全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 022192204
节杆菌属甲基对硫磷的降解菌株
L2W 的分离及降解特性
李海雷　孙宏春　张奇志　王文亮　孙守义　王守经　闫安泉　李志国
(山东省农科院原子能农业应用研究所 ,山东 济南　250100)
摘 　要 :从生产甲基对硫磷的华阳农药厂污水曝气池中 ,分离到 1 株能以甲基对硫磷及其降解中间产物
对硝基苯酚为唯一碳源生长 ,且能够将其彻底降解为 CO2 和 H2O 的细菌 L2W ,经鉴定 ,为节杆菌属
( Arthrobacter sp) 。用气相色谱法和分光光度计法深入研究了L2W 的降解能力 ,其 7h 内对 50mgΠL 甲基对
硫磷的降解率为 85 % ,对 50mgΠL 对硝基苯酚的降解率为 99 %。
关键词 :甲基对硫磷 ;对硝基苯酚 ;节杆菌 ;降解能力
ISOLATION OF METHYLPARATHION DEGRADING STRAIN L2W AND ITS DEGRADABILITY
LI Hai2lei 　SUN Hong2chun 　ZHANG Qi2zhi 　WANG Wen2liang 　SUN Shou2yi
WANG Shou2jing 　YAN An2quan 　LI Zhi2guo
( Institute for Application of Atomic Energy , Shandong Academy of Agricultural Science , Jinan , Shandong 　250100)
Abstract :A strain , which can use methylparathion , and its degradation substrateρ2nitrophenol as source of carbon , was
isolated from polluted water pool of Huayang Pesticide Plant . The strain was identified as Arthrobacter sp. and named L2W. L2
W’s degradability was analysied at different pH and temperature conditions by using gas chromatography and
spectrophotometer. The results showed that the removal rate of L2W reached to 85 % of original when the concentration of
melthylparathion was 50mgΠL ; and 99 % when the concentration ofρ2nitrophenol was 50mgΠL within 7h , respectively.
Key words : methylparathion ;ρ2nitrophenol ; Arthrobacter sp ; degradability
收稿日期 :2007206218 　接受日期 :2007209210
作者简介 :李海雷 (19802) ,男 ,山东济南人 ,研究实习员 ,从事辐照加工及微生物检测研究。E2mail :haileil @1261com　　甲基对硫磷 (methylparathion ,本文简写为 MP) 是一类广泛使用的高毒有机磷农药 ,又称甲基 1605 ,其主要的中间代谢产物为对硝基苯酚 (ρ2nitrophenol ,本文简写为 PNP) ,易溶于水 ,有中等毒性 ,由于其具苯环结构 ,残留期很长 ,给人类健康带来潜在的威胁。许多发达国家已经禁用或限用MP ,但由于该类农药杀虫效果好 ,见效快且价格便宜 ,我国目前仍在大量生产使用 ,由此引发的环境问题日益突出[1 ] 。常规的化学方法处理会形成新一轮的污染。本文报道了 MP 降解菌株———L2W 的分离过程 ,以及对MP 和中间产物 PNP 的降解效果。1 　材料与方法111 　材料MP 购自华阳农药厂 ,原药含量 80 % ; PNP 购自天 津市天新精细化工开发中心。基础培养基、富集培养基、普通培养基见参考文献[2 ] 。筛选菌株的污水取自华阳农药厂污水曝气池。112 　细菌的富集培养与分离纯化取华阳农药厂污水曝气池中的污水悬浊液离心 ,称取 3g 污泥置于 100ml 富集培养基中 ,添加 100mgΠL的MP 于 30 ℃、130rΠmin 摇床培养 ,以后每周移种 1 次 ,即以 15 %的接种量接入新的培养基中 ,每次移种都要以 100mgΠL 的梯度递增增加 MP 浓度 ,直至 500mgΠL ,然后用基础培养基代替富集培养基 ,每隔 1～2 周移种1 次 ,MP 的浓度一直保持 500mgΠL ,如此驯化 1 个月 ,最后用平板涂布法在普通培养基上进行细菌分离纯化[3 ,4 ] 。113 　细菌的鉴定
