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APPLICATION OF BIOTECHNOLOGY IN GENETICS AND BREEDING OF TALL FESCUE

生物技术在高羊茅育种研究中的应用



全 文 :文章编号 :100028551 (2008) 062806205
生物技术在高羊茅育种研究中的应用
黄 新1  叶红霞2  舒小丽2  吴殿星2
(11 浙江省农业科学院畜牧研究所 , 浙江 杭州 310021 ;
21 浙江大学原子核农业科学研究所国际原子能机构合作中心 , 浙江 杭州 310029)
摘  要 :高羊茅 ( Festuca arundinacea Schreb. )是一种重要的牧草和草坪兼用型草种 ,在农牧业和草坪业中
均占据重要地位。本文对高羊茅的育种历史和现状作了概述 ,综述了高羊茅分子生物学研究和利用生
物技术创新种质的进展 ,旨在为开展高羊茅生物技术育种提供参考。
关键词 :高羊茅 ;生物技术 ;育种
APPLICATION OF BIOTECHNOLOGY IN GENETICS AND BREEDING OF TALL FESCUE
HUANG Xin1  YE Hong2xia2  SHU Xiao2li2  WU Dian2xing2
(11 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang  310021 ;
21 IAEA Collaborating Center , Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang  310029)
Abstract :Tall fescue ( Festuca arundinacea Schreb. ) is an important lawn and pasture grass in agriculture , animal husbandry
and lawn industry. The historical and present situations of tall fescue breeding were briefly introduced , and advances in the
researches of molecular biology and germplasm enhancement by biotechnology in tall fescue were reviewed in the paper , which
would provide the references for tall fescue breeding by biotechnology.
Key words :tall fescue ; biotechnology ; breeding
收稿日期 :2007212228  接受日期 :2008204225
基金项目 :航天育种工程 2006HT2006、浙江省科技项目 2007C22008 \ 2007C12025〉602
作者简介 :黄新 (19712) ,男 ,浙江苍南人 ,副研究员 ,主要从事饲料作物遗传育种研究。
通讯作者 :舒小丽(19802) ,女 ,湖南芷江人 ,助理研究员 ,从事作物高效育种方法和资源创新利用研究。Tel :0571286971405 ;E2mail :shuxl @zju. edu. cn
  高羊茅 ( Festuca arundinacea Schreb. ) , 禾本科
( Gramineae)羊茅属 ( Festuca) 植物 ,是一种重要的牧草
