全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 042260205
温度对不同穗重型水稻叶片保护酶活性
及同工酶表达的影响
朱雪梅1 　邵继荣2 　杨文钰3 　任正隆3
(11 四川农业大学资源与环境学院 , 四川 雅安　625014 ;21 四川农业大学生命科学与理学院 ,四川 雅安　625014 ;
31 四川农业大学农学院 ,四川 雅安　625014)
摘 　要 :通过人工控温 ,对不同穗重型品种叶片的过氧化物酶 ( POD) 、过氧化氢酶 (CAT) 和超氧
化歧化酶 (SOD)的酶活性及同工酶表达进行研究 ,结果表明 :重穗型品种 Ⅱ优 162、冈优 527 在
适温 (24 ℃) 、次高温 (29 ℃)和高温 (32 ℃) 下 ,叶片中的 3 种保护酶活性都呈上升的趋势 ;而中
穗型品种D 优 68 和轻穗型品种 E优 540 ,在高温下其 3 种保护酶活性下降。从同工酶表达看 ,
SOD 的同工酶谱带在不同穗重型品种间无明显差异 ,且随温度的升高而减弱。CAT 表达则在
重穗型与中穗和轻穗型品种间有明显不同 ,特别是高温胁迫 (38 ℃)下 ,中穗型和轻穗型品种谱
带 C21 消失 ,而重穗型品种则产生 1 条新的 CAT谱带 C20。POD 表达研究发现 ,不仅穗重型间 ,
且在同一类型的品种间也存在差异性 ,但前者间的差异显著大于后者 ,表明不同穗重型可能存
在不同的高温应答机制。
关键词 :温度 ;水稻 ;穗重类型 ;保护酶活性 ;同工酶表达
收稿日期 :2005201218
基金项目 :四川省科技厅攻关课题“四川水稻安全化生产技术研究”(20030823)
作者简介 :朱雪梅 (1963 - ) ,女 ,副教授 ,主要从事作物生理生态及栽培研究。杨文钰和任正隆为通讯作者 ,Email :Zhubroad @1631com
EFFECTS OF TEMPERATURE ON PROTECTIVE ENZYMES ACTIVITIES AND
THEIR ISOZYMES EXPRESSION IN LEAF OF DIFFERENT PANICLE
WEIGHT TYPE OF MEDIUM INDIA HYBRID RICE
ZHU Xue2mei1 　SHAO Ji2rong2 　YANG Wen2yu3 　REN Zheng2long3
(11 Resources & Environment College ; 21 College of Biology and Science ;
31 College of Agriculture , Sichuan Agriculture University , Yaan , Sichuan , 625014)
Abstract :The different panicle weight types of medium India hybrid rice were cultured in four plots at different
temperatures. Analysis was conducted on the activity of peroxidase (POD) ,catalase (CAT) and superoxide dismutase
(SOD ) , and their isozymes expression in the leaves. The results indicated that there was an increasing tendency in
the activity of protective enzymes (POD , CAT , SOD) of the leaves of II2you 162 ,Gangyou 213 (the heavy2panicle)
under temperature of 32 ℃, 29 ℃ and 24 ℃ , but there was a decreasing tendency of the activity of protective
enzymes in D2you 68 (the middle2panicle) and E2you 540 (the light2panicle) under temperature of 32 ℃. There
were no significant differences between the isozymes pattern of SOD among varieties of different panicle weight types
of rice , and isozymes expression of SOD weakened with increasing temperature. There were great differences
between the isozymes expression of CAT of the different panicle weight type. Especially under high temperature
stress (38 ℃) , the CAT isozymes pattern of the middle2panicle type and light2panicle type of rice disappeared ,
however , II2you 162 (the heavy2panicle) showed a new isozymes pattern of CAT“C20”. The differences of the
isozymes expression of POD shown not only among different panicle weight type ,but also among varieties of the same
panicle weight type , and the former is more oblivious than the latter. Therefore , it is concluded that there is
possibly a new mechanism of response to high temperature in the heavy2panicle type of rice as compared with the
062　 核 农 学 报　2005 ,19 (4) :260～264Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
middle2panicle and light2panicle type of rice.
