全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 032191205
玉米自交系及 F2 分离群体花药培养中的
过氧化物同工酶分析
齐延芳1 　杨景成2 　周柱华2 　邢燕菊1
徐立华1 　许方佐1 　邱登林1
(11 山东省农业科学院原子能农业应用研究所 ,山东 济南　250100 ;
21 中国科学院植物研究所植被数量生态学开放研究实验室 ,北京　100093)
摘　要 :利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了两个花粉诱导率不同的自交系 (A3 和 A46)
及其杂种 F2 代分离群体在花药培养过程中过氧化物同工酶的变化。结果表明 ,花药
培养 7d 以后 ,高诱导率自交系 A3 及高诱导率 F2 单株均出现 Rf 0150 和 Rf 0152 2 条
过氧化物同工酶谱带 ,而难诱导自交系 A46 和难诱导 F2 单株无此特征。据此认为 ,
过氧化物同工酶可以作为花培能力选择的一项较为可靠的生化指标。
关键词 :玉米 ;F2 分离群体 ;花药培养 ;过氧化物酶
收稿日期 :2002201216
作者简介 :齐延芳 (1970～) ,女 ,山东诸城人 ,助理研究员 ,从事玉米遗传育种研究。
通过花药培养再生花粉植株进而形成 DH系是一条诱人的玉米育种途径。尽管国内外学
者在玉米花粉植株的培养条件、小孢子胚胎发生的细胞形态学和超微结构观察等研究领域已
做了大量的工作[1 ,2～3 ] ,但难以克服的基因性障碍仍然限制该项技术的广泛应用。
酶是植物细胞代谢和分化发育的物质基础 ,通常以同工酶形式存在于不同组织和分化发
育的不同阶段[2 ] 。前人研究了多种植物组织培养中体细胞胚胎发生过程中同工酶的变化 ,过
氧化物酶是其中最普遍也是最典型的一类[9 ,10 ] 。在以前的研究中 ,我们发现高诱导率玉米自
交系以及高诱导率自交系与难诱导自交系杂种 F1 在培养过程中均产生过氧化物同工酶特异
性谱带 ,而难诱导自交系无此特征[5 ] 。在此基础上 ,我们进一步研究了 F2 代分离群体花药培
养过程中同工酶的变化 ,旨在深入探讨花培能力这一性状的遗传机制 ,为加速该性状的遗传转
育工作提供理论基础。
1 　材料与方法
试验材料为高诱导率自交系 A3、难诱导系 A46 及 (A3 ×A46) F2 分离群体。将单核靠边期
的花药接种在改良“玉培”培养基上。经 7 ℃低温预处理 14d 后 ,28 ℃暗培养 14d ,然后弱光
(10001x)培养 7d ,再采用微胚早期转移的方法[7 ]进行分化培养。
在低温预处理之前、低温预处理之后、28 ℃培养 1、3、7、10、14、21d 及分化培养 1、3、7d 共 11
191　核 农 学 报　2003 ,17 (3) :191～195Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
个时期分别取样 100mg ,加入 1ml Tris2HCl 缓冲液 (pH810) ,冰浴研磨 ,匀浆提取液经 8000rmp 冷
冻离心 (0～4 ℃) 30min ,取上清液 ,放置于 - 20 ℃冰箱中备用。采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶
电泳 (PAGE)系统 ,参照胡能书等[8 ]的方法进行。并计算谱带相对迁移率 (Rf ,Rf = 谱带迁移距
离Π前沿指示剂迁移距离) 。
2 　结果与分析
211 　供试自交系花药培养效果
由表 1 看出 ,不同自交系花培诱导效果差别很大 ,A3 胚状体和愈伤组织诱导率为 5310 % ,
而 A46 自交系对诱导没有反应。
表 1 　供试自交系诱导率比较
Table 1 　Induction rate of different donor inbred lines
供体基因型
genotype of donor plant
接种花药枚数
No. of anthers cultured
胚状体和愈伤组织块数
No. of embryoids and calli
胚状体和愈伤组织诱导率
induction rate of embryoids and calli ( %)
A3 1800 954 5310
A46 1800 0 0
　注 :胚状体和愈伤组织诱导率 = 胚状体和愈伤组织块数Π接种花药数×100
Note : Induction rate of embryoids and calli = No. of embryoids and calliΠNo. of anthers cultured ×100
212 　自交系 A3 在不同培养时期过氧化物同工酶谱的变化
自交系 A3 具有很高的诱导率 (表 1) ,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳探讨了该自交系在整个花
药培养过程中的过氧化物酶同工酶谱变化。
由电泳图谱看出 ,低温预处理之前 (未培养花药) 显示 10 条谱带 (图 121) ;低温预处理之