和草坪兼用型草种 ,在国内外农牧业和草坪业中占据
重要的地位。作为冷季型草坪草 ,高羊茅广泛用于我
国黑龙江、北京、山东、江苏、武汉、江西等省市的城市
绿化和运动场地铺设 ;作为优质牧草 ,仅美国年种植面
积就达 118~211 亿亩。在我国高羊茅种子的进口量
约占草种总进口量的 70 %。
高羊茅叶片粗糙、再生性差、夏季生长缓慢、易遭
杂草侵害、越冬能力和抗旱耐盐碱能力差等诸多缺陷 ,
限制了它更为广泛的应用。因此 ,十分必要应用生物
技术深入发掘与开发高羊茅新种质 ,选育抗病、抗虫、
耐践踏、植株低矮、抗除草剂和耐逆的高羊茅新品种。
1  高羊茅育种概况
与其他作物的研究历程类似 ,高羊茅也经历了由
传统育种如系统选育、杂交和诱变育种等逐步向生物
技术育种转变的过程。
在国外 ,如美、英、法、德等将草坪业与草坪草育种
紧密相联 ,以不同生态型草坪植物为亲本培育了许多
良种。在高羊茅育种方面 ,美国一直走在世界前列。
1943 年 ,美国育成了高羊茅新品种 Kentucky31 ,该品种
多用于饲料 ,也可用于草坪。1972 年 ,矮性草坪型高
羊茅新品种 Rebel 首先由 Rutger 大学育成。此后 ,又
相继育成 Falcon、Arid、Houngdog 等改良型草坪用新品
种 ;还有以低矮生长习性的种质为亲本 ,经种间杂交育
成了系列低矮型高羊茅新品种 ,如 Regiment、Seine、
Summedawn 等。
同国外相比 ,我国草坪草育种起步较晚 ,以国外良
种的引种和适用性研究为主 ,自主选育的新品种很少。
何亚丽等[1 ]培育了草坪型高羊茅新品系 98 - 8 和上农
矮生高羊茅。吴佳海等[2 ]利用贵州野生高羊茅地方种
经定向选择育成坪用型高羊茅新品系 (种) 98 - 1。李
608  核 农 学 报 2008 ,22 (6) :806~810Journal of Nuclear Agricultural Sciences
俊龙和王槐三[3 ] 进行多花黑麦草和高羊茅属间杂交 ,
获得了属间杂种 ,并提出利用高羊茅的耐热性改变多
花黑麦草的抗旱与耐热性的可能。张新全等[4 ] 进行坪
用黑麦草 Derby 和高羊茅 Houndog 的属间杂交 ,未经胚
培养就获得杂种 ,进一步证明利用高羊茅和黑麦草进
行属间杂交改良品种是可行的。
在高羊茅诱变育种方面 ,研究者们仅作了一些初
步探索。柴明良等[5 ] 以高羊茅栽培种为材料 ,对其干
种子进行不同剂量的60 Co 辐照处理 ,测定了各处理种
子在实验室萌发和田间生长的情况。结果表明 ,就抑
制早期生长减少剪草次数而言 ,以 200Gy 剂量为宜。
胡繁荣等[6 ] 以系列彩色高羊茅中的黄叶高羊茅为材
料 ,经返回式卫星搭载处理 ,从中筛选鉴定半矮性、匍
匐性、细叶、迟熟、耐热等优质耐逆黄叶高羊茅突变体。
王月华等[7 ]采用60 Coγ射线辐照 3 个高羊茅品种 ,结果
发现 ,50Gy 辐照可促进高羊茅种子的萌发 ,较高剂量
的辐照则抑制高羊茅种子的萌发 ,且随辐照剂量的加
大 ,抑制作用增强 ,150Gy 左右的辐照能有效诱导高羊
茅种子发生变异。
综上所述 ,采用系统选育、杂交等传统育种技术改
良高羊茅已取得长足的进展 ,但高羊茅是一种异花授
粉植物 ,常规育种往往进程慢且性状遗传稳定性差。
生物技术 ,尤其是基因工程技术 ,使不同物种的基因交
流和基因的定向转移成为可能 ,从而为高羊茅的遗传
育种提供了新的技术手段。
2  高羊茅分子生物学研究
高羊茅是多年生的异源多倍体植物 ,其栽培品种
通常为六倍体类型 ,野生品种有四倍体、八倍体和十六
倍体等变异。由于六倍体高羊茅的基因组很大 (估计
为 5127~5183 ×106 kb) ,且是异花授粉植物 ,自交高度