Key words :temperature ; rice ( Oryza sativa L. ) ; panicle weight type ; protection enzyme ; isozymes expression
作物产量和品质的高低主要由叶片光合功能与效率以及对环境的抗逆力等决定。研究表明 ,重穗
型水稻品种在高光强、高温和低 CO2 浓度下都显示出比中穗型和轻穗型品种有更高的净光合速率 ,及
较强的抗逆性 ,是目前超高产水稻育种的理想穗型之一[1～3 ,5 ] 。有关不同穗重型水稻品种的光合、光合
积累与运转特性以及产量潜力等研究已有较多报道[3～7 ] ,但对其叶片活性氧代谢机理研究甚少。本试
验通过人工控温 ,研究温度对不同穗重型品种叶片过氧化物酶 (POD) 、过氧化氢酶 (CAT) 、超氧化歧化酶
(SOD)的酶活性变化及同工酶表达 ,以期探讨不同穗重型品种的高温应答机制 ,为水稻超高产育种和科
学栽培提供参考。
1 　材料与方法
111 　材料
参试材料 7 个 ,即重穗型品种 Ⅱ优 162、冈优 213、D 优 527 ,中穗型品种D 优 68、汕优 63 ,轻穗型品种
E优 540、E优 532 ,均由本校水稻研究所提供。试验于 2003 年和 2004 年在四川雅安和乐山进行。
112 　方法
11211 　水稻幼苗培养　将 7 个参试品种的种子浸泡催芽后 ,于培养皿中在 24 ℃光照培养箱中培养 ,待
幼苗长至 2 叶 1 心时 ,置人工气候箱中进行不同温度处理试验。
11212 　人工控温处理　人工气候箱的控温处理分为 4 组 :第 1 组作为适温对照处理 ,日均温控制在
2410 ℃(昼 2610 ℃Π夜 2210 ℃) ;第 2 组为次高温处理 ,日均温控制在 29 ℃(昼 3210 ℃Π夜 2610 ℃) ;第 3 组
高温处理 ,日均温控制在 32 ℃(昼 3510 ℃Π夜 2910 ℃) ;第 4 组为高温胁迫处理 ,日均温控制在 38 ℃(昼
4210 ℃Π夜 3410 ℃) 。其中前 3 组处理时间为 6d ,第 4 组的高温胁迫的影响处理时间为 4d。所有处理的
相对湿度为 75 %～85 % ,风速 015mΠs ,日间光照强度 1000μmol·m - 2·s - 1 。
11213 　保护酶活性测定　取经不同温度处理后的水稻幼苗叶片 1g ,液氮研磨成粉 ,加 5mmolΠL 2 %β2巯
基乙醇和 50mmolΠL pH 710 磷酸缓冲液 ,于 4 ℃15000g 离心 20min ,上清液即为酶提液 ,置 - 20 ℃冰箱中
备用。
POD 活性测定方法为取 20μl 酶提液 ,加入 314ml 25mmolΠL pH 710 的磷酸缓冲液 (含 011mmolΠL
EDTA) 、200μl 100 mmolΠL 的 H2O2 和 200μl 0105 %愈创木酚 ,25 ℃下反应 ,测定 470nm 下的动力学变化 ,
吸光系数为 2616mmolΠ(LCM) 。
CAT活性测定方法为取 20μl 酶提液 ,加入 117ml 25mmolΠL pH 710 的磷酸缓冲液 (含 011mmolΠL
EDTA) 、200μl 100mmolΠL 的 H2O2 , 25 ℃下反应 ,测定 240nm 下的动力学变化 ,吸光系数为 3914mmolΠ
(LCM) 。
SOD 活性测定方法为取 20μl 酶提液 ,按 Giannopolitis 和 Ries[8 ]的方法 ,以抑制 NBT(氯化硝基四氮唑
蓝)光化还原 50 %作为一个酶活力单位。
同工酶的电泳及染色方法为取 15μl 酶液 ,聚丙烯酰胺凝胶垂直版电泳。浓缩胶浓度 ( T) 为 4 % ,分
离胶浓度 POD 为 810 %、CAT为 515 %、SOD 为 715 % ,220V 稳压电泳 ,时间 14h。电泳后其染色分别为 :