291　 核 农 学 报　2008 ,22 (2) :192～195Journal of Nuclear Agricultural Sciences
将分离得到的菌株按照参考文献[4～6]进行鉴定。
首先观察菌落形态 ,再在显微镜下观察菌体形态 ,结合
生理生化反应 ,综合考虑后参照文献检索表 ,可初步鉴
定出菌株的种属。具体步骤请参照文献[4～6]。
114 　菌株降解能力的测定
让菌株L2W 在 500mgΠL MP 为唯一碳源的基础培
养基平板上生长 ,从其水解圈的大小初步判定 L2W 的
降解能力。参照文献 [ 7 ]用气相色谱法测定 L2W 对
MP 的降解率 ,测定底物减少和产物生成 ,对照的标样
浓度为 50mgΠL ,在本试验条件下 MP 的出峰时间为
51787min。
11411 　气相色谱法检测 L2W 的降解能力 　将 L2W 在
牛肉膏蛋白胨培养基上培养至对数期 (OD600 016～
018) ,离心收集 ,以 20 %接种量转接至含 50mgΠL MP 的
pH值为 7 的基础培养基上 ,30 ℃振荡培养 ,定时取样 ,
以加 MP 但不接菌的基础培养基为对照。样品处理如
下 :离心培养液 ,取上清加入 215 倍体积二氯甲烷 ,涡
旋器上混匀 3min ,静置 1h 后去上清 ,加入无水硫酸钠
脱水 ,置 4 ℃冰箱 ,一并检测。气相色谱条件 :载气为
99199 %的高纯 N2 , 压力为 7314kpa ; 氢气流量为
8010mlΠmin ;空气流量为 12010mlΠmin ;色谱柱型号为
1252503j db25 ,长度 3010m ,内径 0153mm ,膜厚 1100μm ;
检测器为火焰光度检测器 ,温度 25010 ℃;柱温 190 ℃;
进样口温度 210 ℃;直接法进样 ,进样量 2μl。
11412 　菌株 L2W 接种量对降解能力的影响 　将 L2W
在牛肉膏蛋白胨培养基上培养至对数期 (OD600 016～
018) ,离心收集 ,转接至含有 50mgΠL MP 或 50mgΠL PNP
的 pH 值为 7 的基础培养基上 ,分别按体积比 5 %、
10 %、15 %、20 %、30 %的接种量接种 ,30 ℃振荡培养 ,
定时取样 ,用分光光度计[3 ] 在 273nm 处测定 MP 的降
解 ,在 405nm 处测定 PNP 的降解 ,以加农药但不接菌
的基础培养基为对照。
11413 　培养条件对L2W 降解能力的影响 　将 L2W 在
牛肉膏蛋白胨培养基上培养至对数期 (OD600 016～
018) ,离心收集 ,研究 pH 值的影响是按接种量 20 %将
菌转接至含有 50mgΠL MP 和 50mgΠL PNP 的基础培养
基上 ,pH值分别为 6、7、8、9、10 ,30 ℃振荡培养 ;测定温
度的影响是按接种量为 20 %转接至含有 50mgΠL MP 和
50mgΠL PNP 的基础培养基上 ,pH 值为 7 ,20 ℃、25 ℃、
30 ℃、37 ℃振荡培养。均定时取样 ,以加农药但不接菌
的基础培养基为对照 ,分光光度计测定不同 pH 值和
温度对L2W 降解能力的影响。
11414 　农药浓度对L2W 降解能力的影响 　将在牛肉
膏蛋白胨培养基上培养至对数期 (OD600 为 016～018)
的L2W 离心收集 ,按接种量为 20 %转接至含有 50mgΠ
L、100mgΠL MP 和 50mgΠL、100mgΠL PNP 的基础培养基
上 ,pH值为 7 ,30 ℃振荡培养 ,定时取样 ,以加农药但不
接菌的基础培养基为对照 ,分光光度计测定不同浓度
MP 和 PNP 对L2W 降解能力的影响。
115 　菌株L2W 对农药最大耐受浓度的测定
将L2W 接入牛肉膏蛋白胨上生长至对数期 (OD600
为 016～018) ,按 20 %接种量转接入含有一定浓度农
药、pH值为 715 的基础培养基中 ,30 ℃振荡培养 ,培养
24h 后离心收集菌体 ,当菌体增多时 ,继续增加农药的
浓度培养菌株 ,当菌体量很少且呈黑色时 ,那么比该浓
度小的上一个测定浓度即为最大耐受浓度[13 ,14 ] 。
2 　结果与讨论
211 　菌株L2W 的分离