不亲和 ,导致现有栽培品种遗传基础复杂 ,品种间遗传
差异很大 ,对其进行遗传解析难度较大。高羊茅分子
生物学的发展 ,有助于其遗传学研究的深入 ,挖掘丰富
的遗传信息 ,为高羊茅品种改良提供重要的分子遗传
学基础。
211  遗传图谱构建
虽然高羊茅的异源六倍体性质和异交特性使其在
遗传分析上存在很多困难 ,但高羊茅具有的多年生和
多蘖的生长习性、RFLP 标记的高度多态性和二倍体遗
传的性质 ,使其同源等位基因的分离可被清晰地识别 ,
这为构建高羊茅 RFLP 遗传图谱提供了可能。Xu[8 ] 等
利用 HD28256 ×Kentucky 31 的 F2 群体 ,基于 RFLP 分
子标记构建了世界上第一张六倍体高羊茅的遗传图
谱。该图谱包含 108 个 RFLP 标记 ,总图距为 1274cM ,
覆盖了 19 个连锁群 ,平均每个连锁群 5 个位点 ,位点
平均间距为 1719cM。Saha 等[9 ] 采用 ( HD28256 ×R432
64) ×HD28256 拟测交 (pseudo test cross)作图群体 ,基于
AFLPs 和来源于高羊茅和其他禾草以及 Festuca ×
Lolium杂种的 EST2SSRs 分别构建了母本基因型 HD282
56 和父本基因型 R43264 的分子连锁图谱 ,然后以在双
亲中均表现 1∶3 的多态性标记为桥梁位点整合双亲的
分子图谱。该整合图谱总图距为 1841cM ,覆盖了 17
个连锁群 ,平均每个连锁群 54 个位点 ,位点平均间距
为 210cM ,图谱较之前构建的高羊茅 RFLP 分子图谱密
度和精度都大大提高。
212  遗传多样性
20 世纪 70 年代发展起来的 DNA 分子标记在高羊
茅遗传变异和遗传多样性研究方面得到了广泛应用。
Xu 等[10 ]利用来源于高羊茅 Pstl 基因组DNA 文库的 24
个探针同 9 个草坪型和 7 个牧草型高羊茅品种的经限
制性内切酶 EcoRl 或 Hind Ⅲ酶解的基因组 DNA 杂交 ,
RFLP 分析表明各品种间存在随品种和探针的不同而
有所变化的较高变异 ,RFLP 带的数目在各品种间显著
不同 ,且高羊茅草坪型品种聚为一类 ,而牧草型品种则
存在较大的分化。Rouf Mian 等[11 ]采用AFLP 荧光标记
法分析了 16 个耐剪高羊茅基因型的遗传变异 ,并在此
基础上筛选出几个用于构建作图群体的候选亲本 ,同
时还采用AFLP 红外染料标记法分析了 18 个高羊茅居
群的遗传多样性 ,结果表明 , KY231 材料和其衍生栽培
品种显著有别于美国南方大平原材料 ,从而为高羊茅
育种提供了又一具有丰富变异的资源。Saha 等[12 ] 根
据从 Noble Foundation 公共数据库中搜索的 20000 条高
羊茅 ESTs 序列 ,设计了 157 对 EST2SSR 引物 ,选用高
羊茅、草地羊茅、蓝羊茅等 7 个物种代表性禾草的 11
个基因型测试其有效性 ,发现大多数引物能有效区分
高羊茅和其近缘物种 ,异交物种高羊茅和黑麦草之间
EST2SSR 标记的多态性远高于自交物种水稻和小麦 ,
这说明高羊茅 EST2SSR 标记对于羊茅属和黑麦草属是
一种极有价值的遗传标记 ,而且对于高羊茅和其近缘
物种及小麦、水稻等禾谷类作物的比较基因组研究也
具有潜在的利用价值。国内对该方面的研究尚少 ,田
志宏等[13 ] 采用 RAPD 标记技术对国外引进的 15 个高
羊茅品种的遗传多样性进行研究 ,根据带型统计结果 ,
计算各品种间的遗传相似系数 ,同时利用 UPGMA 法
进行聚类分析。遗传相似系数矩阵表明 ,高羊茅品种
间相似性系数变化较大 ,变化范围为 01373~01932。
