全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 012029204
辐射亚洲百合‘pollyanna’雄性不育突
变体的 RAPD 分析
贾月慧1 　张克中1 　赵祥云1 　黄善武2 　陆长旬2 　张启翔3
(11 北京农学院 ,北京　102206 ;21 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ,
北京　100081 ;31 北京林业大学 , 北京　100083 )
摘 　要 :利用 80 个 10bp 随机引物对亚洲百合‘pollyanna’及辐射种球诱导出的 20 个表现型雄性
不育突变体进行了 RAPD 分析。其中有 31 个引物对所有材料都能扩增出理想的带型 ,有 4 个
随机引物扩增出的带型显示其中的‘P1G03’、‘P2G04’等 9 个突变体与‘pollyanna’基因组 (可育
系)之间具有稳定的多态性差异。它们表现出与‘pollyanna’差异的多态性位点有 7～18 个 ,表
明它们为‘pollyanna’的基因型突变体。
关键词 :百合 ;辐射育种 ;雄性不育 ;RAPD 分析
RAPD ANALYSIS ON MALE STERILITY MUTANT OF Lilium ASIATIC HYBIDS
‘POLLYANNA’INDUCED BY IRRADIATION
J IA Yue2hui1 　ZHAO Xiang2yun1 　ZHANG Ke2zhong1 　
HUANG Shang2wu2 　LU Chang2xu2 　ZHANG Qi2xiang3
(11 Beijing Agricultural College , Beijing 　102206 ;
21 Institute of Vegetable and Flowers , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing , 100081 ;
31Beijing Forestry University , Beijing , 100083)
Abstract :RAPD analysis of 80 random 102mer primers on Lilium Asiatic hybids ’pollyanna’and its 20 phenotype
male sterility mutants induced by irradiation was carried out1 Of the tested primers , 31 primers could produced ideal
amplification bands on all materials , 4 primers generated stable different polymorphic bands among 9 mutants and
‘pollyanna’1 Different polymorphic bands of 7～18 were found among 9 mutants and‘pollyanna’1 It was showed
that 9 mutants were phenotype male sterility mutant of‘pollyanna’1
Key words :lily ; irradiation breeding ; male sterility ; RAPD analysis
收稿日期 :2003211217
基金项目 :北京市自然科学基金资助项目 (39770457) 、北京市科技新星项目 (2003B13)
作者简介 :贾月慧 (1970 - ) , 女 ,河北藁城人 ,讲师 ,从事植物营养与育种工作。电话 :010 80796343 ; E2mail :gssjxy @sohu. com百合花粉容易粘着在花瓣、衣物及人们的手上 ,培育少花粉或无花粉百合品种具有重要商业价值。雄性不育常表现为无雄蕊 ,或者雄蕊萎缩 ,或者无花粉 ,或者花粉不具有活力[1 ] 。因此通过创造百合雄性不育 ,可以达到减少花粉色素污染的目标。另外 ,雄性不育种质的获得 ,免去了去雄的麻烦 ,有利于百合的杂交育种。因此 ,雄性不育又具有育种学上的重要价值。1998 - 2002 年期间 ,我们以60 Co 辐射亚洲百合‘pollyanna’种球 ,辐射后剥取外部鳞片扦插诱发不定芽植株[2 ] ,并精心培育至开花 ,开花时初选出24 个表现型突变体 ,其中 20 个为表现型雄性不育突变体[3 ] 。由于突变体是植物基因组少数位点发生突变的结果 ,因而其检测相对困难。RAPD 挑选随机引物方便 ,实验相对简单 ,能在很短时间内使用较多引物探测到大量的 DNA 位点 ,这为区分突变体提供了可能。人们通过 RAPD 鉴定出菊花[4 ] 、美洲黑
92　核 农 学 报　2005 ,19 (1) :29～32Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
