全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 062448205
植物离体培养筛选耐盐突变体的研究
高玉红　李　云 3
(北京林业大学生物科学与技术学院 ,林木花卉遗传育种重点实验室 北京　100083)
摘　要 :本文总结了利用离体培养系统筛选耐盐突变体的研究进展 ,分别从材料选择、变异来
源、突变体的筛选等方面进行了讨论 ,概括了人工诱变离体培养材料的常用诱变剂及诱变剂量
的选择 ;从生理生化及分子生物学等角度分析和归纳了耐盐突变体鉴定的研究进展 ,并指出了
筛选耐盐突变体应考虑的问题。
关键词 :离体培养 ;诱变 ;耐盐 ;突变体
APPLICATION OF SELECTION OF SALT2TOLERANT MUTANT FROM PLANT IN VITRO
GAO Yu2hong 　LI Yun
( College of Biological Science and Technology ; Key Lab for Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of MOE ,
Beijing Forestry University , Beijing ,100083)
Abstract :Advance of selection of salt2tolerant variants from plants in vitro were reviewed in this paper. The
achievements in selection of materials and variants ,origin of variation ,identify of variants were summerized and
some unsolved problems were discussed.
Key words : in vitro ; induction ; salt2tolerant ; mutant
收稿日期 :2003209215
作者简介 :高玉红 (1974～) ,女 ,河北省唐山人 ,硕士生 ,从事林木遗传育种方面的研究。
通讯作者 :李云 :010262338105 ,yunli @bjfu. edu. cn。
土壤盐渍化是限制农林业生产的一个世界性问题 ,在农业占地越来越少的情况下 ,人们开始日益重
视盐碱荒地的利用问题。大规模引淡水洗盐 ,需要耗费大量财力、人力和物力 ,并且难以从根本上解决
问题。而根据植物耐盐的差异性和遗传性 ,选育耐盐品种可以较好的解决盐渍土地的利用问题。选育
耐盐品种方法包括杂交育种、引种、细胞工程和基因工程等 ,其中杂交育种存在杂交不亲和性 ;引种工作
因需调查植物耐盐性、引种后的耐盐稳定性等而耗时长 ;基因工程虽是比较看好的方法 ,但植物抗性是
受多基因控制的 ,耐盐机制非常复杂 ,转入一个或较少数量的基因有可能达不到预期的抗盐效果 ,且存
在基因沉默等问题 ;而在植物细胞工程中 ,特别是植物离体培养过程中存在广泛的体细胞变异 ,充分利
用该变异有可能培育出耐盐突变体。
1972 年Melcher 第 1 次专门讨论了植物组织培养技术用于筛选耐盐突变体的优越性[1 ] ,紧接着 Zenk
又利用该技术获得耐盐细胞系[2 ] 。随后人们对离体培养筛选耐盐突变体的研究逐年增加 ,研究种类已
近 40 种[3 ] 。诱变育种学是近 40 年来兴起的一门现代育种技术 ,它的迅速发展对离体筛选耐盐突变体
产生了重大影响。早在 80 年代初联合国粮食组织与国际原子能机构联合处就曾指出 (FAOΠIAEA ,1981)
“把诱变育种同其他方法相结合”的思想。研究表明离体培养与诱变育种技术结合 ,能大大丰富突变类
型 ,提高突变频率和育种效率[4 ] 。