708 6 期 生物技术在高羊茅育种研究中的应用
王小利等[14 ]选用 20 个随机引物对 23 个高羊茅材料进
行了 RAPD 分析 ,20 个引物共扩增出 306 条带 ,其中多
态性带为 269 条 ,比例为 87191 %。聚类分析表明 ,所
选高羊茅材料间的遗传多样性较低 ,相似性集中在
53179 %~85153 % ,其中 P18 与其他高羊茅材料的相
似性较低 ,材料间的聚类关系与表型特征呈不完全相
关。
213  基因克隆与表达
有关高羊茅的基因克隆与表达研究较晚 ,系统和
完整的研究较少 ,但也取得一些进展。Lüscher 等[15 ] 从
高羊茅中分离了一个编码蔗糖 - 蔗糖果糖基转移酶基
因的 cDNA 并利用烟草原生质体瞬间表达系统初步分
析了其功能。Chen 等[16 ] 从牧草型高羊茅分离得到了
木质素合成关键酶二羟基肉桂酸 32甲基转移酶
(COMT) 的基因序列。阳文龙等[17 ] 构建了高羊茅的
4 ℃低温诱导 cDNA 文库 ,并从这个文库中分离得到一
个 DREB 类转录因子基因 FaDREB1A 。Southern 杂交
显示 , FaDREB1A 在高羊茅基因组中可能是单拷贝或
低拷贝基因 ;Northern 杂交发现 , FaDREB1A 基因受低
温、高盐和干旱的诱导表达 ,对 ABA 无反应 ,说明
FaDREB1A 基因在高羊茅植株对低温、高盐和干旱的
应答反应中起重要作用。随后 ,阳文龙等[18 ] 又利用同
源基因克隆法从 4 ℃低温诱导的高羊茅幼苗 cDNA 文
库中 分 离 到 一 个 MAPK 的 cDNA , 即 FaMA PK1 ,
FaMA PK1 编码一个包含 369 个氨基酸残基的蛋白激
酶 ,该蛋白激酶具有 TEY的磷酸化基序 , FaMAPK1 蛋
白可能在高羊茅对非生物逆境胁迫的反应中起重要作
用。
3  高羊茅生物技术育种
目前有关高羊茅遗传变异的报道不多 ,这给育种
工作造成一定的困难 ,生物技术的发展和应用 ,为高羊
茅种质资源的创新与研究提供了有力的手段。
311  体细胞无性系变异
植物组织培养过程中常出现变异 ,这种现象称为
体细胞无性系变异。利用体细胞无性系变异 ,在培养
基中施加选择压 ,可筛选出特定变异细胞及其再生植
株。体细胞无性系变异技术已广泛应用于农作物育
种 ,但有关高羊茅体细胞无性系变异的报道却十分有
限。Roylance 等[19 ]在高羊茅再生过程中虽尽量减少体
细胞无性系变异的发生 ,但仍有突变体产生 ,且再生植
株的总生物量及种子产量发生了明显变化。韩晓光
等[20 ]以高羊茅种子为材料诱导愈伤组织 ,采用NaCl 筛
选出耐盐的变异愈伤组织 ,并从中获得了耐盐的再生
植株。
采用理化诱变和细胞培养相结合的离体诱变技
术 ,可显著提高体细胞无性系变异的频率 ,扩大变异
谱。张彦芹等[21 ]以60 Coγ射线辐照高羊茅品种爱瑞 3
号的干种子和分化苗 ,发现出苗率和植株存活率随辐
照剂量的增加而降低 ,干种子适宜诱变剂量为 100~
150Gy ,分化苗适宜诱变剂量为 20~25Gy。随后 ,张彦
芹等[22 ]在诱变当代筛选获得了叶片变小、变细而且耐
寒的突变体 ,其中 3 个突变体 ARF001212、ARG001217
和 ARG001216 的耐寒性均显著优于对照 ,叶根比小于
对照 ,单株生物量低于对照 ,可作为耐寒新种质加以利
用。
312  体细胞杂交
体细胞杂交可克服远缘杂交不亲和性 ,转移由细
胞核和细胞质基因控制的性状 ,在作物育种中具有特
殊的地位。将高羊茅和黑麦草优良特性有机结合的体
细胞杂交是高羊茅遗传改良的一个热点。Takamizo
等[23 ]将碘乙酰胺失活的高羊茅原生质体与非形态发
生的意大利黑麦草原生质体电融合 ,再生获得了若干
