全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 032237205
榨菜继代培养愈伤组织及其再生植株的变异性分析
徐春霞1 　葛亚明1 ,2 　朱雪云1 　陈利萍1
(11 浙江大学农业与生物技术学院园艺系 ,浙江 杭州　310029 ;21 宁波农业科学院蔬菜所 ,浙江 宁波　315040)
摘 　要 :通过分子标记对榨菜愈伤组织及其再生植株的变异性进行了分析。RAPD 检测表明 :经 2、3 和 5
次继代培养的愈伤组织以及经 2 次继代培养愈伤组织的再生植株的分子标记呈现多态性 ,变异频率分
别为 2104 %、1185 %、1179 %和 1156 % ;流式细胞仪 (FCM)分析表明 ,继代培养后的愈伤组织及其再生植
株在染色体倍性上与亲本相比没有发生变化 ,皆为二倍体 (2n = 36) 。另经 2、3 和 5 继代培养只有 2 次
继代培养的愈伤组织分化出了再生植株 ,且有 3133 %的植株与其亲本间存在表型差异。
关键词 :继代愈伤组织 ;再生植株 ;RAPD ;FCM
ANALYSIS OF VARIATION IN SUBCULTURED CALLUS AND ITS REGENERANT
OF TUBER MUSTARD ( Brassica juncea)
XU Chun2xia1 　GE Ya2ming1 ,2 　ZHU Xue2yun1 　CHEN Li2ping1
(11 Department of Horticulture , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029 ;
21 Institute of Vegetable , Ningbo Academy of Agricultural Sciences , Ningbo , Zhejiang 　315040)
Abstract :The variations of subcultured calluses and subsequent regenerants were investigated by DNA molecular marker. The
second , third and fifth generations of subcultured calluses and the second generation subcultured callus regenerated showed
DNA polymorphism when examined by random amplified polymorphic DNA ( RAPD) analysis. The variant frequencies were
2104 % , 1185 % , 1179 % and 1156 % , respectively. When calluses and subsequent regenerants were subjected to flow
cytometry (FCM) analysis , the normal diploid chromosome number (2n = 36) was detected. Regenerants could be produced
from the second subcultured calluses in this research. Among these regenerants , 3133 % plants presented morphological
differences compared with the mother plants.
Key words :subcultured callus ;regenerant ;RAPD ;FCM
收稿日期 :2006206212
基金项目 :国家自然科学基金 (30370903)
作者简介 :徐春霞 (19792) ,女 ,浙江临安人 ,硕士研究生 ,从事蔬菜遗传育种研究。
通讯简介 :陈利萍 (19662) ,女 ,浙江桐乡人 ,教授 ,从事蔬菜遗传育种研究 ,E2mail : chenliping @zju. edu. cn　　由组织培养引起再生植株发生的变异称为体细胞无性系变异[1 ] 。体细胞无性系变异 ,尤其是可遗传变异 ,具有双重性质。一方面人们可以利用其变异所产生的大量有益变异为育种服务[2 ] ;但另一方面其变异方向的不确定性又为优良性状的保持带来了极大的困难[3 ] 。因此 ,在育种过程中对再生植株遗传稳定性的检测就显得尤为重要。榨菜 ( Brasscia juncea)作为一种重要的鲜食和腌制蔬菜 ,在中国中部地区及东南亚许多国家的百姓生活中发挥着重要作用。近年来榨菜病毒病和空心病的危 害越来越严重 ,已严重威胁生产 ,因此利用现代生物技术进行榨菜种质创新和品种改良已成为当务之急。目前有关榨菜离体培养再生体系已被成功建立[4 ,5 ] ,人们可以通过这些体系获得遗传变异植株或者建立遗传转化体系。只是这些体系都需要经过愈伤组织诱导分化再生植株的过程 ,而这可能会引起体细胞无性系变异[6 ] ,影响研究的最终结果。因此有必要对榨菜愈伤组织及其再生植株的遗传稳定性进行分析、检测。许多形态学、生物化学和分子标记等方法已被应用到再生植株的遗传稳定性分析上[7 ] 。其中分子标记
