全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 022160205
根癌农杆菌介导的山定子遗传转化的研究
马志梅　王　忆　许雪峰　孔　瑾　韩振海
(中国农业大学果树逆境生理与分子生物学实验室 ,北京　100094)
摘 　要 :以山定子叶片作为根癌农杆菌介导转化的受体 ,通过比较在卡那霉素筛选培养基上的抗性芽百
分率 ,研究激素配比、乙酰丁香酮、脯氨酸、共培养时间、预培养时间、侵染时间对转化的影响。结果表
明 :预培养不利于山定子转化 ;菌液中添加乙酰丁香酮和脯氨酸对转化无明显影响 ;侵染 10min ,共培养
3d 抗性芽百分率最高 ;转化后叶片再生培养基的最佳激素配比为 NAA 110mgΠL + BA 2mgΠL + TDZ 4mgΠ
L。抗性植株经 PCR 检测 ,初步证明外源目的基因已整合到山定子基因组中。
关键词 :山定子 ;叶片 ;遗传转化 ;影响因素
RESEARCH OF Agrobacterium tumefaciens MEDIATED GENETIC
TRANSFORMATION OF Malus baccata BORKH
MA Zhi2mei 　WANG Yi 　XU Xue2feng 　KONGJin 　HAN Zhen2hai
( Laboratory of Fruit Tree Stress Physiology and Biology , China Agricultural University , Beijing 　100094)
Abstract :Several factors , such as hormone combination , Acetosyringone (AS) , Proline ( Pro) , co2culture time , pre2culture
time and infection time , which affect Agrobacterium tumef aciens mediated gene transformation of Malus baccata Borkh , were
studied by comparing rate of the kanamycin resistant shoot . The results showed that pre2culture of the leaves was not beneficial
to transformation. There was no evident to improve transformation by adding AS and Pro into bacterial suspension. The highest
rate of the resistant shoot was obtained under the condition of infection for 10 min and co2culture for 3d. The optimal hormone
combination of leaf regeneration medium after transformation was NAA 110mgΠL + BA 2 mgΠL + TDZ 4 mgΠL. The PCR
analysis showed that the target gene was integrated into the genome of Malus baccata Borkh.
Key words : Malus baccata Borkh ; leaf ; genetic transformation ; affecting factor
收稿日期 :2007204228 　接受日期 :2007206201
基金项目 :国家 863 项目 (2006AA10Z1B6) ,国家自然科学基金 (30671441) ,北京市重点实验室
作者简介 :马志梅 (19812) ,女 ,山东青岛人 ,硕士 ,从事果树基因工程研究。Tel :010262731118 ; E2mail :mazhimei @cau. edu. cn