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1 　耐盐突变体的选育
利用组织和细胞培养筛选耐盐突变体的选育程序基本包括材料的确定、突变体筛选和突变体的鉴
定等步骤。
111 　材料选择
在分离突变体时 ,选择细胞起始材料非常重要 ,它是成功获得突变体的关键。选择的起始材料首先
要选综合性状好、只有某一缺陷需要改进的基因型 ,其次要具有良好的长期高分化能力 ,第三尽可能选
用染色体数稳定的细胞系 ;另外在离体条件下所用材料的染色体倍性水平也是研究者需要考虑的一个
问题 ,由于种子繁殖植物不仅有嵌合体问题 ,且经有性世代后 ,突变性状还有重组、分离问题 ,致使耐盐
性后代选择、鉴定很复杂。因此在技术允许的前提下 ,用单倍性材料筛选效果更好。
目前 ,分离突变体的细胞材料包括愈伤组织、悬浮细胞和原生质体。愈伤组织是分离突变体最简单
的细胞材料 ,方法简便 ,较易获得突变植株。但也有许多缺点 ,如培养物生长慢、选择压力不均一、胁迫
变异小 ,个别抗性细胞可能由于周围组织的障碍 ,失去分裂新细胞的能力等。而悬浮细胞和原生质体多
是单细胞起源的 ,选择压力均一 ,生长周期较短 ,容易获得耐盐能力较高的突变细胞系 ;而且还可避免或
限制嵌合体的形成 ,是直接获得同质突变体的理想材料。但由于悬浮培养技术难度较大 ,目前还处于初
步研究阶段 ,仅有甘薯、杨树等少数植物取得成功[5 ,6 ] 。
112 　变异来源
在变异中 ,大群体细胞间的差异是重要的来源之一 ;除此之外 ,离体培养筛选耐盐突变体的变异还
包括自发变异和人工诱变。
11211 　自发变异
在自发变异中 ,盐胁迫下能否产生耐盐突变体 ,与盐浓度及筛选的时间有关 ,选择压力必须达到足
以抑制绝大多数细胞分裂与生长 ,而使极少部分抗选择条件的突变细胞生长 ,经长期选择获得同质突变
体。
NaCl 是耐盐突变体离体筛选中较常用的选择压力 ,用海水代替 NaCl 进行突变体选择也有成功的报
道[7～9 ] ;除直接利用 NaCl 和海水等作选择压外 ,利用聚乙二醇 ( PEG) 、羟脯氨酸 ( HYP) 等选择剂通过对
渗透调节能力的选择也可提高植物耐盐性。李爱贤和王瑛等在选择耐盐突变体的同时分别获得了对
PEG具交叉抗性的甘薯和沙打旺植物[5 ,10 ] ; Kueh 和 Dix 以及国内的韦小敏也成功筛选出抗 HYP 的大麦、
烟草、玉米突变体[3 ,11 ] ;另外 ,还有用混合盐做选择剂筛选出杨树耐盐植株的报道[12 ] 。
1. 2. 2 　人工诱变
人工诱变是人为地利用理化因素诱发植物遗传变异的育种手段 ,与组织培养结合能够大大丰富培
养物中可供选择的突变类型 ,提高突变率 ,而且还能获得在自发突变中极难产生的新突变 ,能够在较短
时间内创造更有价值的新品种[4 ] 。
常用诱变剂分为物理诱变剂和化学诱变剂两类。物理诱变剂中应用最广泛的是 X 射线、γ射线 ,β
射线和中子。近年来 ,诸如激光、电子束、微波等新的诱变剂也开始应用。尤其是离子辐射 ,诱变频率高
于γ射线 ,且能诱导多个性状同时突变 ,应用前景较为广阔[13 ] 。
化学诱变剂的种类繁多 ,主要以烷化剂和叠氮化合物两类诱变效果较好。结合离体培养技术 ,化学
诱变剂的应用逐渐受到重视 ,尤其在培养基中加入化学诱变剂能增加遗传变异这一特点 ,引起育种学家
的很大关注。
单一因素如单纯用γ射线、中子或某种化学诱变剂 ,虽能引起某些性状的突变 ,但诱变效果不够理
想 ,诱变谱也较单纯。采用理化因素复合处理 ,可产生累加效应或超累加效应 ,可能是辐射处理改变了
细胞膜的完整性 ,促进了化学诱变剂的吸收。在农作物的诱变育种中 ,已推荐使用γ射线 + EMS、γ射线
+ SA 和 SA + EMS 等复合处理技术[14 ] 。