POD 凝胶于 3 %H2O2 中浸泡 1min ,双蒸水冲洗 ,再放入染色液 (01025g 32氨基292乙基卡巴唑 ,2ml N ,N2二
甲基甲酰氨 ,215ml 110molΠL 醋酸钠缓冲液 pH510 ,4715ml H2O)中染色。CAT凝胶于 015 % H2O2 中浸泡
1min ,双蒸水冲洗 ,再放入染色液 (5ml 碘化钾 ,1ml 冰醋酸 ,95ml H2O)中染色 ,凝胶上有 CAT活性的部位
无色 ,而其余部位为深蓝色。SOD 凝胶直接放入染液 (50mol Tris2HCl 缓冲液 pH810 ,01002g VB2 ,5μl 10 %
EDTA ,160μl 1 %NBT)中 ,凝胶上有 SOD 活性的部位无色 ,而其余背景为深色。
162　4 期 温度对不同穗重型水稻叶片保护酶活性及同工酶表达的影响
2 　结果与分析
211 　温度对水稻叶片中保护酶活性的影响
21111 　温度对水稻叶片中过氧化物酶( POD)活性的影响 　由图 1 可见 ,不同穗重型水稻品种在 24 ℃和
29 ℃两组处理中 ,其 POD 活性随处理温度的增加而提高 ;但 32 ℃处理中 ,其 POD 活性发生明显变化 ,其
中重穗型品种 Ⅱ优 162 的酶活性继续增加 ;中穗型品种 D 优 68 和轻穗型品种 E优 540 的已经下降。同
时 ,38 ℃(昼 42 ℃Π夜 34 ℃)高温胁迫下 ,3 个不同穗重型品种叶片的 POD 活性均呈现迅速下降的趋势 ,但
重穗型品种的酶活性比中穗型和轻穗型的明显高出许多。说明重穗型品种的 POD 活性与中穗型和轻
穗型品种的相比 ,存在明显不同。而 3 个重穗型水稻品种之间 ,在 4 种温度下的叶片 POD 活性 ,仍存在
差异 ,但这种差异与不同穗重型品种间比较差异不显著。由此可以看出 ,不同穗重型水稻品种的叶片
POD 活性 ,既存在不同穗重类型间的差异 ,也有同一穗重类型品种间的差异 ,但前者比后者的差异性更
显著。
图 1 　不同温度处理不同穗重型品种的 POD、CAT和 SOD 的活性变化
Fig. 1 　Changes of POD ,CAT and SOD Activity in the Leaf of different
panicle weight types of medium India hybrid rice under different temperture
21112 　温度对水稻叶片中过氧化氢酶( CAT)活性的影响　由图 1 可见 ,在 24 ℃、29 ℃和 32 ℃3 组温度处
理中 ,重穗型品种 Ⅱ优 162 和中穗型品种D 优 68 叶片的 CAT活性均随温度升高 ,其活性增加 ;而轻穗型
品种 E优 540 在 29 ℃时就开始下降了。从不同穗重型品种间比较 ,以重穗型品种 Ⅱ优 162 的 CAT活性
最高 ;而中穗型品种 D 优 68 和轻穗型品种 E优 540 的酶活性则差异不显著。从 3 个同一重穗型品种之
间的 CAT活性比较 ,其品种间仍有差异 ,但差异比不同穗重型品种间小得多。
21113 　温度对水稻叶片中 SOD 活性的影响　从图 1 可以看出 ,SOD 酶活性的变化趋势与 CAT活性变化
保持了大体相同趋势。这说明重穗型品种抗高温伤害的保护能力明显优于中穗型和轻穗型品种。
212 　温度对水稻叶片中 POD、CAT和 SOD 的同工酶表达的影响
根据 Morishima 和 Glazmann 对植物同工酶谱带纹的命名原则和方法[9 ,10 ] ,对本研究中叶片的 3 种保
护酶即 POD、CAT和 SOD 的同工酶谱带进行命名和编号。其顺序从正极开始为第 1 条 ,依次编号。
21211 　温度对水稻叶片中 POD 同工酶表达的影响　从图 2 可看 ,5 个水稻品种叶片中的 POD 都有 5 条