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以其快速、高效、精确等优点成为分析组织培养再生植
株遗传稳定性的有力工具 ,而在众多分子标记中又以
RAPD 技术应用最为广泛。一些学者认为利用 RAPD
技术分析某些再生植株的遗传稳定性具有高效、可靠
等优点。
本研究利用 RAPD 技术对榨菜继代培养的愈伤组
织及其再生植株的遗传变异性进行了分析 ,并对不同
继代次数的愈伤组织的变异频率进行了比较 ,并对继
代培养的愈伤组织及其再生植株的染色体数目进行了
检测、分析。
1 　材料与方法
111 　植物材料
以本实验室培育的榨菜细胞质雄性不育系
( Brasscia juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee)为试验材
料。挑选籽粒饱满的种子 ,用自来水反复冲洗后 ,再用
75 %酒精消毒 1min ,蒸馏水冲洗 3 次 ,而后在 5 %
NaClO 水溶液 (加洗洁精 1～2 滴) 中搅拌灭菌 15 min ,
无菌水冲洗 4～5 次 ,在超净工作台内用滤纸吸干种子
表面水分 ,播于 1Π2 MS[8 ] (仅大量元素减半) + 1mgΠL 6
- BA + 310 %蔗糖 + 018 %琼脂粉的培养基 (本文所有
培养基采用 MS 基本培养基 ,并加 310 %蔗糖和 018 %
琼脂粉 ,配好后调 pH到 518 ,而后在 121 ℃灭菌 20min)
中。暗处发芽 24h 后 ,每天连续 16h 光照条件下培养。
112 　愈伤组织的诱导、继代和分化培养
取 8d 苗龄的榨菜幼苗子叶 ,置于培养基 (MS +
0125mgΠL NAA + 0125mgΠL 2 ,4 - D + 015mgΠL BA) 上诱
导愈伤组织的形成。愈伤组织每 3 周继代 1 次 ,继代
培养基与愈伤组织诱导培养基相同。24 ℃暗培养。将
经过不同继代次数的愈伤组织转移到培养基 (MS +
110mgΠL BA + 012mgΠL NAA) 进行分化培养 ,观察愈伤
组织经不同次数继代后对不定芽分化的影响。将不定
芽转移到生根培养基 (1Π2MS + 011mgΠL NAA)上获得再
生植株。
113 　RAPD 分析
用改良的 CTAB 法提取榨菜愈伤组织、再生植株
和对照植株的总基因组 DNA。PCR 扩增反应体系为
25μl ,各组分如下 : ddH2O 1915μl ,10 ×PCR Buffer (含
20mmolΠL Mg2 + ,北京鼎国生物技术有限公司) 215μl ,
dNTP mix (上海生物工程技术服务有限公司) 015μl ,随
机引物 (上海生物工程技术服务有限公司) 110μl , Taq
酶 (北京鼎国生物技术有限公司) 015μl , DNA 模板
110μl。PCR 反应条件 :94 ℃预变性 5 min , 94 ℃变性
30s ,35 ℃退火 30s ,72 ℃延伸 1min ,35 个循环后 72 ℃延
伸 10min。RAPD 反应在 Thermal Cycler PCR 仪上进行。
扩增产物用 110 %琼脂糖凝胶电泳 ,电场强度 15VΠcm ,
再经溴化乙锭染色后用 Tanon Gis22008 凝胶电泳成像
系统进行检测拍照。反应引物采用 10 个随机核苷酸
序列 ,每个愈伤组织及再生植株保证有 10 个以上的随
机引物检测。取大小在 5000bp 到 500bp ,且重复性和
稳定性好的清晰条带作为愈伤组织和再生植株遗传稳
定性 RAPD 分析的结果。
114 　流式细胞仪( FCM)分析
随机选取由榨菜细胞质雄性不育系的子叶块诱导
继代培养 45d 的愈伤组织 (每 3 周继代 1 次) 14 块 ,并
用由种子发芽获得的无菌苗真叶作为对照 ,进行分析。
根据 Otto 和 Dolezel [9 ,10 ] 的方法作部分改进 ,测定
榨菜及其愈伤组织染色体 DNA 含量。具体操作步骤
如下 :取约 50mg 继代 2 次的愈伤组织材料于塑料培养
皿中 ,加入 100μl Otto Ⅰ缓冲液 ,用刀片将愈伤组织充
分切碎 ,再加入 900μl 缓冲液 ;将含有切碎愈伤组织的
缓冲液用 42μm 的尼龙网过滤到 115ml 的离心管中 ;
4 ℃,2000rpm 离心 5min ;保留沉淀及约 100μl 的上清
液 ,混匀 ,再加入 100μl Otto Ⅰ缓冲液 ;室温放置 10min ,
期间不时地将溶液颠倒 2～3 次 ;加入 015ml Otto Ⅱ缓
冲液和 200μl PI染色液 ,混匀 ,避光静置 ,待测 ;用流式
细胞仪 ( Flow Cytometry , FCM) ( FACSCalibur , Becton
Dickinson ,美国)对样品进行分析 ,用 CellQuest Pro 软件
搜集数据 ,保证每个样品搜集到 8000～10000 个细胞
