全 文 ：文章编号 :100028551 (2000) 0420206206
离子注入法获得大豆 —小麦分子远缘
杂种及后代的变异分析
吴丽芳　余增亮
(中国科学院等离子体物理研究所离子束生物工程研究室 ,安徽 合肥　230031)
摘要 :通过能量 30keV、剂量 7 ×1016离子/ cm2 的 Ar + 注入 ,将两个大豆品种的全
DNA (400μg/ ml)分别导入两个小麦栽培品种皖 9210 和扬麦 5 号。经过离子注入和
大豆 DNA 处理的种子发育成为植株后 ,当代未表现出明显不同于受体的变异性状。
经转化处理的植株成熟后 ,按株分别收获脱粒 ,并对籽粒蛋白质含量等性状进行分
析 ,发现有两个单株的蛋白质含量分别达到 20146 %和 25135 % ,明显高于受体。说
明通过离子束介导外源 DNA 转化技术 ,可以绕过复杂的组培过程而由成熟种子直
接发育为植株 ,也可获得带有目的性状的转化后代 ,为远缘物种间遗传物质交流提供
了一种简便有效的途径。
关键词 :离子注入 ;大豆 DNA ;小麦 ;分子远缘杂种 ;后代变异
收稿日期 :2000202220
基金项目 :国家自然科学基金重大项目 (119890300)资助 ,国家重点科技攻关项目 (962538202201)资助课题
作者简介 :吴丽芳 (1967 —) ,女 ,山东龙口人 ,博士 ,从事离子束介导小麦转基因研究及小麦细胞和分子遗传学研究
80 年代以来 ,利用分子育种手段改良作物和创造新的种质资源的研究已成为生物技术发
展的一个新的增长点。特别是以植物种胚细胞为受体进行的分子远缘杂交技术 ,克服了亲缘
关系较远的物种间的杂交不亲和性和生殖隔离 ,使远缘物种间在 DNA 水平上实现杂交重组。
导入的对象可以是目的基因 ,也可以是带有目的基因的外源 DNA 片段[1～3 ] ,为扩大作物遗传
基础 ,改善作物品质和提高抗性提供了一种简便快捷的方法 ,并取得了较好的效果[4～6 ] 。广
泛应用的花粉管通道法绕过了复杂的组织培养过程 ,将外源 DNA 直接导入种胚细胞 ,操作方
便 ,容易推广 ,因此颇受育种工作者的欢迎。但是用体细胞和组织为受体进行基因转移时 ,细
胞壁是外源 DNA 导入的天然障碍 ,寻找突破这一障碍的技术、提高转化效率一直是生物工作
者的研究方向。余增亮等的研究发现 :低能离子注入对植物细胞壁具有刻蚀作用 ,并可产生局
部穿孔 ,从而改变了细胞膜的通透性 ,有利于外源遗传物质的进入[7 ] 。据此原理 ,杨剑波等将
hph 基因和 GUS 基因导入水稻细胞 ,获得转基因植株[8 ,9 ] ;程备久等通过氩离子注入和 DNA
溶液浸滴法将比克氏棉和红麻 DNA 导入泗棉 2 号 ,获得了一批具有供体性状的品系[10 ] 。本
研究报道的是用离子束法介导将大豆总 DNA 直接导入小麦的研究结果 ,并对后代性状变异
进行了分析。
602 　核 农 学 报　2000 ,14 (4) :206～211Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1 　材料与方法
111 　试验材料
受体为小麦品种皖 9210 和扬麦 5 号。外源 DNA 供体为大豆品种 88248 和 8624 ,具有蛋
白质含量高等性状。
112 　发芽率和存活率测定
经注入的种子在垫有湿滤纸的培养皿中 ,置 22 ℃光照培养箱中发芽。有绿色芽点生成的
即被认为是发芽种子。发芽后的种子移入田间 ,以可发育至 3 叶期以上的幼苗数作为存活率
统计标准。
113 　DNA 提取
大豆 DNA 的提取用 CTAB 法大量提取幼苗叶片中总 DNA[11 ] ,紫外分光光度计测定
DNA 纯度与浓度 ,然后用 011 ×SSC 缓冲液稀释至工作浓度 ,置 4 ℃冰箱备用。
114 　离子注入处理
将种子消毒后 ,胚部向上均匀排列于无菌培养皿中 ,超净台中无菌吹干后 ,接受能量为
30keV 的不同剂量的氩离子 (Ar + ) 束的脉冲式注入处理 ,然后进行发芽试验。统计发芽率和
田间存活率。在进行外源 DNA 的导入试验中 ,离子注入完成后立即将种子浸入含有大豆
DNA (400μg/ ml)的 011 ×SSC 导入介质中 ,26 ℃温育 8～24h ,取出种胚用 011 ×SSC 溶液冲洗
3 次 ,无菌滤纸吸干残存溶液 ,加无菌水发芽。同时设两组对照 ,一组是将 100 粒种子置于离
子束注入环境中 ,但不接受离子注入处理 ,同样浸入含大豆 DNA 的导入介质中温育 (CK1) ;另
一组对照是将 100 粒种子接受与处理相同的离子束处理 ,然后浸于不含 DNA 的导入介质中
温育 (CK2) ,2 组对照其它操作均与处理相同。当小苗长至 5～8cm 高时 ,移入田间。
115 　小麦种子蛋白质含量的测定
按照凯氏定氮法[12 ]进行样品消化 ,用瑞典产 I KB 凯氏定氮仪进行总氮量测定 ,然后换算