分离纯化得到 56 株菌株 ,从中选出 1 株降解能力
最强生长最为旺盛的菌株命名为 L2W ,进行进一步的
鉴定。
21111 　细菌形态和生理生化水平鉴定 　在普通培养
基上培养 48h 后 ,菌株 L2W 全部或大部分是由大小均
一的球状细胞组成 ,48h 以前则是杆状 ,在培养过程中
从长杆菌逐渐变短 ,且培养时间越长菌体越短 ,直到变
为球菌 ,具有明显的球杆变化周期。如图 12A、B、C 所
示 ,在不同的培养时间内 ,L2W 呈不同的形状。杆菌的
排列彼此按一定角度呈“V”或“Y”型 ,无鞭毛 ,不运动 ,
不产生芽孢、液化明胶 ,不水解淀粉 ,还原硝酸盐为亚
硝酸盐 ,氧化葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、蔗糖、木糖和
乙醇 ,不氧化山梨醇和甘露醇。脲酶实验呈阳性 ,产氨
实验呈阳性 ,不产生吲哚 ,产生 H2 S ,不含卵磷脂酶 ,牛
奶分解实验产碱。最适生长温度为 20 ℃～37 ℃,在 pH
值为 6～10 的范围内可以生长 ,最适生长 pH 值 7～8。
将菌株 L2W 分别接入到牛肉膏蛋白胨培养基、加
500mgΠL MP 的牛肉膏蛋白胨培养基和加 500mgΠL MP
的基础培养基中 ,在 600nm 处测定其吸光值 ,结果表明
在加有农药的情况下菌株的生长受到一定的抑制 ,在
营养条件很差的情况下菌株生长受到很大影响 ,生长
非常缓慢。
21112 　分子生物学水平鉴定 　细菌 16srDNA PCR 扩
增的通用引物为 R : 5′到 3′GGC TAC CTT GTT ACG
ACT ,F : 5′到 3′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG[8～10 ] 。
用通用引物扩增出菌株 L2W 的 16srDNA 序列 , 在
Genebank blast 程序上比较 ,得出 L2W 为节杆菌属。结
合生理生化性质得出L2W 为简单节杆菌。　　　
391　2 期 节杆菌属甲基对硫磷的降解菌株L2W的分离及降解特性
图 1 　菌株 L2W的透射电镜图 ( ×20000)
Fig. 1 　Transmission electron micrograph of strain L2W
A : 培养 18 小时 ; B :培养 36 小时 ; C :培养 48 小时以上
A : incubate 18 hours ;B : incubate 36 hours ;C : incubate more than 48 hours
212 　菌株L2W 降解性能的研究
21211 　L2W 降解能力的初步鉴定 　如图 2 所示。菌
株L2W 在 500mgΠL MP 为唯一碳源的基础培养基平板
上生长良好 ,能产生较大水解圈。
图 2 　菌株 L2W在 500mgΠLMP为唯一碳源的
基础培养基平板上的水解圈
Fig. 2 　The hydrolyze halo of strain L2W on the mineral
media with 500mgΠL MP as sole source of carbon
21212 　气相色谱法测定 L2W 对 MP 的降解率 　为了
精确 L2W 对 MP 的降解能力 ,采用了灵敏度较高的气
相色谱法 ,其结果如图 3 所示。
降解率 = (初始吸收峰面积 - 终止作用时的吸收
峰面积)Π初始吸收峰面积[11 ,12 ] , L2W 对 MP 的降解率 ,
5h 为 85 % ,7h 为 99 %。图 A 中第一个峰为处理样品
所用的溶剂二氯甲烷的特征吸收峰 ,第二个峰为所测
样品甲基对硫磷的特征吸收峰。图 B ,C 中的峰同图
A。
21213 　菌株L2W 接种量对降解能力的影响 　经测定 ,
在一定范围内 ,随着接种量增加降解能力上升 (图 4) ,
L2W 的接种量为 30 %时其降解效率最佳。
21214 　pH值、温度、MP 或 PNP 浓度对 L2W 降解能力
的影响 　经测定 ,L2W 在接种量为 20 %时 ,随着 pH 值 图 3 　菌株 L2W降解 MP的气相色谱图Fig. 3 　Degradation to MP by L2W determined witj GCA :对照峰面积为 307129041 (MP 50mgΠL) ; B : 5h 后取样峰面积为133289651 (MP 16166mgΠL) ;C :7h 后取样峰面积为 14830598 (MP01049mgΠL)A :the apex area of control is 344855207 (MP 50mgΠL) ; B : after 5 h is136705524 (MP 16166mgΠL) ; C :7 h later is 4251051 (MP 01049mgΠL) )升高其降解性能先上升后下降 ,随着培养温度升高降解性能也是先上升后下降 ,随着 MP 和 PNP 浓度的升高降解性能逐渐下降 (图 4) 。综上可知 ,L2W 在 30 ℃、pH7、接种量为 20 %、MP 和 PNP 的浓度为 50mgΠL 时其
