传播病毒的关系 ,试图通过体外获
得大量的 GroEL 蛋白 ,我们着手进行了烟粉虱内共生菌 groEL 基因及其产物 GroEL 蛋白的研究。本文
报道烟粉虱内共生菌 groEL 基因的克隆和测序结果。
1 　材料与方法
111 　材料
烟粉虱试验种群为 5 年连续饲养在中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室中甘蓝上的 B 型烟粉虱。
大肠杆菌为 TOP10 ,克隆质粒载体 p GM2T Easy 购自清华大学天为时代科技有限公司。EcoR I、T4DNA 连
接酶、PCR 扩增试剂 (dNTPs ,Taq 酶) 、DNA 快速回收试剂盒主要购自清华大学天为时代科技有限公司、
Bebco、Promega 等公司。
112 　方法
11211 　groEL 模板 DNA 的提取　将 100 头冰冻的烟粉虱用无菌双蒸水快速洗涤 2 次 ,于 200μl TE buffer
中匀浆 ,5000rΠmin 离心 3min 后 ,收集沉淀 ,加入 500μl 裂解 buffer (011molΠL NaCl、011molΠL EDTA、1 %SDS
、011 %蛋白酶 K)于 65 ℃水浴中裂解 60min ,冰上放置 5min 后 ,5000rΠmin 短时离心 ,上清液分别用等体积
的酚 :氯仿 (1∶1)抽提 3 次、氯仿抽提 1 次 ,70 %冷乙醇沉淀 DNA ,无水乙醇洗涤 ,晾干或风干 ,加无菌双
蒸水在 4 ℃溶解。
11212 　引物设计 　参照 Genebank 发表的序列 (AF130421) ,采用 PRIMER2MASTER 引物设计软件 (版本
110)自行设计引物 ,委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。其序列为 :
fwd :5’2atggcagctaaagacttaaaatttgg23’
rev :5’2ttacatcataccattcattccgccc23’
11213 　PCR 扩增 　体系中含引物 fwd 和 rev 各 016μmolΠL、模板 200ng、dNTPs 215mmolΠL、10 ×PCR buffer
5μl、Mg2 + 215mmolΠL～310mmolΠL、Taq 酶 1U ,加水至 50μl。PCR 反应条件为 94 ℃预变性 5min ,94 ℃1min ,
52 ℃1min、72 ℃2min ,共 35 个循环 ,72 ℃10min ,保存于 4 ℃冰箱中。
11214 　连接、转化与筛选 　用 DNA 快速回收试剂盒将 PCR 扩增产物纯化 ,按清华大学天为时代科技有
限公司的方法进行 PCR 纯化产物与 p GM2T Easy 载体的连接、转化 TOP10 感受态细胞 ,以菌株培养物进
行 PCR 筛选阳性克隆 ,以碱法提取阳性克隆菌株的质粒进行酶切和 PCR 进一步鉴定插入片段的大小。
11215 　序列测定与分析 　序列测定由上海博亚生物技术有限责任公司进行 ,测序仪为 ABI PRISM 3772
96 ,测序试剂为 BigDye terminator v210。氨基酸序列推导与同源性分析借助 Blast 和 DNASIS 软件进行。
2 　结果与分析
96　1 期 烟粉虱内共生菌 groEL 基因的 PCR 扩增与测序
图 1 　groEL 基因的 PCR 扩增
Fig. 1 　The groEL gene amplified by PCR
1 :烟粉虱 ;2 :DNA 分子量标准 ;3 :空白对照
1 :PCR amplified from Bemisia tabaci DNA ;
2 : DNA molecular marker ;3 : control ;
图 3 　菌株质粒的酶切与 PCR 扩增
Fig. 3 　The target fragment of groEL gene amplified
and enzyme digested from positive strain
1 :空白对照 ;2 :质粒的 PCR 扩增 3 :质粒的
EcoR I 酶切 ;M:DNA 分子量标准
1 : control ; 2 : plasmit amplified by PCR ;
3 : plasmid digested by EcoR I ;M:DNA molecular marker
图 2 　白斑克隆菌株的 PCR 扩增
Fig. 2 　PCR amplified from white clones
1～2 :PCR 扩增鉴定出的假阳性克隆 ;3～5 :PCR 扩增