大多数诱变结果表明[4 ] ,从培养的细胞材料中筛选突变体时 ,诱变剂最适剂量的选择 ,不仅要考虑
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突变率的高低 ,而且还要考虑次级损伤效应的大小 ,尤其是对再生能力影响的大小。一般认为 ,适宜的
诱变剂剂量是处理后存活率在一半以上的剂量。关于诱变时期 ,多数认为在细胞快速增殖时期进行诱
变处理突变率最高。终止处理诱变材料 ,经过几个培养周期后 ,按所希望的表型对培养材料进行筛选。
113 　耐盐突变体的筛选
分离耐盐突变体的方法包括负选择法和正选择法两种 ,正选择法亦称直接选择法。一般在耐盐突
变体筛选时采用典型的直接选择法 ,选择程序为一步选择和多步选择或两程序同时使用。无论哪一种
选择 ,其分离抗性突变体的一般步骤为 :在抑制培养基中通过一步或多步法从中分离出假定的突变体 ,
然后经过连续有盐和无盐几代培养 (盐浓度前后一致) ,消除漏网野生型细胞 ,形成稳定的耐盐细胞系 ,
最后从耐盐细胞中再生出完整植株。
目前 ,按照变异来源 ,获得的耐盐突变体主要有两大类 :自发变异突变体和人工诱发突变体。
1. 3. 1 　通过自发变异获得耐盐突变体
在自发变异中 ,农作物筛选耐盐突变体成绩突出 ,获得成功的植物种类较多。
(1)获得再生植株 ,其耐盐性可有性遗传
Nabors 用 9 次重复选择法筛选出烟草耐盐细胞系 ,其再生的耐盐植株连续自交两代均可稳定耐受
海水的灌溉 ,这是第一例耐盐性可通过有性繁殖遗传给后代的报道[15 ] 。随后 ,在水稻[16 ] ,玉米[7 ] ,小
麦[17 ] ,番茄[18 ]上获得的耐盐植株 ,经连续重复选择 ,其后代仍保持耐盐性 ;另外还发现水稻耐盐变异系
的频率与供试品种耐盐性强弱有关。耐盐性强的品种 ,所诱导的无性系中出现的耐盐变异系的频率较
高 ,反之则低[16 ] 。
(2)仅再生出耐盐植株 ,但未对其后代耐盐性进行研究
目前 ,从小麦[13 ] 、水稻[19 ] 、玉米[20 ] 、大豆[21 ] 、红豆草[22 ] 、烟草[23 ] 、燕麦和小黑麦[24 ] 、豆瓣菜[8 ] 、獐毛[25 ]
等植物中已经获得了耐盐植株 ,但还需要对这些耐盐植株进一步研究其遗传稳定性。同时 ,研究发现 ,
愈伤组织分化阶段用 NaCl 胁迫较在愈伤组织形成阶段加入 NaCl 选择效果更好[13 ] ;另外 ,采用逐渐增加
盐浓度的方法能够提高突变频率[19 ] 。
上述只对农作物离体诱变和筛选突变体进行了分析和总结 ,在林木离体诱变育种中 ,由于起步晚、
发展慢 ,有关耐盐突变体筛选的研究相对农作物要少得多 ,仅有少数木本植物取得一定进展 ,而且以杨
树耐盐突变体的研究较多。自李驹首次证明组织培养获得耐盐突变体在林木育种中的可行性后 ,通过
愈伤组织变异系相继获得了不同杨树种和品种的耐盐突变体[26 ] 。试验发现 ,愈伤组织的不同诱导态对
筛选效果影响很大 ,直接对外植体细胞筛选无效 ,对脱分化期和再分化期筛选有效 ,而且再分化期筛选
较脱分化期效果更好。另外 ,随着愈伤组织培养龄的增加 ,耐盐变异率有所增加。在杨树中采用悬浮细
胞培养技术也有了突破性进展 ,不仅首次在群众杨上获得了完整耐盐植株[6 ] ,而且还在细胞水平上对毛
白杨耐盐性作了初步的探讨[27 ] 。除杨树外 ,研究人员还对葡萄、樱桃、柑桔、草莓、木槿等进行了抗盐性
研究 ,其中柑桔、樱桃和木槿已获得了耐盐再生植株[28 ] 。
1. 3. 2 　人工诱变获得耐盐突变体
自从人们发现人工诱变与离体培养筛选耐盐突变体的优越性之后 ,人工诱变离体培养材料和筛选
耐盐突变体工作获得了很大进展 ,已经在大麦[29 ] 、小麦[30 ] 、水稻[31 ] 、小黑麦[32 ] 、甘薯[5 ] 、枸杞[33 ] 、甜