通讯作者 :韩振海 (19632) ,男 ,陕西人 ,教授 ,从事果树逆境生理与分子生物学研究。Tel :010262732467　　自 1986 年 James 等[1 ] 首次获得苹果 ( Malus pumilaMill)转基因植株以来 ,苹果遗传转化的研究发展极为迅速 ,1992 年 ,程家胜[2 ] 首次在国内报道获得转基因苹果试管苗。随后几年 ,用于苹果遗传转化研究的基因型越来越多 ,主要有绿袖、Elstar、嘎拉、富士、乔纳金、王林、皇家嘎拉、红富士、辽伏、元帅、粉红佳人、八楞海棠、M7、M9 等[2～13 ] , 最重要的遗传转化方法是根癌农杆菌介导法[14 ] ,其操作简单、成本低、可导入较大的DNA 片段。外植体通常使用试管苗幼嫩叶片或　　　 茎段 ,因这两部分取材简便 ,易于离体再生。山定子 ( Malus baccata Borkh)是一种重要的苹果砧木 ,在我国华北和东北地区广为分布 ,具有抗寒性强、根系发达等优良性状 ,但在缺铁胁迫下极易黄化[15 ] ,以山定子为砧木的苹果患黄叶病现象也较为普遍 ,因此通过基因工程改良山定子性状显得十分重要。本文通过研究农杆菌介导的叶盘法转化山定子过程中的相关因素 ,建立了山定子遗传转化体系 ,为改良山定子性状奠定基础。
061　 核 农 学 报　2008 ,22 (2) :160～164Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料和方法
111 　材料
11111 　植物材料　山定子 ( Malus baccata Borkh) ,来源
于本实验室保存的无菌试管苗。
11112 　农杆菌和质粒　转化时所用质粒为 pBI121 ,含
抗卡那霉素 ( Kanamycin , Kan) 的新霉素磷酸转移酶基
因 ( npt Ⅱ)及 Fe ( Ⅱ) - 转运蛋白基因 ( MxIrt1) ,供试质
粒采用电转法[16 ] 转入根癌农杆菌 ( Agrobacterium
tumef aciens) EHA105 中。
112 　方法
11211 　叶片处理 　从苗龄 30d 左右的试管苗上取顶
端刚展开的幼嫩叶片 ,垂直主脉横切三刀 ,不伤及叶
缘。
11212 　农杆菌的培养和活化 　挑取包含 pBI121 质粒
的农杆菌 EHA105 单菌落 ,接种到含 Kan 50mgΠL ,利福
平 ( Rifampicin , Rif ) 100 mgΠL 的 3ml YEB 液体培养基
中 ,150rΠmin 28 ℃振荡培养 24h 后 ,取菌液 100μl 再接
种到 40ml YEB 液体培养基中 ,相同条件下培养 12h ,收
集菌液 ,5000rpm 4 ℃离心 5min ,弃上清液 ,菌体用等体
积液体 MS 培养基悬浮 ,150rΠmin 28 ℃继续振荡培养
4h 至对数生长期。
11213 　农杆菌介导转化的影响因素试验　培养基激
素组合 :将处理后叶片在 OD600 = 016～018 的农杆菌悬
浮液中浸泡 10min 后取出 ,用经过高压灭菌的滤纸吸
干叶片表面菌液 ,放入附加不同浓度 NAA (011、015、
110 mgΠL) 、62BA(2、4、8 mgΠL) 、TDZ(0、2、4 mgΠL) 3 种
激素的 MS 液体培养基中暗处共培养 ,共培养结束后
转入与共培养培养基激素含量相同 ,并附加 Kan 30mgΠ
L ,头孢霉素 (Cefotaxime ,Cef) 250 mgΠL 的 MS 固体筛选
培养基中筛选培养 ,从共培养起 ,先暗培养 3 周 ,之后
置于光下培养 ,第 45 天统计抗性芽百分率。每种激素
设 3 个水平 ,通过 L9 (34 ) 正交试验确定诱导抗性芽产
生的最佳激素组合。
表 1 　正交试验 L9 ( 34 )表头设计
Table 1 　Design form of Orthogonal Test L9 (34 )
水 平
level
因素 factor
NAA
mgΠL BAmgΠL TDZmgΠL 空白列blank row
1 011 2 0 -
2 015 4 2 -
3 110 8 4 -
　　预培养时间 :经处理的叶片放到芽诱导培养基上
分别预培养 0、2 和 4d 后按上述转化过程进行转化并
培养叶片。
乙酰丁香酮和脯氨酸 :向 MS 液体培养基悬浮菌
液中分别加入乙酰丁香酮 (Acetosyringone ,AS) 和脯氨
酸 ( Proline , Pro) , 使其终浓度分别达到 100μmolΠL 和
100mmolΠL ,或者只添加其中一种 ,终浓度同上 ,以不添
加两种物质的悬浮菌液为对照 ,所有悬浮液 150rΠmin
28 ℃振荡培养 4h ,至对数生长期。