核 ,以 ModiFit LT(由 Verity Software House 公司生产) 软
件分析所搜集的数据。调整流式细胞仪的电压 ,使榨
菜染色体 DNA 含量在横坐标上的位置定为 50 ( G1
期) ,固定电压 ,并以此作为外参 ,测定榨菜愈伤组织染
色体 DNA 相对含量 ,分别以榨菜及其愈伤组织染色体
的 DNA 相对含量为横坐标 ,细胞数目为纵坐标作图 ,
比较两者之间的异同。
2 　结果与分析
先期研究表明 :MS + 0125mgΠL NAA + 0125mgΠL 2 ,
4 - D + 015mgΠL BA 培养基有利于榨菜愈伤组织的诱
导和继代 ,MS + 110mgΠL BA + 012mgΠL NAA 培养基可
分化出不定芽[5 ] 。在本试验中 ,经 2 次继代的愈伤组
织经过 8d 培养后出现绿点 ,30d 左右分化出不定芽。
而经 3 次和 5 次继代的愈伤组织经过分化培养后逐渐
变硬 ,最后褐化死亡 ,没有分化出再生植株。为了探明
愈伤组织在继代和再生过程中的遗传稳定性情况 ,本
832 核　农　学　报 21 卷
文对经过第 2、3、5 次继代的愈伤组织以及 2 次继代的
愈伤组织再生植株进行了分子与细胞学分析。
211 　愈伤组织、再生植株与亲本的 RAPD 差异
在 50 对随机引物中 ,经过多次筛选 ,有 14 对 (表
1)重复性和稳定性较好 ,被用于检测榨菜愈伤组织及
再生植株的遗传稳定性。愈伤组织经过两次继代培养
后 ,随即选取 14 块进行 RAPD 分析。结果总共获得
539 条带 ,其中 11 条带显示出变异性 :7 条在一些 2 次
继代的愈伤组织中出现 ,而在对照中没有 ;4 条在 2 次
继代愈伤组织中缺失 ,而在对照中存在 (箭头表示变异
条带) 。分子标记的多态性频率为 2104 % (表 2) 。以
S27 作为随机引物时 ,榨菜对照植株和愈伤组织 RAPD
分析呈现较好的多态性 (图 1) 。
表 1 　RAPD 分析中筛选的引物及碱基序列
Table 1 　List of 102mer primers used in the present
study and their base sequence
引物
primer
序列
sequence
引物
primer
序列
sequence
S21 CAGGCCCTTC S62 GTGAGGCGTC
S22 TGCCGAGCTG S68 TGGACCGGTG
S24 AATCGGGCTG S69 CTCACCGTCC
S27 GAAACGGGTG S72 TGTCATCCCC
S33 CAGCACCCAC S75 GACGGATCAG
S34 TCTGTGCTGG S112 ACGCGCATGT
S39 CAAACGTCGG S514 CAGGATTCCC
表 2 　经 2 次继代榨菜愈伤组织的 RAPD 分析结果统计
Table 2 　Summary of the statistics of RAPD analysis of 14
pieces of the second subcultured calluses of tuber mustard
引物
primers
总条带数
total bands scored
变异条带数
variant bands
变异频率
frequency of variation ( %)
S22 91 0 0
S24 63 0 0
S27 81 8 9188
S33 52 0 0
S34 39 0 0
S39 39 0 0
S62 40 2 5100
S75 39 0 0
S112 42 0 0
S514 103 1 0197
总数 (total) 539 11 2104
　　经 3 次和 5 次继代的愈伤组织的 RAPD 分析表
明 ,它们的变异频率分别为 1185 %和 1179 %。关于愈
伤组织的变异频率会不会随继代次数的延长而升高 ,还
需进一步研究。将愈伤组织转移到分化培养基上 ,只有
经 2 次继代的愈伤组织分化出了再生植株 ,而经 3 次和
5 次继代的愈伤组织都没有分化出再生植株。
随即选取 13 株再生植株进行 RAPD 分析 ,总共获
得 513 条带 ,包括 8 条变异带 , 变异频率为 1156 %(表
图 1 　经 2 次继代愈伤组织的 RAPD 分析图谱
(以 S27 为引物)
Fig. 1 　RAPD pattern of the second subcultured
calluses by primer S27
M:1kb marker ;1 :母本植株 ;2～14 :继代 2 次的愈伤组织
M: marker DNA ; 1 : control ; 2～14 : second subcultured calluses
3 ,图 2) 。其中 1 条在再生植株存在 ,而在对照中却没
有 ;7 条在再生植株中缺失 ,而在对照中存在 (箭头表
示变异条带) 。
表 3 　榨菜再生植株的 RAPD 分析结果统计
Table 3 　Summary of the statistics of RAPD analysis of
13 regenerants of tuber mustard