橙[34 ] 、河北杨[33 ] 、猕猴桃[35 ] 和杜鹃[36 ] 等十几种植物上获得了突变株 ,利用的诱变剂主要包括60 Coγ射
线、X射线、快中子、平阳霉素 ( PYM) 、正定霉素 ( ZDM) 、EMS 和 NaN3 等 ,并且其中有些突变株是在单细
胞水平通过人工诱变获得的[5 ] 。在诱变过程中还发现 ,不同的外植体对所用辐照剂量反映不同[37 ] ,复
合处理能够明显提高植物突变体的耐盐性[14 ] 。
2 　突变体的鉴定
组织和细胞培养耐盐突变体是否为真正的遗传突变 ,还需进一步鉴定。综合 Widholm、Flick 与
Maliga 的判断标准 ,突变体的鉴定基本概括为 : (1) 突变体低频率发生 ; (2) 离开选择压后 ,变异性状稳
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定 ; (3)从突变稳定的再生植株中诱导的愈伤组织应当表达其被选择出的表现型 ; (4)突变体能通过有性
传递 ; (5)变异细胞中有改变的基因产物。
植物的耐盐机制非常复杂 ,涉及到一系列形态和代谢过程的变化。为了消除盐胁迫所造成的伤害 ,
通常细胞内会主动积累一些小分子有机化合物和蛋白类保护剂来维持渗透平衡和体内水分 ,保持盐胁
迫下细胞的正常膨压和细胞的正常代谢功能。目前 ,在耐盐突变体筛选方面研究较多的小分子有机化
合物是脯氨酸。它是渗透胁迫下易于积累的一种氨基酸 ,大量试验证明[23 ] ,在盐胁迫下细胞内游离脯
氨酸含量增加 ,如烟草耐盐细胞系中游离脯氨酸的含量随盐浓度的提高而增加 ,耐 210 % NaCl 的细胞系
内游离脯氨酸含量是对照的 4017 倍 ,其再生植株虽然生长在无盐土壤中 ,叶片内游离脯氨酸的含量亦
比对照高出 2 倍。在大麦[29 ] 、玉米[20 ] 、水稻[38 ] 、枸杞[33 ] 、沙打旺[10 ] 、杨树[26 ] 等植物中也获得了类似结
果。
调渗蛋白是在盐胁迫、脱水或低水势条件下 ,植物在对渗透压力适应过程中所合成的一类蛋白。研
究者发现[24 ,39 ,40 ,10 ] ,当培养组织或细胞受到盐胁迫时会合成新的蛋白质。在盐胁迫下 ,烟草、苜蓿、水
稻、玉米、大麦、小麦、沙打旺等植物的培养组织或再生植株中都发现了这种盐胁迫蛋白。此外还进行了
某些盐胁迫蛋白的亚细胞定位 ,某些酶的盐诱导合成和 26kDa 盐胁迫蛋白的分离、纯化、氨基酸顺序分
析等研究。
在细胞水平和植株水平上 ,一些人员对突变体的 Na + 、K+ 、Cl - 等离子的吸收与耐盐性的关系进行
了研究[22 ,25 ] ,发现细胞中 Na + 的浓度与耐盐性呈正相关 ,而 K+ 浓度与 Na + 浓度呈负相关。
同工酶是酶的基因产物 ,又是生化遗传学研究的重要手段 ,通过同工酶种类变化 ,可以了解基因表
达。在耐盐突变体同工酶、全蛋白变化的研究中发现 ,耐盐植物的同工酶谱带与对照存在着明显的差
异[26 ,39 ] ,耐盐植物能够产生特异表达蛋白[41 ] 。
由于诱变处理后常造成细胞和组织损伤 ,会不同程度地降低植株再生能力 ,因此一些研究人员还进
行了耐盐突变体细胞超微结构的观察。研究发现 ,耐盐突变体的结构和染色体数发生了变化[9 ,42 ] ;但有
些报道称耐盐植株结构并没有发生变化[43 ] 。
仅仅通过测定耐盐变异系无机盐离子的积累和脯氨酸含量的增加等因子不足以证明它们的基因组
发生遗传变异 ,仍缺少分子水平的有力证据。DNA 分子遗传标记很大程度上弥补了以上不足 ,随着该
技术的广泛应用 ,DNA 分子标记遗传操作与测定正成为定向改良研究的主要手段。目前 ,耐盐突变体
分子鉴定多采用 RFLP ,RAPD 标记。试验发现[44 ] ,耐盐突变体染色体的连锁位点发生了明显的突变 ,多