侵染时间 :将叶片放入 OD600 = 016～018 的农杆菌
菌液中分别侵染 5、10、15、20 和 30min ,吸干菌液 ,接种
到共培养基上进行共培养。
共培养时间 :侵染后的叶片在共培养基上分别培
养 1、3、5 和 7d 后转入诱导抗性芽的筛选培养基上筛
选培养。
上述试验因素每处理均设 3 次重复 ,每个重复不
少于 30 片叶片 ,第 45 天统计抗性芽百分率。
113 　PCR 检测
取山定子抗性植株嫩叶 ,用 SDS 法[15 ] 小量提取其
基因组 DNA ,并以此为待测样品 ,以质粒 DNA 作为阳
性对照 ,未经转化的山定子组培苗基因组 DNA 为阴性
对照 ,引物设计为 :上游以 35S 启动子的一段序列为模
板设计引物 ;下游以 MxIrt1 基因的一段序列为模板设
计引物进行 PCR 扩增 ,扩增片段约为 1000bp。PCR 扩
增条件 : 95 ℃预变性 5min ; 94 ℃变性 1min , 55 ℃退火
1min ,72 ℃延伸 1min ,30～35 个循环 ;最后 72 ℃延伸
10min。35S 引物序列 : CCC ACA GAT GGT TAG AGA
GGC ; MxIRT1 中间引物 :AAC GAG TTA CAA GAG GGA
AGC。
2 　结果与分析
211 　培养基激素组合对转化率的影响
用 SPSS 1110 统计软件对试验结果进行方差分
析 ,结果表明 (表 2) ,NAA、BA、TDZ 3 种激素对抗性芽
诱导的影响差异均不显著 ,根据表观分析中各因素水
平均值 ( …Ki )的大小 (表 3) ,得到最优激素水平组合为 :
NAA 110mgΠL + BA 2mgΠL + TDZ 4mgΠL ,以下影响因素
试验中 ,山定子叶片再生培养基均采用此激素组合。
212 　预培养时间对转化率的影响
将切割处理的叶片置于附加 NAA 110mgΠL + BA
2mgΠL + TDZ 4mgΠL 的 MS 液体培养基中进行 0、2、4d
的预培养 ,然后将叶片置菌液中侵染 ,发现预培养 2d
的叶片平均出芽率由对照的 29114 %显著下降至
5141 %(表 4) 。预培养 4d 的叶片 ,伤口处细胞褐化死
161　2 期 根癌农杆菌介导的山定子遗传转化的研究
亡 ,几乎无抗性芽产生 ,可见预培养不利于山定子的转
化。
表 2 　激素对转化效率影响的正交试验方差分析
Table 2 　Variance analysis of Orthogonal Test on the
influence of hormone on transformation efficiency
变异来源
source of variation
SS df MS F F0105 (2 ,2)
NAA 01025 2 01013 01012 < 1 191000
BA 01118 2 01059 01057 < 1 191000
TDZ 01235 2 01118 01114 < 1 191000
误差 error 2107 2 11035
总变异 total variation 21448 8
表 3 　激素对转化效率影响的正交试验表观分析
Table 3 　Audio2visual analysis of Orthogonal Test on
the influence of hormone on transformation efficiency
试验号
number of test
NAA (mgΠL) BA (mgΠL) TDZ (mgΠL) 出芽率rate of
shoot ( %)
1 011 2 0 0100
2 011 4 2 25146
3 011 8 4 19109
4 015 2 2 42121
5 015 4 4 30156
6 015 8 0 3133
7 110 2 4 71111
8 110 4 0 0100
9 110 8 2 9109…K1 01149 01378 01011 —…K2 01254 01187 01256 —…K3 01267 01105 01403 —
R 01118 01273 01392 —
注 : …Ki 表示每个因素的平均值 ; R 表示平均值中最大值和最小值的差 ,
即极差。
Note : …Ki reprensents the average of each factor ; R represents the average max ,
minus the min.
