全 文 ：收稿日期 :2008204203 　接受日期 :2008206204
基金项目 :国家自然科学基金项目 (编号 30760126) ,广西科技攻关项目 (桂科攻 053700724)和广西创新能力建设项目 (桂科能 04430226)
作者简介 :周生茂 (19702) ,男 ,广西桂林人 ,博士生 ,农艺师 ,专业方向为植物基因组及其分子调控。Tel :077123247318 ; E2mail : maomaozhou70 @
gmail . com
通讯作者 :曹家树 (19582) ,男 ,湖南芷江人 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,专业方向为植物基因组及其分子调控。Tel :0571286971188 ; E2mail : jshcao @
zju. edu. cn
文章编号 :100028551 (2008) 062781207
山药 PAL 基因全长 cDNA 序列的克隆、表达与分析
周生茂1 ,2 　王玲平3 　向　　　韦本辉4 　李杨瑞5 　方锋学2 　韦威旭4 　曹家树1
(11 浙江大学蔬菜研究所 ,浙江 杭州　310029 ;21 广西农业科学院蔬菜研究所 ,广西 南宁　530007 ;
31 浙江农业科学院蔬菜研究所 ,浙江 杭州　310021 ; 41 广西农业科学院经济作物研究所 ,广西 南宁　530007 ;
51 广西农业科学院省重点实验室 ,广西 南宁　530007)
摘 　要 :为了阐明苯丙氨酸解氨酶 (PAL , EC 41 31115)基因在山药地下块茎酚类物质积累过程中的分子
机理 ,本研究运用普通 PCR、RACE和 TAIL2PCR 技术从大薯 ( Dioscorea alata L. )’Zixiao’地下块茎中克隆
到同一个 PAL 基因的 3 个片段 ,即长度分别为 1 145bp、1 151bp 和 424bp 的中间片段、3’端和 5’端的
cDNA 序列 ;将 3 段 cDNA 序列拼接后获得大小为 2 376bp 的 PAL 基因全长 cDNA 序列 ,该序列含有一个
1986bp 的最大开放阅读框 (ORF) ,一个 28bp 的 5’端非翻译区 ,一个 362bp 含 25 nt 的 Poly(A+ )尾的 3’端
非翻译区 ,最大 ORF 可推测编码一个包括 PAL 酶活性中心的特征序列 ( GTITASGDLVPLSYIA)在内的 661
个氨基酸的多肽 ,分子量为 711974kDa ,等电点 61310 ;大薯地下块茎的 PAL 基因分别在核苷酸与氨基酸
水平上和 GenBank 中所选已知其他物种的同源性为 73 %～77 %和 76 %～82 % ,说明 PAL 基因在系统
进化上相对保守 ;RT2PCR 分析表明该基因仅在地下块茎中表达 ,而且表达丰度在收获前逐渐降低。
关键词 :大薯 ;苯丙氨酸解氨酶 ;全长 cDNA ;基因克隆 ;序列分析 ;时空表达
CLONING, EXPRESSION AND ANALYSIS OF A FULL2LENGTH cDNA SEQUENCE
ENCODING PAL IN YAM
ZHOU Sheng2mao1 , 2 　WANGLing2ping3 　XIANG Xun1 　WEI Ben2hui2
LI Yang2rui5 　FANG Feng2xue2 　WEI Wei2xu2 　CAO Jia2shu1
(11 Institute of Vegetable Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029 ;
21 Institute of Vegetable Science , Guangxi Academy of Agriculture Science , Nanning , Guangxi 　530007 ;
31 Institute of Vegetable Science , Zhejiang Academy of Agriculture Science , Hangzhou , Zhejiang 　310021 ;
41 Institute of Economical crops , Guangxi Academy of Agriculture Science , Nanning , Guangxi 　530007 ;
51 Province Key Laboratory , Guangxi Academy of Agriculture Science Nanning , Guangxi 　530007)
Abstract :To elucidate molecular mechanisms in the effects of phenylalanine ammonia2lyase ( PAL , EC 4131115) gene on
phenols accumulation in the underground tuber of yam , in the present study , the cDNA sequences of middle segment , 3’2and
5’2ends in the same PAL gene were isolated from the underground tuber of Dioscorea alata L. cv. ’Zixiao’by traditional
PCR , RACE and TAIL2PCR with the designed primers , which were 1 145bp , 1 151bp and 424bp in sizes , respectively. The
three cDNA segments were combined and constituted a full2length 23762bp cDNA sequence of PAL gene , which contains a
19862bp largest open reading frame (ORF) , a 282bp 5’noncoding region , and a 3622bp 3’noncoding region with a 252nt
187　核 农 学 报　2008 ,22 (6) :781～788Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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poly (A + ) . Its largest ORF putatively encodes a polypeptide of 661 amino acids containing the typical sequence of PAL enzyme
activity centre region ( GTITASGDLVPLSYIA) . Both the calculated molecular mass and the theoretical pI of the deduced
polypeptide are respectively 711974kDa and 613101 PAL gene in yam underground tuber shares the similarities of 73 %～77
% and 76 %～82 % at the levels of nucleotides and amino acids , respectively , to those of the selected other plant species
reported in GenBank Database , which indicated that PAL gene was relatively conserved in systematic evolution. Analysis of
the homologous gene expression by RT2PCR showed that it was expressed only in yam underground tuber and its expression
abundance was gradually reduced before the harvesting.