酶带即 P21、P22、P24、P25、P26 ,这说明这 5 条酶带为所有品种共有。但中穗型品种 D 优 68 和轻穗型品种
E优 540、E优 532 的 POD 带比重穗型品种 II 优 162、冈优 213 的多 1 条 ,即“P23”。从不同温度处理看 ,
在 24 ℃、29 ℃、32 ℃3 组温度处理中 ,两个重穗型品种的 5 条带仍清晰可见 ,但 38 ℃高温胁迫下 ,P24 和
P25 带消失了。说明高温胁迫对重穗型品种的这两条酶带的表达产生影响 ;而中穗型品种和轻穗型品
种在 24 ℃、29 ℃两种温度处理中 ,其酶带表达明显不同。在 24 ℃适温下 ,中穗型和轻穗型品种的 6 条酶
带均清晰可见 ;而在 29 ℃次高温下 ,中穗型品种 D 优 68 的 6 条酶带仍可以辨认 ,但轻穗型品种 E 优 540
的 P24 带已模糊不清 ; E优 532 的则消失了。同时 ,在 32 ℃高温下 ,中穗型和轻穗型品种的 P23、P24 带均
262 核　农　学　报 19 卷
消失 ,但 P21 和 P22 带则因品种及类型的不同而不同。中穗型的 P21 和 P22 带表达明显减弱 ,但仍清晰
可见 ;而轻穗型品种 E优 540 的 P22 带则消失 ,P21 带模糊不清。高温 38 ℃胁迫下 ,这种差异在中穗型和
轻穗型品种间十分明显。由此可见 ,重穗型、中穗型和轻穗型品种在不同温度条件下 ,其过氧化物酶同
工酶表达都存在十分明显的差异。
图 2 　不同穗重型水稻在不同温度下的 POD ,CAT和 SOD 同工酶表达
Fig. 2 　The isozymes expression POD ,CAT and SOD in the leaves of different panicle
weight types rice under different temperature
a～d 分别为Ⅱ优 162 在 24 ℃、29 ℃、32 ℃、38 ℃的同工酶表达。a1～d1 为冈优 213 在 24 ℃、29 ℃、32 ℃、38 ℃的同工酶表达 ;e～h 为中穗
型品种 D 优 68 在 24 ℃、29 ℃、32 ℃、38 ℃的同工酶表达。i～l 为轻穗型品种 E优 540 在 24 ℃、29 ℃、32 ℃、38 ℃的同工酶表达。m～n 为
轻穗型品种 E优 532 在 24 ℃、29 ℃的同工酶表达) 。
a～d : isozymes expression in the leaves of II2you 162 under temperature treatment 24 ℃, 29 ℃, 32 ℃ and 38 ℃ respectively ; a 1～d1 : isozymes
expression in the leaves of Gang2you 213 under temperature treatment 24 ℃,29 ℃,32 ℃and 38 ℃respectively ; e～h : isozymes expression in the leaves
of D2you 68 under the difference temperature treatment 24 ℃, 29 ℃, 32 ℃and 38 ℃respectively ; i～l : isozymes expression in the leaves of E2you 540
under temperature treatment 24 ℃, 29 ℃, 32 ℃ and 38 ℃ respectively ; m～n : isozymes expression in the leaves of E2you 532 under temperature
treatment 24 ℃and 29 ℃respectively.