表 4 　预培养时间对转化效率的影响
Table 4 　Effect of pre2culture time on
transformation efficiency
预培养时间
pre2culture
time (d)
抗性芽出芽率
rate of kanamycin resistant shoot ( %)
重复Ⅰ
repeat Ⅰ
重复Ⅱ
repeat Ⅱ
重复Ⅲ
repeat Ⅲ
平均出芽率
average
shoot rate ( %)
0 38146 18118 30177 29114a
2 0100 7114 9109 5141b
4 7169 0100 0100 2156b
注 :数据进行单因素方差分析 ,小写字母表示 5 %差异水平。下同。
Note : small letter represents 5 % significant level by one2way ANOVA. The same
as following tables.
213 　AS 和 Pro 对转化率的影响
许多报道认为 ,AS 可以诱导根癌农杆菌 vir 区基
因的表达从而促进 T2DNA 的转移[17～19 ] ,Pro 是一种渗
透保护剂 ,能够提高农杆菌的毒性[20～23 ] 。本试验中 ,
菌液用 MS 培养基悬浮 ,悬浮液中添加 AS 和 Pro 或只
加其中 1 种 ,或都不加 ,4 种情况得到的抗性芽出芽率
无显著差异 (表 5) ,说明在菌液中添加 AS 和 Pro 对农
杆菌介导的山定子转化无明显影响。
表 5 　乙酰丁香酮和脯氨酸对转化效率的影响
Table 5 　Effect of acetosyringone and proline
on transformation efficiency
组合
combination
抗性芽出芽率
rate of kanamycin resistant shoot ( %)
重复Ⅰ
repeat Ⅰ
重复Ⅱ
repeat Ⅱ
重复Ⅲ
repeat Ⅲ
平均出芽率
average
shoot rate
( %)
AS 0μmolΠL
Pro 0mmolΠL 80100 46115 50100 58172a
AS 0μmolΠL
Pro 100mmolΠL 66167 55156 22122 48115a
AS 100μmolΠL
Pro 0mmolΠL 23108 50100 100100 57169a
AS 100μmolΠL
Pro 100mmolΠL 66167 50100 66167 61111a
214 　侵染时间对转化率的影响
由表 6 可知 ,叶片侵染 5min ,抗性芽出芽率可达
43108 % ;侵染 10min 或 15min ,抗性芽出芽率相应增
加 ,分别达 57114 % 和 59189 % ; 侵染时间延长至
20min ,抗性芽出芽率下降到 2713 % ;侵染 30min 叶片
伤口细胞大量褐化死亡 ,出芽率下降到 13189 %。因
此确定山定子遗传转化过程中 ,以 10 或 15min 为最适
侵染时间。
表 6 　侵染时间对转化效率的影响
Table 6 　Effect of infection time on
transformation efficiency
侵染时间
infection
time (min)
抗性芽出芽率
rate of kanamycin resistant shoot ( %)
重复Ⅰ
repeat Ⅰ
重复Ⅱ
repeat Ⅱ
重复Ⅲ
repeat Ⅲ
平均出芽率
average
shoot rate
( %)
5 30177 38146 60100 43108ab
10 46115 53185 71143 57114a
15 53185 64129 61154 59189a
20 33133 28157 20100 27130ab
30 8133 20100 13133 13189b
215 　共培养时间对转化率的影响
抗性芽出芽率随共培养时间的延长呈先提高后降
低趋势 (表 7) ,共培养 3d 时出芽率最高 ,达 67102 % ;
共培养 5d 时 ,出芽率显著下降到 43164 % ,同时叶片受
农杆菌毒害严重 ,伤口褐化 ;共培养 7d 的叶片伤口褐
化加剧 ,且在筛选培养过程中农杆菌易过度生长 ,难以