鉴定出的阳性克隆 ;M:DNA 分子量标准
1～2 :negative clones ; 3～5 : positive clones ;
M: DNA molecular marker
211 　烟粉虱内共生菌传毒相关基因的克隆和鉴定
PCR 特异性扩增后 ,经 018 %琼脂糖电泳检测 ,
结果如图 1。将扩增出的约为 1650bp 的片段用
DNA 快速回收试剂盒回收 ,电泳检测纯度。将纯化
产物与 p GM2T Easy 载体连接、转化 TOP10 感受态细
胞 ,挑取白色菌落在含 100μgΠmL 氨苄青霉素的 LB
培养液中培养 ,供进一步实验用。
从白斑菌落中扩增筛选阳性克隆 ,获得预期大
小目的条带 (图 2) 的鉴定为真阳性克隆 ,未扩增出
条带的为假阳性克隆。从真阳性克隆菌株中取其
中之一通过碱裂解法提取质粒进行 PCR 扩增和
EcoR I酶切 ,均获得预期大小的目的条带 (图 3) ,送
上海博亚生物技术有限责任公司进行序列测定。
212 　核苷酸序列分析
将重组质粒中的 groEL 基因进行序列测定表明 , groEL 基因 (含起始密码子和终止密码子) 大小为
1668bp ,Genebank 的接收号为 AY445874。该核苷酸序列与报道的序列 (AF130421) 相比较 ,同源性为
99182 % ,仅 1183 位 (C →T) 、1452 位 ( G→A) 、1475 位 (T→C)等 3 个核苷酸发生了变异。二者氨基酸序列
同源性为 99164 % ,仅 396 位 (Arg →Cys) 、493 位 (Met →Thr) 等 2 个氨基酸有别。如下图所示 (其中 A :
AFB0421 　B :AY445874) :
07 核　农　学　报 19 卷
一般来说 ,由于密码子的简并性 ,核苷酸的同源性比氨基酸的同源性要低 ,但是由于此二核苷酸的变异
太小 ,而核苷酸的总数比氨基酸总数要多得多 ,而出现了核苷酸同源性比氨基酸同源性高的现象。
3 　讨论
已知 groEL 基因及其 GroEL 蛋白与昆虫传毒有关 ,由昆虫内共生菌产生 ,这方面研究在蚜虫中较
多。烟粉虱内共生菌 groEL 基因 (AY445874) 及 GroEL 蛋白与蚜虫内共生菌 groEL 基因 (AF367248) 及
GroEL 蛋白 (548 个氨基酸)的同源性分别为 73 %和 78 % ,说明烟粉虱内共生菌 GroEL 蛋白与蚜虫内共生
菌 GroEL 蛋白一样 ,属于同一类分子伴侣 cpn60 家族[7 ] 。
我们首次在国内从烟粉虱体内克隆出了 groEL 基因 ,该基因序列全长有 1668bp ,编码 555 个氨基酸 ,经
过与 Genebank 中已有的烟粉虱 groEL 基因比较 ,其核苷酸同源性为 99182 % ,氨基酸同源性为 99164 % ,属
于典型的 groEL 基因。AY445874(中国北京)与 AF130421 以色列为来自不同国家烟粉虱的内共生菌 groEL
基因 ,仅有 3 个核苷酸差异 ,编码的蛋白质仅有 2 个氨基酸不同 ,这 2 个氨基酸变化是否影响了蛋白质的部
分功能 ,以及不同地区来源的烟粉虱体内 groEL 核苷酸变异的原因 ,及其由此而产生的氨基酸替代所引起
的传毒相关性与适应性机制、与烟粉虱危害多样性的相关性等 ,还有待于进一步研究。
昆虫体内与传毒有关的 GroEL 蛋白是由内共生菌产生的 ,对昆虫传播病毒起着非常重要的作用。
目前 ,国内外学者提出了一种利用改造共生菌 (如 Wolbachia) 防治虫传病害的新思路[16 ] 。通过物理、化
学方法消除或抑制内共生菌、分子生物学方法改造内共生菌等手段 ,都有可能防治病虫害。况且 ,已知
分子伴侣参与多肽的折叠、蛋白质组装、转位等过程 ,内共生菌 GroEL 蛋白可能参与了蛋白质的转
运[8 ,9 ,17 ] 。有关内共生菌 groEL 基因及其产生的 GroEL 蛋白的相关性质与功能研究 ,获得较多的目标物
是一个前提。虽然已经证实分离的内共生菌能够在体外合成一定量的蛋白质 ,但菌体不能体外繁殖 ,并
且 GroEL 蛋白合成量很少[18 ] ,因此进行 groEL 基因的克隆与原核表达研究 ,有利于深入研究 groEL 基因
及其产生的 GroEL 蛋白在植物病害防治中的作用。
参考文献 :
[ 1 ] 　值得注意的害虫 - 烟粉虱. 福建省林业科学院网 ,2002 年 9 月 16 日 http :ΠΠwww.fjforest . olg
[ 2 ] 　李大建 ,阎凤鸣. 烟粉虱的发生为害趋势. 植保技术与推广. 2001 ,21 (01) :20.