后 ,Rf 0132、Rf 0139、Rf 0146 3 条谱带均消失 ,Rf 0137 则由培养之前的扩散带变为主带 (图 12
2) ;28 ℃培养 3d 后 ,谱带较低温预处理以后染色加深 ,表明花药在诱导条件下过氧化物酶的活
性增强 ,代谢较旺盛 (图 124) 。培养 7d 时 ,又产生了 Rf 0152 带 (图 125) ;培养 10、14d 谱带染色
进一步加深 ,正极向酶带逐渐丰富 (图 126、7) 。诱导培养 3 周时 ,Rf 0137、Rf 0150、Rf 0152 3 条
带的颜色非常浅 (图 128) 。分化培养过程中 ,谱带染色又逐渐变深 (图 129、10、11) 。过氧化物
同工酶谱的这些变化反映了不同培养时期花药内部的生化代谢状况。Rf 0150 和 Rf 0152 这 2
条带在整个培养过程中始终存在 ,证明可能与花培能力有关。
213 　( A3 ×A46) F2 分离群体花药培养效果
由表 2 看出 ,花培能力这一性状在 (A3 ×A46) F2 代发生明显分离 ,2、3、6、7、8、9、11、12 号
单株花粉胚状体和愈伤组织的诱导率均在 20 %以上 ,其中 7 号单株最高 ,为 4819 % ;而其它单
株在同样的培养条件下 ,诱导率极低 ,均在 1 %以下 ,其中 1、5、13 号单株的诱导率为 0。
214 　( A3 ×A46) F2 分离群体花药培养 7d 过氧化物同工酶谱
将表 2 中所列 F2 单株的花药在 28 ℃条件下培养 7d ,提取过氧化物酶 ,进行电泳 ,比较不
同诱导率单株的同工酶谱特征。结果表明 :F2 代不同花培诱导率单株过氧化物同工酶谱明显
不同 ,2、3、6、7、8. 9、11、12 号单株 (其诱导率均在 20 %以上) 的同工酶谱与其亲本 A3 相同 ,均
出现 Rf 0150 和 Rf0152 这 2 条带 ,而 1、4、5、10、13、14 号单株 (诱导率均在 1 %以下)与其难诱导
亲本 A46 相同 ,均没有显示这两条同工酶谱带 (图 2) 。这一结果说明 Rf 0150 和 Rf0152 这 2 条
291 核　农　学　报 17 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
谱带可以通过杂交遗传给后代 ,在后代中得到表达 ;同时 ,这两条谱带很可能与花培能力有关。
表 2 　( A3 ×A46) F2 分离群体花培诱导率
Table 2 　Induction rate of (A3 ×A46) F2 segregation population
供体单株编号
donor plant
接种花药数
No. of anthers cultured
胚状体和愈伤组织块数
No. of embryoids and calli
胚状体和愈伤组织诱导率
induction rate of embryoids and calli ( %)
1 330 　0 　0
2 300 65 2117
3 270 114 4212
4 510 1 012
5 270 0 0
6 300 113 3717
7 270 132 4819
8 300 107 3517
9 420 187 4415
10 330 2 016
11 360 126 3510
12 270 91 3317
13 450 0 0
14 300 2 017
　注 :胚状体和愈伤组织诱导率 ( %) = 胚状体和愈伤组织块数Π接种花药数×100
Note : Induction rate of embryoids and calli ( %) = No. of embryoids and calliΠNo. of anthers cultured ×100
图 1 　不同培养时期自交系 A3 过氧化物同工酶谱
Fig. 1 　peroxidase isozyme patterns of inbred
line A3 at different stage of culture
1～11 依次为低温处理之前、低温处理之后、28 ℃培养
1、3、7、10、14、21d ,分化培养 1、3、7d
1～ 11 are isozyme patterns before and after low temperature
treatment ,after 1 ,3 ,7 ,10 ,14 ,21 days of culture ,and after 1 ,3 ,
　　 7 days of differentiation culture
图 2 　自交系 A3、A46 及其 F2 (A3 ×A46)分离
群体过氧化物同工酶谱
Fig. 2 　peroxidase isozyme patterns of inbred
line A3 ,A46 and their F2 segregation
population
a、b 分别为自交系 A3、A46 ;1～14 分别为
1～14 号 F2 单株
a and b are the patterns of inbred line A3 and A46 ;
1～14 indicate No. 1 to No. 14 F2 plant respectively