杨[5 ] 、白薯[6 ] 、水稻[7 ] 等植物中发生的各种突变体便是很好的例证。已有人采用 RAPD 技术验证了水
稻[8 ] 、小麦[9 ]等植物辐射诱变后获得的突变体 ,但 RAPD 用于百合突变体的选育方面还没有相关报道。
本论文采用 RAPD 分子标记技术 ,对亚洲百合‘pollyanna’及 20 个表现型雄性不育突变体进行 RAPD 分
析 ,旨在从 DNA 水平进行早期筛选 ,淘汰非遗传因素形成的雄性不育个体 ,加快遗传性雄性不育突变体
的选育进程。
1 　材料与方法
111 　试验材料
亚洲百合‘pollyanna’及其 20 个表现型雄性不育突变体即‘P1G01’、‘P1G03’、‘P1G04’,‘P1G06～
13’、‘P2G01’、‘P2G04’、‘P2G05’、‘P2G09～12’、‘PCK01’、‘PCK02’。
112 　试验方法
11211 　DNA 的提取 　采用 CTAB 法进行提取 : ①取 013g 百合新鲜嫩叶液氮研磨至粉末 ; ②将叶片粉末
冲入 115ml 离心管中 ,加入预热的 CTAB ,60 ℃水浴保温 30min ,其间轻轻倒转离心管数次 ; ③加入等体积
的 CI(氯仿∶异戊醇体积比 24∶1) ,轻轻颠倒混匀数次 ,10000rpm 离心 8min ; ④加入 Rnase 酶至终浓度
10ugΠL ,37 ℃保温 1h ; ⑤用 CI再抽提 1 次 ,10000rpm 离心 8min ,取上相转入新的离心管中 ; ⑥加入 2 倍体
积的无水乙醇 ,混匀 ,置于 - 20 ℃冰箱 30min ,可观察到白色絮状沉淀 ; ⑦12000 转离心 10min ,用 70 %乙
醇冲洗沉淀 2 次 ,再用无水乙醇冲洗 1 遍。⑧风干沉淀 ,溶于适量 TE(200μL) 。
11212 　PCR 反应 　反应体系为 :25μL 反应体积 DNA 模板浓度为 40～100ng ;10 ×buffer 215μl ;MgCl2 215
～315mmol·L - 1 ;dNTP200μmol·L - 1 ; TaqDNA polymerase 115 单位 (U) ;引物浓度为 1615ng。用到的引物有
A012A20 ,B012B20 ,E012E20 ,F012F20 ,T012T20 等 80 条 (引物购自赛百盛公司 ,序列同 Operon 公司引物序
列) 。Marker D01522 购自鼎国生物技术公司。
扩增程序为 :94 ℃3min 预变性 ;94 ℃变性 50s ,36 ℃复性 40s ,72 ℃延伸 1min20s ,41 个循环 ;94 ℃变性
50s ,36 ℃复性 40s ,72 ℃延伸 10min ,1 个循环 ;4 ℃保温。扩增仪器为 PE - 480PCR DNA 扩增仪 ,试验在北
京农学院北京农业新技术实验室进行。
11213 　电泳检测　反应物在 112 %琼脂糖胶上 ,以 315VΠcm 电场强度电泳 210～215h。紫外检测仪观察
并照相。
2 　结果与分析
80 个随机引物中 ,能全部扩增出 RAPD 带的引物有 31 个。有 4 个引物显示出它们与‘pollyanna’之
间能产生稳定多态性差异 ,重复 3 次的扩增图谱相同 (图 1) 。
在 20 个表现型雄性不育突变体中有 11 个表现型雄性突变体与‘pollyanna’RAPD 带谱之间没有差
别。另外的 9 个表现型雄性不育突变体为‘P1G03’、‘P2G04’、‘P2G05’、‘P1G06’、‘P1G08’、‘P2G09’、
‘P2G10’、‘P2G11’、‘P1G13’。由图 1、表 1 可以看出 ,9 个突变体与‘pollyanna’四引物扩增图谱多态性
差异表现为两种情况 :一是不育的突变体比原可育植株增加了扩增片段 ,二是不育比可育减少了扩增片
段。
突变体按多态性位点数从多到少排序依次为‘P1G08’、‘P1G06’、‘P1G13’、‘P2G09’、‘P2G11’、
‘P2G04’、‘P2G10’、‘P2G05’、‘P1G03’。它们与可育相比 ,出现的多态性位点数依次为 18、15、14、12、10、
10、9、9、7 (表 1) 。这表明 :与‘pollyanna’相比较 ,上述 9 个表型雄性不育突变体的 DNA 组成已发生了变
化 ,可初步判定为基因型突变体。
3 　讨论
辐射产生的表现型雄性不育突变体 ,可能是遗传因素 (基因突变) 、环境因素 (如高温、干旱、弱光等
03 核　农　学　报 19 卷
图 1 　‘pollyanna’及其 9 个雄性不育突变体 4 个引物的 RAPD 图谱
Fig. 1 　RAPD maps of‘pollyanna’and its nine phenotype male sterility mutants
M代表 Marker D01522 ;0 号代表‘pollyanna’,其它电泳编号对应的突变体为 :5 号代表 P1G03 ;10 号代表 P2G04 ;11 号代表 P2G05 ;
13 号代表 P1G06 ;17 号代表 P1G08 ;19 号代表 P2G09 ;22 号代表 P2G10 ;23 号代表 P2G11 ;29 号代表 P1G13