数突变是由缺失、插入或重组造成的 ,耐盐性受一个主效基因控制 ,而耐盐性不仅受核基因的控制 ,还受
细胞质因子的影响。另外 ,一些人员还进行了耐盐突变体遗传机制的研究[45 ] 。到目前为止 ,在分子水
平上已成功鉴定的耐盐突变体有水稻[44 ] 、小麦[46 ] 、芦苇[42 ] 、豆瓣菜[8 ] 、小黑麦[45 ] 、大豆和苜蓿[47 ]等。
3 　问题讨论
(1)耐盐细胞系难以再生完整植株。由于植物耐盐性是多性状的综合表现 ,受多基因控制 ,基因表
达的数目和程度在细胞与植株两种水平上可能会不完全相同 ,从而导致两种水平的耐盐性表现不一致 ,
或部分相关。一般讲 ,受单基因突变控制的耐盐一致性会大些。另一方面 ,在辐射处理和盐胁迫时 ,细
胞受到不同程度的伤害 ,同时长期耐盐筛选 ,这些因子均可使一些有潜力的突变细胞丧失分化能力 ,不
能再生植株。因此 ,在利用细胞或组织培养筛选耐盐突变体时 ,首先要建立高频再生体系 ,改进胁迫培
养程序 ,获得较高分化能力的细胞系。同时 ,有必要在诱变剂量的大小、细胞伤害程度及细胞再生完整
植株能力的三者关系上做进一步的研究。通过细胞超微结构变化 ,寻求在辐射剂量、细胞损伤、细胞再
生和筛选耐盐植株上获得最佳组合 ,提高耐盐植株再生能力 ,为植物抗性诱变育种工作的开展提供良好
的依据。
(2)在筛选耐盐突变体过程中 ,利用离体培养的器官、组织等材料进行诱变处理 ,存在严重嵌合体现
象 ,为突变体的筛选和鉴定带来困难 ,且突变频率很低 ,大大影响筛选效率。根据悬浮细胞的特性 ,以及
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悬浮培养在筛选耐盐突变体的优越性和成功报道 ,该技术有望成为今后筛选耐盐突变体的主要手段。
(3)由于目前突变体选择只是针对耐盐这一性状进行的研究 ,往往缺乏与其他性状的综合考虑 ,造
成选择的耐盐突变体在抗性、育性、产量、品质等方面的不协调问题。随着现代科学技术的不断发展 ,将
耐盐体细胞突变体育种与常规育种、染色体工程、基因工程研究等相结合 ,综合各种优良性状 ,培育出耐
盐、丰产、品质优良的新品种 ,势必成为开发利用盐渍土的一条行之有效的途径 ,也将为农林业生产实践
带来巨大的经济效益。
致谢 :本研究由北京林业大学研究生院资助 ,特此感谢。
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312 　中优 306
中优 306 全生育期 120d ,比汕窄 8 号早 7d。该组合分蘖力中等 ,株高 94cm ,穗长 2418cm ,穗着粒 140
粒左右 ,结实率 85 %左右 ,千粒重 2615g。后期转色好。2002 年在品比试验中列第 2 名 ,产量 6186tΠhm2 ,
比汕窄 8 号增产 6146 % ,米质优 ,是一个早熟、产量较高 ,有利用前景的组合。
此外 ,与辐 74A、协青早 A、D702A、Ⅱ232A (倒差期) 等不育系配组 ,其产量都比相应熟期的对照增
产。辐恢 306 的生育期比大田种植 (或制种) 的生育期要早 25d 左右抽穗 ,完全可以采取时间隔离使该
恢复系制种不受自然条件的约束。由于生育期短 ,时间上也错开了农时季节 ,有效地避免一些有为的机
械混杂 ,同时也保证种子纯度。现在农村都在向多元化种业发展 ,1 代种生育期早 ,收后可增种一季经
济作物 ,如蔬菜、秋土豆等 ,是稳定粮食产量 ,增加经济收入的一条有效途径。可见 ,辐恢 306 与不同生
育期的不育系可配制出不同生育期的 1 代种 ,适应不同的生态环境 ,栽培技术 ,耕作制度 ,茬口衔接等 ,
具有广阔的应用前景。
(上接第 452 页)
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