成蛋白质含量。
2 　结果与分析
211 　注入离子剂量对种子发芽率和存活率的影响
用能量为 30keV、剂量为 0～10 ×1016离子/ cm2 的 Ar + 对两个小麦栽培品种皖 9210 和扬
麦 5 号进行了注入试验 ,注入后种子在 22 ℃光照培养箱中发芽 ,7d 后统计发芽率 ,当幼苗长至
5～8cm 高时 ,移至田间 ,进行存活率统计。图 1 和图 2 为注入剂量与发芽率和存活率的关系。
从图 1、图 2 中可见 ,随着剂量的增加 ,离子注入的抑制效应越来越明显。在低剂量范围
内 ,离子注入并未引起发芽率和存活率明显降低 ,甚至有的品种还略有升高。但当达到一定剂
量后 ,发芽率和存活率开始随剂量的增加而急剧下降。当剂量分别达到 4 ×1016离子/ cm2 和 2
×1016离子/ cm2 以上时 ,注入离子剂量的增加对皖 9210 的发芽率和存活率的抑制效果特别明
显。引起扬麦 5 号的发芽率和存活率显著下降的最低剂量分别是 6 ×1016离子/ cm2 和 4 ×
1016离子/ cm2 。表明选择适宜的注入剂量很重要。
702　4 期 离子注入法获得大豆2小麦分子远缘杂种及后代的变异分析
图 1 　离子注入剂量与发芽率的关系
Fig. 1 　Changes in the germination rate of
wheat seeds exposed to ion beams
图 2 　离子注入剂量与存活率的关系
Fig. 2 　Changes in the survival rate of
wheat seeds exposed to ion beams
　　在用 GUS 基因作为报告基因进行的离子注入法直接导入外源 DNA 的试验中 ,我们发现
在 7 ×1016离子/ cm2 的注入剂量下 GUS 基因的瞬间表达率最高 ,达到 70 %以上。在此剂量
下 ,皖 9210 和扬麦 5 号的发芽率分别是 50 %和 70 % ,是可以接受的数值。因此我们选用这个
剂量作为介导大豆 DNA 导入小麦的注入剂量。
212 　离子束介导大豆 DNA 导入小麦获得分子远缘杂种
两个小麦品种各取若干种子 ,注入能量为 30keV、剂量 7 ×1016离子/ cm2 的 Ar + ,然后用
400μg/ ml 的两个大豆品种 DNA 溶液处理过夜。经导入缓冲液冲洗后 ,在 22 ℃光照培养箱中
发芽 ,7d 后统计发芽率 ,当小苗长至 5～8cm 高时 ,移栽到田间 ,统计存活率 (表 1) 。
表 1 　大豆 DNA 处理后小麦种子的发芽率和存活率
Tabel 1 　Germination and survival rate of wheat seeds treated with soybean DNA
小麦品种
varieties
of wheat
大豆品种
varieties
of soybean
处理种子数
No. of seeds
treated
发芽种子数/ 发芽率
No. of germination seeds/
germination rate ( %)
成苗数/ 存活率
No. of seedlings/
survival rate ( %)
皖 9210 8624 118 48/ 4017 35/ 2917
Wan 9210 88248 115 45/ 3911 38/ 3310
扬麦 5 号 8624 113 56/ 4916 48/ 4215
Yangmai 5 88248 114 53/ 4615 49/ 4310
图 1 和图 2 中显示 ,当剂量为 7 ×1016离子/ cm2 时 ,皖 9210 的发芽率和存活率分别为
50 %和 35 % ,扬麦 5 号的发芽率和存活率分别为 70 %和 50 %。而受到同样剂量的 Ar + 注入
后 ,再经过外源 DNA 浸泡处理后 ,扬麦 5 号和皖 9210 的发芽率和存活率有不同程度的下降
(表 1) ,而未经过离子注入直接进行 DNA 处理的对照 (CK1) 发芽率也有所下降 ,但下降的幅
度小于 5 % ,存活率基本保持不变。
213 　外源 DNA 导入引起的小麦性状变异
经 DNA 导入处理的发芽苗移栽入田间后 ,通过对生长期的性状观察 ,没有发现显著的表
型变异。当代种子收获后 ,重点对种子蛋白质含量进行了检测 (表 2) 。对生长状态良好的两
个受体小麦品种的 144 个经 DNA 导入处理的发芽苗下代单株进行了蛋白质含量检测 ,发现
802 核　农　学　报 14 卷
蛋白质含量高于对照的单株有 17 个 ,其中大部分单株的蛋白质含量在对照与 20 %之间 ,有 2
个单株的蛋白含量达到 20 %以上 ,最高含量为 25135 %。经卡平方检验 ,这 2 个单株的蛋白含
量与对照受体小麦品种 (皖 9210)有显著或极显著差异 ,占该品种测定样品总数的 413 % ,占该