M means Marker D01522 ;No 0 means‘pollyanna’; No15 means P1G03 ; No110 means P2G04 ; No111 means P2G05 ;
No113 means P1G06 ; No117 means P1G08 ; No119 means P2G09 , ;No122 means P2G10 ; No123 means P2G11 ; No129 means P1G03
表 1 　9 个雄性不育突变体与‘pollyanna’相异的多态性检测位点
Table 1 　Detected polymorphic RAPD bands of 9 male sterility mutants and‘pollyanna’(bp)
引物 primers P1G03 P2G04 P2G05 P1G06 P1G08 P2G09 P2G10 P2G11 P1G13
2200 -
1900 - 1900 - 1900 - 1900 - 1900 - 1900 -
A06 1500 - 1500 - 1500 - 1500 - 1500 - 1500 -
1400 - 1400 - 1400 - 1400 - 1400 -
1100 -
1050 - 1050 - 1050 - 1050 - 1050 - 1050 - 1050 - 1050 - 1050 -
750 -
700 -
2500 - 2500 -
900 - 900 - 900 - 900 - 900 -
A07 700 - 700 - 700 - 700 -
600 + 600 +
550 +
300 + 300 + 300 + 300 + 300 + 300 + 300 +
1300 +
1000 + 1000 +
650 + 650 +
B07 600 +
500 - 500 - 500 -
450 + 450 + 450 + 450 + 450 + 450 +
2500 + 2500 + 2500 + 2500 + 2500 + 2500 + 2500 + 2500 +
1700 - 177 -
1500 +
T09 1200 + 1200 + 1200 + 1200 + 1200 - 1200 - 1200 - 1200 -
1000 + 1000 + 1000 + 1000 + 1000 - 1000 - 1000 - 1000 -
910 + 910 + 910 + 910 + 910 - 910 - 910 - 910 - 910 -
450 +
合计(条) total bands 7 10 9 15 18 12 9 10 14
　　注 :数字后的‘+ ’号、‘ - ’号分别表示与可育‘pollyanna’相比增加或减少的扩增片段。
Note :The‘+ ’or‘ - ’following data in table means the increase or default amplified segment compared with the male fertile‘pollyanna’,respectively。
13　1 期 辐射亚洲百合 ’pollyanna’雄性不育突变体的 RAPD 分析
不育环境条件) 、或诱导因素 (辐射产生的生物学效应)等引起的。辐射诱变处理第 1 代可检测的一个重
要生物学效应就是 M1 或 V1 植株的不育性。这种不育性有各种解释 ,包括点突变、染色体畸变 (如缺失
或易位等) 、细胞质突变和生理效应[10 ] ;因而这种不育性可能是遗传的 ,也可能是非遗传的 (可恢复的) 。
常规检测雄性不育突变体的方法是采用表现型检测 ,如观察雄性器官的形状异常情况、检测花粉有
无及花粉活力的大小等。表现型检测是选育雄性不育突变体的第一步 ,其结果虽直观但往往不可靠。
DNA 分子标记检测由于直接对基因组进行检测 ,其灵敏性及可靠性都较高。表现型检测与分子标记检
测的结合 ,可以提高选育效率[4 ] 。
表现型检测发现的 20 个雄性不育突变体 ,经过 RAPD 分子标记检测 ,有 11 个 DNA 组成未发生变
化 ,表明它们是由于非遗传因素引起的雄性不育 ;另外 9 个雄性不育突变体的 DNA 组成与‘Pollyanna’相
比发生了明显的变化 ,可初步确定它们为基因型突变体。RAPD 检测虽能表明突变体 DNA 组成发生了
变化 ,但并不能说明此突变体是基因型雄性不育突变体。因为某些生化突变或抗逆性突变的 DNA 组成
也发生变化 ,但从外观上不一定能表现出来。另外 ,基因型突变也可能因为突变修复、突变死亡而产生
突变消失。因此 ,我们还需进行无性系比较、遗传稳定性观察等进一步的研究 ,才能最后确定上述 9 个
基因型突变体是否为稳定的基因雄性不育突变体。尽管如此 ,早期的 RAPD 分子标记检测淘汰了部分
非遗传因素引起的雄性不育 ,缩小了真突变体的选择范围 ,提高了选育效率。
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