[ 3 ] 　邱宝利 ,任顺祥 ,孙同兴 ,等. 广州地区烟粉虱寄主植物调查初报. 华南农业大学学报 , 2001 ,22 ( 4) :43～47
[ 4 ] 　Zeidan M ,Czosnek H. Acquisition and transmission of Agrobacteriun by the whitefly Bemisia tabaci . Molecular Plant2Microbe Interactions , 1994 ,
7 (6) : 792～798
(下转第 54 页)
17Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (1) :68～71
图 2 　不同剂量辐照对药用淀粉 RVA 谱的影响
3 　讨论
将辐照后的药用淀粉制成一定浓度的悬浮
液 ,在加热、高温、冷却的测量过程中 ,其粘滞性
随着温度的不同会发生变化 ,这一粘滞性变化过
程称为淀粉谱。采用 RVA 测定所得的淀粉谱则
称为 RVA 谱 ( RVA profile) 。试验过程中悬浮液
的浓度不一样 ,粘度值也不一样 ,RVA 谱的峰高
也有一定的差异。由于药用淀粉在实际生产加
工过程中 ,各生产厂家的加工条件和环境因素不
同 ,初始微生物含量也不一样。有条件的生产厂家应在 GMP 车间生产 ,有效地降低初始微生物的含量 ,
同时也要保证足够的干燥时间。根据本研究的淀粉初始微生物含量和药用淀粉厂的厂标 ,药用淀粉辐
照灭菌剂量在 4～6kGy ,即可满足微生物的标准 ,也能达到药用淀粉厂对淀粉粘度的标准。
参考文献 :
[ 1 ] 　王守经 , 孙守义 , 于子厚. 药用淀粉辐照灭菌研究. 核农学报 ,1998 ,12 (4) :204～209
[ 2 ] 　包劲松 , 夏英武. 用淀粉粘滞性变化检测粮食辐照及其剂量的可行性研究. 浙江农业大学学报 , 1999 ,25 (3) :321～323
[ 3 ] 　Fu Junjie , Shen Weiqiao. The decontamination effect of gamma irradiation on the edible gelatin. Radiation Physics and Chemistry , 2000 ,57 (326)
:345～348
[ 4 ] 　傅俊杰 ,沈伟桥. 食用藕粉辐照杀菌与贮藏效果的研究. 中国农业科学 ,2002. 835 (8) :1007～1009
[ 5 ] 　Bao J S , Corke H. Pasting propertied ofγ2irradiation rice starches as affected by PH. J Agric Food chem ,2002 ,50 :336～341
[ 6 ] 　Hayashi T ,Todorike S. Detection of irradiation peppers by viscosity measurement at extremely high PH. Radia Phys Chem ,1996 ,48 :101～104
[ 7 ] 　国药标准 ,GB271321996. 北京 : 中国标准出版社
(上接第 71 页)
[ 5 ] 　冯兰香 ,杨宇红 ,谢丙炎 ,等. 警惕烟粉虱大暴发导致新的蔬菜病毒病 ,中国蔬菜. 2001 , (2) :34～35
[ 6 ] 　Margulis L. Symbiosis in cell evolution. Freeman Co ,San Francisco. USA 1981
[ 7 ] 　Van den Heuvel J F J M. Verbeek M. et al . Endosymbiotic bacteria associated with circulative transmission of potato leafroll virus by Myzus
persicae.J Gen Virol . 1994 ,75 :2559～2565
[ 8 ] 　Filichkin S A ,Brumfield S , Filichkin T P , et al . In vitro interactions of the aphid endosymbiotic SymL chaperonin with barley yellow dwarf virus.
J Virol ,1997 ,71 (1) :569～577
[ 9 ] 　Hogenhout S A , Van der Wilk F , Verbeek M , et al , Potato leafroll virus binds to the equatorial domain of the aphid endosymbiotic GroEL
homologue.J Virol ,1998 , (72) : 358～365
[10 ] 　吴云锋 ,崔晓峰 ,林林 ,等. 禾谷缢管蚜体内的病毒结合蛋白基因的克隆和原核表达. 微生物学报 ,2002 ,42 (4) :448～451
[11 ] 　吴云峰 ,周广和 ,树斌. 蚜传病毒专化性与病毒附着蛋白的关系. 西北农业学报 ,1999 ,8 (4) :5～7
[12 ] 　Morin S , Ghanim M , Zeidan M ,et al . A GroEL homologue from endosymbiotic bacteria of the whitefly Bemisia tabaci is implicated in the circulative
transmission of tomato yellow leaf curl virus. Virology 1999 ,30 ;256 (1) :75～84
[13 ] 　Morin S , Ghanim M , Sobol I , et al . The GroEL Protein of the whitefly Bemisia tabaci interacts with the coat protein of transmissible and
nontransmissible begomovirous in the yeast two2hybrid system. Virology ,2000 ,276 :404～416
[14 ] 　林林 ,吴云锋 ,崔晓峰. 玉米蚜体内参与传毒的内共生菌 groEL 基因的克隆和原核表达. 中国病毒学 ,2003 ,18 (1) :54～57
[15 ] 　崔晓峰 ,吴云锋 ,林林 ,等. 桃蚜体内与病毒结合的共生菌 Buchnera groEL 基因的克隆和序列分析. 中国病毒学 ,2001 ,17 (1) :69～72
[16 ] 　Beard C Houk E J . Intracellular symbiotes of the Homoptera. Ann Rev Entomol ,1980 ,25 :161～187
[17 ] 　Van den Heuvel J F J M , Bruyere A , Hogenhout S A , et al . The N2terminal region of the luteovirus readthrough domain determines virus binding
to Buchnera GroEL and is essential for virus persistence in the aphid. J Virol . 1997 , (71) :7258～7265
[ 18 ] 　B ,O’Neill S L ,Mason P ,et al . Nucleotide genetic transformation and phylogeny of bacteria symbionts from tsetse . Insect Mol Biol ,1993 ,1 (3) :123
～131
45 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (1) :52～54