品种原初处理种子总数的 0185 %。在经 DNA 导入处理的发芽苗下一代中 ,来自大豆的高蛋
白性状仍能表达 ,说明通过离子束介导 ,外源大豆基因确实整合到小麦基因组中 ,得到了表达。
看来 ,离子束介导远缘杂交物种间进行分子杂交是可行的。
表 2 　分子杂交后代的蛋白质含量测定结果
Tabel 2 　Protein content of molecular hybridization offspring
受体小麦
蛋白质含量
content of protein
of wheat breed( %)
DNA 供体大豆
蛋白质含量
content of protein
of soybean ( %)
测定样
品数
No. of
samples
蛋白质含量高于
对照植株数
No. of plants with
higher protein content
than control
蛋白质含量
最高值
the highest
protein content ( %)
皖 9210 (12137) 88248 (37174) 29 3 20146
Wan 9210 8624 (40172) 18 10 25135
扬麦 5 号 (13158) 88248 (37174) 97 4 14112
Yangmai 5
　　注 :皖 9210 CK1 的蛋白质含量为 12135 % ,CK2 为 12141 % ;扬麦 5 号 CK1 的蛋白质含量为 13160 % ,CK2 为 13155 %。
Note : The protein content of Wan 9210 CK1 was 12135 % , CK2 was 12141 ; that of Yangmai 5 CK1 was 13160 CK2 was
13155 %。
　　2 个高蛋白小麦单株的农艺性状见表 3。从表中可见 ,SA11 的穗子较短 ,结实率偏低 ,综
合性状不理想 ,需要加以改进。SA17 的综合性状好于前者 ,蛋白质含量也高出约 5 个百分点 ,
是一种有很好应用前景的基础材料。
表 3 　高蛋白单株的农艺性状
Tabel 3 　Agronomic character of single plants with high protein content
单株
single plant
蛋白质含量
content of
protein ( %)
株高
height of
plant (cm)
穗长
length of
spike (cm)
分蘖数
No. of
tillers
结实率
seed set
( %)
SA11 20146 70 4 10 1111
SE17 25135 80 1018 21 10010 %
3 　讨 　　论
细胞壁是外源 DNA 直接导入植物细胞的主要障碍 ,在现有的转化方法中 ,有的是去除细
胞壁 ,利用原生质体为受体摄取外源 DNA ;有的是用各种载体直接将外源 DNA 导入细胞中 ;
也有的是为外源 DNA 进入受体细胞提供通道 ,通过高渗缓冲液将外源基因导入植物细胞。
低能离子束的溅射作用早已为试验所证实[7 ] ,由于溅射作用在细胞壁和细胞膜上形成一些可
修复的微孔 ,便于细胞摄取外源 DNA ;带正电的注入离子在微通道内的积累 ,可吸引带负电的
外源 DNA 主动进入细胞。进入受体细胞的外源 DNA 可以通过复制、重组等过程整合到受体
基因组 ,离子注入对受体细胞造成的损伤可诱导修复作用的发生 ,这也增加了外源 DNA 整合
到受体基因组的几率[3 ] 。本研究绕过了繁杂的组培过程 ,由经注入和转化处理的成熟种子直
902　4 期 离子注入法获得大豆2小麦分子远缘杂种及后代的变异分析
接发育为植株 ,获得了高蛋白单株 ,说明离子注入法是一种简便有效的导入外源基因、创造新
的种质资源的途径。
在目的基因和外源大分子转化中 ,使用的 DNA 浓度各不相同。在各种形式的以质粒为
载体的目的基因的转化中 ,使用的 DNA 浓度一般在 100μg/ ml 以下。其中 ,使用 50μg/ ml 的
居多数。在外源总 DNA 进行的分子远缘杂交中 ,使用的 DNA 浓度较高 ,一般使用数百微克
每毫升的浓度 ,有的可达 1600μg/ ml [14 ] 。本研究用浓度为 100～1500μg/ ml 的大豆 DNA 溶
液 ,对经离子注入的小麦种子进行浸泡发芽试验发现 ,在 DNA 浓度达到 1000μg/ ml 以上时 ,
小麦发芽受到明显抑制 ,大部分种子保持在露白状态 ,不再继续生长。当用 011 ×SSC 冲洗
后 ,在无菌水中继续培养时 ,部分停止生长的种子可继续生长 ,发育成幼苗。看来 ,发芽受抑制
的原因可能是由于高浓度的外源 DNA 的影响 ,大量外缘遗传物质的介入 ,使得有丝分裂受到
影响 ,细胞不能正常分裂 ,当解除这种干扰后 ,一些种子继续发育 ,而另外一些材料则由于平衡
被打乱 ,不再能发育成正常的植株。因此 ,外源 DNA 的处理浓度不是越高越好 ,使用过高浓