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图 4 　L2W接种量对其降解力的影响
Fig. 4 　The influence of inocubator quantity
for the degradability of L2W
A :L2W接种量对其降解 MP 的影响 ;
B :L2W接种量对其降解 PNP 的影响。
A :The influence of incubator quantity of L2W for the degradation of MP ;
B :The influence of incubator quantity of L2W for the degradation of PNP
图 5 　L2W在最适 pH值、温度、MP或
PNP浓度下的降解曲线
Fig. 5 　Degradation curve of L2W at optimum pH ,
temperature and concentration of MP and PNP
降解性能最佳 ,此时的降解率为 99 %(图 5) 。
21215 　菌株L2W 对其他有机磷类农药的降解 　经测
定 (图 6) ,L2W 20h 内对甲胺磷的降解率为 68 % ,对毒
死蜱的降解率为 36 % ,对克百威的降解率为 33 % ,表
明L2W 对其他有机磷农药也有良好的降解作用。
图 6 　L2W对其他有机磷农药的降解曲线
Fig. 6 　Degradation curve of L2W for other
organophosphorus pesticides
21216 　菌株 L2W 对 MP 及其他有机磷农药的最大耐
受浓度 　测定表明菌株L2W 对 MP 的最大耐受浓度是
1700mgΠL ,对甲胺磷的最大耐受浓度为 500mgΠL ,对毒
死蜱和克百威的最大耐受浓度为 300mgΠL。
3 　结论
经形态、生理生化及 16s rDNA 分析 ,将 L2W 鉴定
为节杆菌 ,该菌株在生长过程中具有明显的球杆变化 ,
培养初期为长杆菌 ,随着时间的增加逐渐变短 ,老龄培
养物全部为球形。所有的生理生化性质均与节杆菌相
吻合。经过对 L2W 的降解性能研究发现 :L2W 对 MP
和 PNP 有良好的降解效果 ,7h 的降解率为 99 % ;达到
最佳降解率的接种量为 20 % ,最适 pH 值为 7 ,最适温
度为 30 ℃;L2W 对 MP、PNP、甲胺磷、毒死蜱、克百威的
最大耐受浓度分别为 1700、500、500、300、300mgΠL。由
此可知 ,L2W 是对有机磷农药具有强降解能力 ,不但可
以降解 MP ,而且可以同步降解其反应的中间产物
PNP ,在培养过程中几乎检测不到 PNP 的存在 ,类似菌
株国内外报道较少。国外对节杆菌的研究限于对其他
污染物的研究 ,在降解有机磷农药方面的研究尚未见
报道。国内对节杆菌的研究也比较少 ,仅限于分类鉴
定方面的研究。
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(下转第 159 页)
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2514 ±1014Gy[1 ] 。本研究结果表明 ,在辐照剂量为 20、
25Gy 时山茶扦插成活率明显下降 ,且远低于对照 ,部
分成活率为 0 ,而在 5、10 或 15Gy 时成活率提高 ,部分
物种或品种的成活率高于对照。不同山茶扦插生根的
平均根数、平均根长和最长根长分别在 5～15Gy 达最
大值 ,且高于对照 ,之后随剂量升高 ,出现降低趋势。
说明低剂量辐照能促进山茶扦插生根 ,而高剂量具抑
制作用 ,其内在的遗传及生理机制还有待于进一步深
入研究。不同山茶经辐照后扦插成活率及生根特性的
变化趋势不同 ,不同种或品种扦插成活率、平均根数、
平均根长和最长根长达到最大值时的辐照剂量也不完
全相同 ,这可能是由于山茶基因型不同造成的。
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