植株 ,这些植株在生长习性及叶片与花序形态等方面
介于双亲之间 ,Southern 杂交分析表明 ,再生植株含有
高羊茅和意大利黑麦草的特异DNA 片段。Spangenberg
等[24 ]以来自高羊茅胚诱导产生的悬浮细胞系代谢性
失活的原生质体为受体 ,以未经辐照或经 10~500Gy
剂量的 X射线辐照的多花黑麦草原生质体为供体 ,进
行细胞融合获得了属间对称与非对称的体细胞杂种。
采用融合技术 ,更有利于获得非对称的体细胞杂种。
313  基因工程
高羊茅等羊茅草种的遗传转化始于 20 世纪 90 年
代初 ,1992 年 ,Ha 等[25 ,26 ] 通过原生质体培养首次获得
了高羊茅转基因植株。在过去的十几年里 ,国内外已
进行了诸多有关高羊茅的组培再生和遗传转化的实验
研究 ,但主要集中于方法学方面 ,如不同外植体的选
择、不同基因转化方法的采用、离体培养体系的优化、
遗传转化因素的探索等。用于高羊茅转化的外源基因
主要是选择标记基因 hpt (潮霉素磷酸转移酶基因) 、
抗除草剂基因 bar (膦丝菌素乙酰转移酶基因) 和报告
基因 gus (葡糖苷酸酶基因) 。Wang 等[27 ] 在高羊茅中
转入第一个在农业上具有营养价值的向日葵清蛋白基
因 sf a8。近年来 ,研究者们开始重视在高羊茅中导入
具有经济价值的基因 ,并已成功获得一批具有特定性
状的转基因植株。
31311  改良饲用和坪用品质  改良高羊茅的饲用品
808 核 农 学 报 22 卷
质 ,主要是降低高羊茅植株中木质素含量 ,以提高其干
物质消化率 ,有利于动物吸收。Chen 等[28 ] 将木质素单
体合成过程中的关键酶肉桂醇脱氢酶 (CAD) 基因反向
导入高羊茅 ,转基因植株中的木质素含量显著减少。
之后 , Chen 等[16 ] 又将二羟基肉桂酸 32甲基转移酶
(COMT)的反义基因导入高羊茅 ,转基因植株表现为
COMT转录水平下降 ,酶活性和木质素含量显著降低 ,
干物质可消化性增加 918 %~1018 %。
牧草和饲料的氨基酸含量与动物生产力成正比 ,
含硫氨基酸能促进羊毛的生长。Wang 等[27 ] 采用向日
葵的一种优质营养蛋白基因 ———富硫清蛋白 ( SFA8)
基因和内质网定位信号基因 KDEL 共同转化高羊茅的
胚性悬浮细胞 ,Southern 分析显示 sf a8 基因己整合到
基因组中并能稳定遗传 ,转基因植株中目的蛋白 SFA8
含量占可溶性总蛋白的 012 %。
在改良高羊茅的坪用品质方面 ,培育矮化高羊茅
新品种可大大降低其养护费用。王月华等[29 ] 利用从
结缕草中克隆到的 GA202氧化酶基因 ,构建了正义和
反义表达载体并转化高羊茅 ,以期培育矮化高羊茅新
品种。
31312  增强抗病性  真菌病害一直是牧草和草坪草
的重要病害。传统抗病育种周期长、耗时费力 ,远远不
能满足生产需要。基因工程技术可以在基因水平上对
目标性状进行改良 ,使生物体的遗传性状发生定向变
异并能稳定遗传 ,可大大缩短育种年限 ,在保留植物其
他优良性状的基础上 ,针对性地对一个或某几个性状
进行改良。采用基因工程技术改良高羊茅抗病性成为
新的研究热点。马生健等[30 ] 采用农杆菌介导法将几
丁质酶基因 Chi 和β21 ,32葡聚糖酶基因 Glu 导入高羊
茅愈伤组织 ,再生获得了抗真菌病的高羊茅转基因植
株。Dong 等[31 ]将来自噬菌体的 T4 溶菌酶基因导入高
羊茅 ,转基因植株对灰斑病和褐斑病表现明显的抗性 ,
之后 Dong 等[32 ]又在不同的启动子驱动下将苜蓿的葡
聚糖酶基因 ( Aglu1) 、蛙类的抗菌多肽基因 ( SI) 和水稻
的抗稻瘟病基因 ( Pi9)分别导入高羊茅 ,获得的转基因