度 DNA ,一方面会造成不必要的浪费 ,也不一定就会带来更好的转化效果。本研究表 1 中的
数值与图 1 和图 2 中相应注入剂量下结果的区别在于是否经过 DNA 处理。经过 DNA 处理
的小麦品种的发芽率要低一些 ,很可能是由于外源 DNA 的影响 ,存活率降低的幅度要小一
些 ,可能是由于用缓冲液冲洗后 ,一些种子又恢复了生长能力的结果 ;未经过离子注入的对照
(CK1)的发芽率降低幅度很小 ,存活率保持不变的原因可能是未经离子注入的种子表面结构
完整 ,外源 DNA 进入种胚的阻力较大 ,故对种子的萌发生长影响要小一些。
我国是面粉消费大国 ,每年进口优质小麦和面粉约 10 ,000 万吨 ,相当于我国小麦总产的
10 % ,占常年粮食进口的 90 %。为了保护农民的种麦积极性 ,国家采取了限制优质麦进口的
政策 ,食品行业却由于优质面粉短缺而限于困境。因此 ,培育我国自己的优质小麦品种已成为
当务之急。然而由于缺乏优质高产的品质资源 ,使得小麦品质改良受到限制。在小麦的近缘
种属、其它栽培物种或野生物种中存在着一些可利用的种质资源 ,人们正在探索用非常规的途
径进行远缘物种间遗传物质的交流 ,来扩大小麦的遗传基础 ,丰富种质资源。大豆在为人类提
供蛋白质方面起着重要作用。若能将大豆种子内与蛋白质合成有关的基因导入禾谷类粮食作
物 ,将提高禾谷类粮食作物蛋白质含量 ,这对于提高我国日人均蛋白摄入量是十分有意义的。
我国现有小麦品种蛋白质含量一般为 11 %～14 % ,本研究获得的 2 个高蛋白单株的蛋白含量
分别达到 20146 %和 25135 % ,为小麦优质品种的选育提供了基础材料 ,而且这种途径获得的
材料不带有筛选标记 ,不会对环境造成污染。同时 ,这一研究对于有关基因的分子遗传学研究
具有非常重要的意义。
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DISTANT MOL ECULAR HYBRID DERIVED FROM SOYBEAN AND WHEAT WITH
ION IMPLANTATION AND VARIATION ANALYSIS
WU Li2fang 　YU Zeng2liang
( Ion Beam Bioengineering L ab , Instit ute of Plasma Physics , Chinese Academy of Sciences , Hef ei , A nhui prov . 　230031)
ABSTRACT :The exogenous total D NAS of soybean were introduced into wheat breeds , Wan9210
and Yanmai 5 , by Ar + implantation. The results showed that the dose of ions implanted was one
of the important factors affected the germination and survival rate of wheat. The suitable dose
was 7 ×1016 ions/ cm2 . The plants treated with Ar + and soybean D NA didn’t showany apparent
variation in the f irst generation. After harvest , the protein content of transformated progeny
was analyzed. The protein content of t wo signle plants reached 20146 %and 25135 %respective2
ly , which were much higher than that of control . It is concluded that low energy of ion beam
mediated D NA delivery into mature seeds was a simple and effective method for the genetic ma2
terial exchange of species with distant genetic relationship.
Key words :ion implantation ; soybean DNA ; wheat ; molecular hybrid ; progeny variation
112Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2000 ,14 (4) :206～211