21212 　温度对水稻叶片中 CAT同工酶表达的影响 　由图 2 的 CAT电泳图谱可以看出 ,不同穗重型品
种的 CAT在 24 ℃、29 ℃、32 ℃等 3 组温度处理中 ,均有 2 条酶带表达 ,即 C21、C22 ,说明这 2 条酶带可能是
3 类型品种都具有的 ,但随处理温度的升高 ,其同工酶表达受到不同程度的抑制 ,因而其酶带呈现随温
度的升高而减弱的变化趋势。重穗型水稻品种在高温胁迫下 ,C21 带消失 ,但却出现了 1 条新带 C20 ;而
中穗型和轻穗型品种在 C21 带消失后没有出现新带。说明重穗型品种对高温胁迫的同工酶表达应答机
制可能与中穗型和轻穗型品种不同。
21213 　温度对水稻叶片中 SOD 同工酶表达的影响 　由图 2 的 SOD 同工酶电泳图谱可见 ,不同穗重型
品种的 SOD 在 24 ℃、29 ℃、32 ℃等 3 组温度处理中 ,均有 2 条酶带表达即 S21、S22 ,但这 2 条酶带随温度
的升高 ,其表达受到明显的抑制。高温 38 ℃胁迫下 ,重穗型品种仍有 2 条较为模糊的谱带表达 ,但中穗
型和轻穗型品种的却完全消失 ,说明 SOD 同工酶表达在 3 个穗重类型品种间 ,其差异不十分明显。
362　4 期 温度对不同穗重型水稻叶片保护酶活性及同工酶表达的影响
3 　结论与讨论
温度通过影响植株体内叶绿素生物合成的中间产物 52氨基酮戊酸和原卟啉 IX的生物合成 ,从而减
少和降低叶绿素的生成量[12 ] 。同时随着温度的升高 ,植株体内 O22 、H2O2 、OH2等的产生与积累加速 ,导
致植物的活性氧代谢失调[13 ] ,进而引起脂质过氧化、蛋白质结构遭受破坏 ,细胞膜生物活性改变 ,最终
加速植株的衰亡。而在适宜温度下 ,细胞器中产生的活性自由基会受到植株细胞的保护酶调节与控制。
O22 由 SOD 清除 ,H2O2 则由 CAT和抗坏血酸过氧化物酶清除[13 ] 。我们的研究发现 ,不同穗重型水稻叶
片中 ,CAT、SOD 和 POD 的酶活性 ,在 24 ℃(昼 26 ℃Π夜 22 ℃) 至 29 ℃(昼 32 ℃Π夜 26 ℃) 温度范围内 ,其酶
活性都随温度升高而上升。但高温 32 ℃(昼 35 ℃Π夜 29 ℃)下 ,3 种酶的活性则随不同穗重类型而出现明
显的差异。重穗型品种 Ⅱ优 162 的 3 种酶的酶活性保持上升趋势 ;而中穗型品种 D 优 68 和轻穗型品种
E优 540 的则已经逐渐降低了。说明重穗型品种在高温下 ,其抗逆性明显高于中穗型和轻穗型的品种。
从温度对 POD、CAT和 SOD 的同工酶表达影响看 ,重穗型与中穗型和轻穗型的品种除 SOD 的同工
酶表达基本相同外 ,其余两种酶的同工酶表达均存在明显不同。在 24 ℃、29 ℃和 32 ℃3 组温度处理中 ,
不同穗重型品种 CAT同工酶均有 2 条酶带表达 ;但高温 38 ℃胁迫下 ,重穗型品种 Ⅱ优 162 的 C21 带消
失 ,1 条新的同工酶谱带 C20 出现 ;而中穗型和轻穗型品种的消失后无新带出现。说明重穗型品种 Ⅱ优
162 的高温胁迫应答机制可能与中穗型和轻穗型品种的不同。当然 , Ⅱ优 162 在高温胁迫下出现的 C2
0 ,是否是所有重穗型品种都具有的 ,还有待于进一步探讨。从 POD 同工酶表达看 ,不同穗重类型的品
种其同工酶表达明显不同。重穗型品种比中穗型和轻穗型的品种都少酶带 P23 ,说明重穗型品种的 POD
同工酶表达与后两类型的明显不同 ;从中穗型和轻穗型品种的 POD 同工酶表达看 ,29 ℃和 32 ℃两组温
度对轻穗型品种的同工酶表达影响程度明显高于中穗型品种 ,其酶带比中穗型的明显减弱 ;在轻穗型品
种 E优 540 和 E优 532 之间 ,同工酶表达也有差异。说明 POD 同工酶表达 ,既存在穗重类型间的表达差
异 ,也存在同一类型的品种间的表达差异性。但类型间的差异明显大于同一类型不同品种间的差异性。
由此可以认为 :重穗型水稻品种与中穗型和轻穗型的相比 ,其高温应答机制可能不同。这是重穗型
品种之所以在高光强、高温和低 CO2 浓度下都能显示其高的净光合速率 ,和较强抗逆性的生理及代谢
特性的重要基础。
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