引物
primers
总条带数
total bands
scored
变异条带数
variant bands
among regenerants
变异频率
frequency of
variation ( %)
S21 48 0 0
S24 69 0 0
S27 68 4 5188
S33 48 0 0
S39 38 2 5126
S68 36 0 0
S69 26 0 0
S72 36 0 0
S75 72 0 0
S112 72 2 1139
总数 (overall totals) 513 8 1156
图 2 　经 2 次继代愈伤组织再生植株的 RAPD 分析图谱
(以 S112 为引物)
Fig. 2 　RAPD pattern of the second subcultured callus
regenerated plants by primer S112
M:1kb marker ;1 :母本植株 ;2～13 :再生植株
M: marker DNA ; 1 : control ; 2～13 : callus regenerated plants
932　3 期 榨菜继代培养愈伤组织及其再生植株的变异性分析
图 3 　榨菜愈伤组织再生植株及对照
Fig. 3 　Plants derived from calluses of tuber mustard
a , b : 再生植株 ;c : 对照
a , b : plant regenerants form calluses ; c : control
　　一些植株转移到营养钵后 ,无论是与对照相比 ,还
是不同的再生植株间相比 ,彼此间表型差异十分明显
(图 3) ,变异频率为 2103 %。其中以叶型的变化最为
明显 :一些再生植株的叶片叶缘为全缘 (图 3a) ;一些
叶片叶缘为浅裂 (如图 3b) ;而对照叶片叶缘则为锯齿
状深裂 (图 3c) 。这种表型差异不随植株的生长发育
而消失。
212 　愈伤组织与对照细胞染色体数目和 DNA 相对含
量差异
据报道 ,愈伤组织及再生植株在细胞水平上的变
异频率要比分子水平高[11 ,12 ] 。本试验利用流式细胞仪
(Flow Cytometry , FCM) 对榨菜愈伤组织及其再生植株
细胞的染色体数目和 DNA 相对含量进行分析。如图
4 ,图中横坐标表示细胞核内 DNA 相对含量 ,纵坐标表
示处于相应 DNA 相对含量的细胞核数目 ,另外由于处
于 G2 期的细胞的染色体数目是 G1 期的两倍 ,因此 G2
期细胞的 DNA 相对含量是 G1 期的两倍。由图可见 ,
愈伤组织和对照中绝大多数细胞处于 G1 期 (DNA 相
对含量 = 50) 。但榨菜愈伤组织中处于 G2 期 (DNA 相
对含量 = 100)的细胞数目与 G1 期的细胞数目比例要
高于对照植株 (图 4) ,愈伤组织中 G2∶G1 = 120∶840 大
于对照植株中 G2∶G1 = 40∶1250 ,这可能与愈伤组织旺
盛的分裂能力有关。在随机选取的 13 块榨菜愈伤组
织及其再生植株中没有多倍体或是非整倍体存在。总
体来讲 ,榨菜愈伤组织和对照植株之间的 DNA 相对含
量没有明显差异。
3 　讨论
多数学者认为植物再生植株是否发生变异主要与
再生模式 (包括体细胞胚胎发生、器官形态发生、顶芽
扩繁)有关 ,同时还受外植体基因型影响。而 Bennici
图 4 　榨菜愈伤组织 (B)及对照 (A)的 FCM分析图
Fig. 4 　FCM histograms of the control (A) and callus
of tuber mustard (B)
等[13 ]则发现再生植株的遗传稳定性不受再生模式的
影响。Devarumath 等[7 ]认为茶树无性系的基因组变化
主要依赖于外植体的基因型 ,而与培养条件无关。在
本研究中 ,RAPD 检测结果表明榨菜再生植株在愈伤
组织分化阶段确实存在遗传变异 ,且愈伤组织及其再
生植株既存在 RAPD 多态性又具有明显的表型差异。
另外 ,甜菜[14 ] 、大蒜[11 ] 等作物的愈伤组织及其再生植
042 核　农　学　报 21 卷
株也存在 RAPD 多态性。但 Rus2Kortekaas 等[15 ]却没有
检测到表型差异明显的番茄再生植株后代及其亲本愈
伤组织的多态性。
愈伤组织及其再生植株的染色体组可能会在离体
培养过程中发生变异。FCM 作为一种简便易行的检
测手段 ,常被用于检测某些物种染色体数目的变异。
本研究中 FCM 检测没有发现榨菜愈伤组织及其再生
植株的染色体数目发生变异 ,也没有发现它们细胞水
平变异与分子水平变异之间存在什么关系。
由于再生植株的遗传变异机理相当复杂 ,常需要
经多种途径加以分析验证 ,因此对本研究所获得变异
体还需进行种子繁殖 ,进而对其后代进行遗传分析 ,以
期为榨菜遗传改良提供可靠的理论基础及技术支撑。
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(上接第 211 页)
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