261 核　农　学　报 22 卷
抑制 ,抗性芽出芽率也下降至 25145 %。
216 　抗性植株 PCR 检测
对抗性植株进行 PCR 检测 , 目标扩增产物为约
1000bp 的包含 35S 启动子序列和 Mxirt1 基因的中间序
列片段 ,以未经转化的植株作为阴性对照 ,质粒为阳性
对照 ,有 7 株转化植株经 PCR 扩增得到和阳性对照大
小一致的条带 (图 1) ,初步证明外源目的基因已整合
到山定子基因组中。
表 7 　共培养时间对转化效率的影响
Table 7 　Effect of co2culture time on
transformation efficiency
共培养时间
Co2culture
time (d)
抗性芽率
rate of kanamycin resistant shoot ( %)
重复Ⅰ
repeat Ⅰ
重复Ⅱ
repeat Ⅱ
重复Ⅲ
repeat Ⅲ
平均出芽率
average
shoot rate
( %)
1 40100 36136 27127 34155b
3 70100 72173 58133 67102a
5 40100 36136 54155 43164b
7 40100 18118 18118 25145b
图 1 　山定子转化植株的 PCR 检测结果
Fig. 1 　The PCR result of transformed plants of Malus baccata Borkh
1 :标记物 ; 2 :质粒 ; 3 :阴性对照 ; 4～12 :转化植株
1 : marker ; 2 : plasmid ; 3 : negative control ; 4～12 : transformed plants
图 2 　山定子转基因植株
Fig. 2 　Transgenic plant of Malus baccata Borkh
3 　讨论
遗传转化体系的建立是基因转化获得新种质的基
础 ,目前报道的苹果基因转化主要采用根癌农杆菌介
导 ,转化效率很低 ,一般在 1 %以下[3 ,4 ] ,主要原因在于
未找到相应转化材料的最适转化条件。
农杆菌介导的遗传转化有两个关键过程 :受体材
料的侵染及转化材料的再生[3 ] 。本文研究了影响这两
个过程的多种因素 ,得出各因素的最佳处理条件。笔
者在转化试验前摸索山定子叶片再生条件 ,发现适合
叶片再生的激素配比为 NAA 015mgΠL + BA 2mgΠL +
TDZ 2mgΠL ,这与通过正交试验得到的转化条件下诱导
抗性芽的最佳激素配比 NAA 110mgΠL + BA 2mgΠL +
TDZ 4mgΠL 不完全一致 ,原因可能是农杆菌的 T2DNA
中携带有控制植物激素合成的功能基因[14 ,18 ] ,会导致
转化细胞内生长素和细胞分裂素含量过高 ,从而影响
转化材料的分化特性 ,因此 ,适合未转化叶片再生的激
素配比未必是转化后抗性芽再生的最佳激素配比。
苹果遗传转化研究中 ,常用 AS 作为有效的 vir 区
基因活化诱导物质 ,有报道认为 ,添加 AS 同时加入渗
透调节剂 Pro ,对 vir 区基因活化有协同作用[19～22 ] 。本
试验结果表明 ,菌液中添加 AS 和 Pro 对抗性愈伤和抗
性芽的发生率几乎没有影响 ,产生这种结果的原因可
能是农杆菌 EHA105 属于强致病性菌株[3 ,20 ] ,其细胞中
virG基因表达水平本身比较高 ,所以加入 virG 基因诱
导因子并不一定能提高基因表达水平 ;或者是 virG 基
因表达水平提高了 ,但介导基因转移的能力却未能提
高。
侵染时间和共培养时间对转化效率有很大影
响[3 ,21 ,24 ] ,不同转化材料所需的最佳时间不同。侵染和
共培养时间过短 ,叶片接种菌量小 ,或接种后农杆菌尚
未附着 ,T2DNA 不能充分转移整合 ;时间过长 ,植物细
胞易受毒害 ,农杆菌容易过度生长 ,后继培养时难以除
菌。本试验确定侵染 10 或 15min ,共培养 3d ,抗性芽
361　2 期 根癌农杆菌介导的山定子遗传转化的研究
百分率最高 ,与苹果遗传转化上的报道相同[14 ,24 ] 。
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