株系大部分对灰斑病和褐斑病的抗性显著增强。
31313  提高抗逆性  提高高羊茅的耐寒、耐旱、耐盐
碱等耐逆性 ,可降低其管理费用 ,扩大种植区域 ,是草
坪型和牧草型高羊茅新品种选育追求的共同目标。
Lee 等[33 ]采用农杆菌介异法将氧化胁迫诱导启动
子控制的编码超氧化物歧化酶 ( CuZn superoxide
dismutase)和抗坏血酸过氧化物酶 (Ascorbate peroxidase)
的基因导入高羊茅 ,经紫外线、过氧化氢和重金属胁迫
处理 ,发现转基因植株与对照相比 ,体内活性氧含量明
显减少 ,叶绿素降低程度较低 ,细胞膜损伤较轻 ,表明
转基因植株的耐逆性有所提高。
Hu 等[34 ]采用农杆菌介导法将由玉米 ubiquitin 启
动子驱动的异戊烯基转移酶基因 (isopentenyl transferase
gene , ipt)转入高羊茅后 ,转基因植株的抗寒性和分蘖
能力得到改善。李志亮等[35 ] 采用基因枪法将由玉米
ubiquitin 启动子驱动的豇豆Δ12吡咯啉252羧酸合成酶
基因的突变型 P5 CS2F129A 基因转入高羊茅羚羊品种
中 ,获得了 25 株转基因植株 ,脯氨酸含量测定表明 ,转
基因植株中的脯氨酸含量比对照高 31 % ~ 83 % ;植
株耐旱性初测表明 ,转基因植株比对照耐旱。Zhao
等[36 ]采用农杆菌介异法将由诱导型 rd29A 启动子驱动
的 DREBIAΠCB F3 基因导入高羊茅品种 T1 植株中 ,
AtDREB1A 基因稳定遗传并表达 , RT2PCR 分析发现
AtP5 CS2 的表达增强 ,转基因植株耐旱性增加。吴 
等[37 ]将脱水素基因 ( BcDhl) 导入高羊茅 ,在干旱胁迫
下转基因株系比非转基因株系表现更强的抗性。王飞
和谢树莲[38 ]对含 Bar 基因和海藻糖合酶基因 ( TPS ) 的
转基因高羊茅植株的耐旱性指标进行测定 ,结果表明
转基因高羊茅植株的抗旱能力明显增强。
为提高高羊茅的耐盐性 ,赵军胜等[39 ] 、Tian 等[40 ]
和 Qiao 等[41 ]先后采用不同转化方法将拟南芥的 Na + Π
H+ 反转运蛋白 (AtNHX1) 基因导入高羊茅 ,发现转基
因植株的耐盐性显著增强。吴关庭等[42 ] 采用农杆菌
介导法将拟南芥耐逆相关基因 CB F1 导入 4 个高羊茅
品种 ,获得了 112 株转基因植株 ,发现在高盐与高渗胁
迫下 ,转基因植株具有显著的生长优势 ,存活率极显著
高于非转化对照植株 ,经低温、高温、干旱和高盐等逆
境胁迫处理的叶片相对电导率平均较对照低 25 %~
30 % ,证明转基因植株的耐逆性有所提高。但同时也
发现 ,在非胁迫的条件下 , CB F1 基因的组成型超表达
使转基因植株的生长受抑。
4  结语
在我国农业结构调整的背景下 ,节粮型草食性畜
牧业代表了中国畜牧业的发展方向 ,这必将极大地推
动牧草和草坪草品种的更新与发展。高羊茅作为一种
重要的牧草与草坪兼用型草种 ,其重要性正日益显现。
生物技术的发展和应用为高羊茅遗传育种开辟了
一条崭新的途径 ,今后的研究重点仍将围绕以下四个
方面展开 : (1)利用体细胞无性系变异 ,尤其是结合离
体诱变和外加选择 ,筛选特定的体细胞无性系变异体
及其再生植株 ; (2) 利用体细胞杂交技术 ,尤其是融合
908 6 期 生物技术在高羊茅育种研究中的应用
技术产生中间型品种 ; (3) 利用转基因技术 ,快速有效
地直接将控制优良性状的目的基因导入品种之中 ; (4)
利用分子标记辅助选择技术聚合多种优良性状。
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