3 　讨 　论
311 　关于花培能力的遗传
基因性障碍是限制玉米花药培养技术广泛应用于育种的一个重要因素。国内外对花培能
391　3 期 玉米自交系及 F2 分离群体花药培养中的过氧化物同工酶分析
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
力 (anther culturability)的研究结果表明 ,该性状是由显性主效基因控制 ,而且遗传力较强[11 ,12 ] 。
因此可以利用杂交、回交、群体改良等遗传方法来转育控制该性状的基因 ,拓宽花培的种质资
源。杜娟等利用桥接组合的转育方法来提高花培诱导率 ,取得了很好的效果[8 ] 。齐延芳等[5 ]
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 ,分析了自交系及正反交杂种 F1 花药培养过程中过氧化物同工
酶的差异 ,推断花培能力是由显性主效基因控制 ,杂交以后可以传递给后代 ,这些与前人的研
究结果一致。同时发现 ,正交与反交之间谱带没有差异 ,说明花培能力这一性状没有细胞质效
应。
本研究进一步探讨了自交系及 F2 分离群体的花培效果 ,以及它们在花药培养过程中过氧
化物同工酶的特征。结果表明 ,花培能力在 F2 代产生分离 ,同时特异性同工酶谱带 (Rf 0150、
Rf 0152)的有无与 F2 单株的实际花培能力相对应。高花培能力单株的酶谱中出现 Rf 0150 和
Rf 0152 2 条特异带 ,而低花培能力单株的酶谱中未发现这两条特异带。这说明 Rf 0150 和 Rf
0152 这 2 条特异带可作为花培能力这一性状的生化标记 ,应用于玉米花药培养能力改良的研
究中。
312 　同工酶作为生化标志进行选择的可靠性
同工酶技术与遗传育种的关系极为密切 ,它可以作为一种有效的手段 ,从分子水平去甄别
诸多通过外部形态难以鉴别的遗传变异 ,因此在植物育种领域得到了广泛的应用。本研究初
步证明 ,过氧化物同工酶可以作为花培能力选择的一项重要而且较为可靠的生化指标 ,在玉米
花培能力选择中起到重要的作用。
如果能够通过深入研究 ,找到与花培能力高度相关的多种同工酶带型或一定分子量的特
异性蛋白 ,将其作为花培能力高低的生化标记 ,则将能够大幅度提高花药培养能力的遗传改良
效率。另外 ,在更广泛的 F2 群体内 ,进一步考察同工酶谱带及花培效果的分离比率 ,研究同工
酶与花培能力在遗传学上的连锁关系或在统计学上的相关性 ,以确定选择指标 ,则更能提高选
择的准确性。
参考文献 :
[ 1 ] 　谷明光 ,等. 植物体细胞遗传与作物改良. 北京 :北京大学出版社 ,1988 ,102～134
[ 2 ] 　倪德祥 ,等. 植物组织培养中酶的研究. 自然杂志 ,1987 ,10 (12) :925～928
[ 3 ] 　齐延芳 ,等. 玉米小孢子胚胎发生启动的超微结构观察. 核农学报 ,1999 ,13 (2) :70～74
[ 4 ] 　齐延芳 ,等. 玉米小孢子胚胎发生的细胞形态学观察. 核农学报 ,1999 ,13 (1) :1～10
[ 5 ] 　齐延芳 ,等. 玉米小孢子胚胎发生过程中的同工酶谱分析. 见 :胡道芬 ,植物花培育种进展. 北京 :中国农业科技出版
社 ,1995 ,254～258
[ 6 ] 　姜丽君 ,等. 微胚早期转移及染色体早期加倍技术对提高玉米花药培养效率的作用. 植物花培育种进展. 北京 :中国农
业科技出版社 ,1995 ,249～253
[ 7 ] 　胡能书 ,等. 同工酶技术及其应用. 长沙 :湖南科学技术出版社 ,1985
[ 8 ] 　杜娟 ,等. 利用桥接组合的转育方法提高玉米花药培养诱导率的研究. 玉米科学 ,1999 ,7 (3) :16～18
[ 9 ] 　Everatt N P ,et al . Biochemical markers of embryogenesis in tissue culture of maize inbred B73. Plant Sci . 1985 ,41 :133～140
[10 ] 　Franz P F ,et al . Isozymes as biochemical and cytochemical markers in embryogeneic callus cultures of maize glutamate2dehydroge2
nase ,peroxidase and acid phosphatase isoenzyme application. Plant Cell Rep ,1989 ,8 :67～70
[11 ] 　Petolino J F ,et al . Genetic analysis of anther culture response in maize. Theor Appl Genet . 1987 ,74 :284～286
[12 ] 　Afele J C ,et al . Genetic studies of corn ( Zea mays L. ) anther culture response. Theor Appl Genet . 1990 ,80 :459～464
491 核　农　学　报 17 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
ISOZYME ANALYSIS OF MAIZE( Zea mays L. ) INBRED LINES AND A F2 SEGREGATION
POPULATION DURING ANTHER CULTURE PROCEDURE
QI Yan2fang1 　YANGJing2cheng2 　ZHOU Zhu2hua1 　XING Yan2ju1
XU Li2hua1 　XU Fang2zuo1 　QIU Deng2lin1
(1. Institute for Application of Atomic Energy , Shandong Academy of Agricultural Sciences ,Jinan , Shandong prov 　250100 ;
2. Laboratory of Quantitative Vegetation Ecology , Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Beijing 　100093)
Abstract :Anthers of two inbred lines( A3 and A46) with different induction rate and their F2 ( A3
×A46) segregation population were cultured. The peroxidase isozyme patterns of their embryoids
and calli were analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis( PAGE) . The results indicated
that the isoperoxidase bands Rf 0150 and Rf 0152 were only present in the inbred line and donor
plants of F2 segregation population with high induction rate. It is supposed that the isoperoxidase
patterns can be used as a kind of reliable biochemical marker to improve anther culturability of
maize.
Key words :maize( Zea mays L . ) ; F2 segregation population ; anther culture ; peroxidase
(上接第 198 页)
参考文献 :
[ 1 ] 　Meyer L ,et al . Blood dyscrasias attributed to chloramphenicol . A review of 641 publised and unpublished cases. Postgrad Med ,1974 ,
50 :123～126
[ 2 ] 　Hamburger R N. Chloramphenicol2specific antibody. Science ,1966 ,152 :203～205
[ 3 ] 　王桂枝 ,石德石 ,等 ,氯霉素免疫原的合成与鉴定 ,中国兽医学报 ,1998 ,18 (2) :163～167
[ 4 ] 　杨利国 ,酶免疫测定技术 ,南京 :南京大学出版社 ,1998
STUDY OF THE POLYCLONAL ANTIBODY AGAINST CHLORAMPHENICOL
WANG Qian 　QI Meng2wen 　HE Fang2yang 　YANG Gen2hai
( China Agricultural University , Beijing 　100094)
Abstract :The antigen of Chloramphenicol was synthesized by CDI reaction and diazotization reac2
tion respectively , and identif ied with UR scan and imported commercial kit. After immunized 4
times ,the sensitivity of the antiserum obtained was more than 10ngΠml.
Key words :chloramphenicol ; antigen ; polyclonal antibody; ELISA
591Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17 (3) :191～195
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net