Key words : Dioscorea alata L. ; phenylalanine ammonia2lyase ; full2length cDNA ; gene cloning ; sequence analysis ; spacio2
temporal expression
　　山药 ( Dioscorea spp. ) 为世界上十大食用根茎类作
物之一[1 ] ,其地下块茎除积累大量碳水化合物外 ,还含
有 011 %～015 %酚类物质 ,构成山药块茎抗氧化物质
的主要成分[2 ] 。由于抗氧化物质的摄入量和人类慢性
疾病的发生率成负相关[3 ] ,所以运用现代基因工程技
术有目的地改善山药地下块茎酚类物质的代谢 ,可望
获得富含酚类物质的山药地下块茎。
植物形成酚类物质的第一步关键反应是苯丙氨酸
解氨酶 (phenylalanine ammonia2lyase , PAL , EC 4131115)
催化 L2苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸和氨气 ,该反应
中 PAL 为引导碳素流向酚类物质的限速酶[4 ] 。PAL 自
首次在绿色植物中发现并分离纯化以来[5 ] ,不但其蛋
白结构、分布器官、细胞定位、活性位点和活力等方面
有广泛研究[6 ] ,且近年来在基因的克隆和表达上也获
得了一定进展。烟草[7 ] 、悬钩子[8 ] 、杨树[9 ] 、菜豆[10 ] 、欧
芹[11 ] 、番茄[12 ] 等植物 PAL 基因的克隆和分析显示 ,
PAL 由小的一个基因家族成员所编码 ,通常包括 2～5
成员 ,各成员的表达具有物种、组织和时间的特异性 ,
如悬钩子的 RiPAL1 在果实成熟早期表达 , RiPAL2 在
花和果实发育的后期表达[8 ] ; 而菜豆的 PvPAL1、
PvPAL2 和 PvPAL3 虽然在根中都能大量表达 ,但在叶
片中只有 PvPAL1 表达 ,在花瓣中 PvPAL2 大量表达 ,
PvPAL1 表达量很少 , PvPAL3 则不表达[10 ] 。
山药在我国及其他许多国家食、药兼用 ,对其地下
块茎 PAL 的研究大多数仍集中在生理生化方面[13 ] ;在
分子水平上 ,尽管 Terauchi 和 Kahl[14 ]采用改良的 TAIL2
PCR 技术从山药 D . bulbifera L. 中分离到 PAL 基因的
3 个 5’端侧翼序列 ,但至今未见山药 PAL 基因家族成
员的报道 ,至于山药其他物种 PAL 同源基因的研究更
是空白。所以 ,为了阐明苯丙氨酸解氨酶 ( PAL , EC
4131115)基因在山药地下块茎酚类物质积累过程中的
分子机理 ,本研究以中国普遍栽培食用的大薯 ( D .
alata L. )为材料 ,运用基因克隆相关技术对其地下块
茎 PAL 基因全长 cDNA 序列进行克隆和分析 ,以为未
来利用 PAL 基因调控山药地下块茎酚类物质的积累
提供分子生物学依据。
1 　材料与方法
111 　供试材料和试剂
以种于浙江大学蔬菜所实验基地 (30°16′N ,120°
12′E)的大薯品种‘Zixiao’为材料 ,分别在山药块茎形
成的初前期、盛前期、盛中期、盛后期、后中期和收获期
收取地下块茎及第一片完全叶和地上茎蔓提取总
RNA。Taq DNA 聚合酶、p GEM2T 载体购自 Promega 公
司 ;cDNA 合成试剂盒购自 Clontech 公司。引物合成、
EcoR I、Xbar I、IPTG、X2GaL、T4 DNA 连接酶和 DNA
Ladder Marker 由上海生物工程技术服务有限公司提
供 ;DNA 凝胶回收试剂盒购自 V2gene 公司。
112 　试验方法
11211 　RNA 提取与双链 cDNA 合成　参照 Maríaleonor
等[15 ] 方法提取样品总 RNA。以总 RNA 为模板 ,用
SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit 提 供 的 Reverse
Transcriptase M2MLV、3’端和 5’端的 adaptors 及操作程
序合成双链 cDNA (dscDNA) ,检测合格后用于基因克
隆。
11212 　基因中间片段的获得 　采用软件 Primer
premier 510 设计引物。参照 GenBank 中其他物种 PAL
基因 cDNA 序列及其编码氨基酸序列的保守区域 ,设
计上、下游简并引物 DPF 和 DFR (表 1) 扩增大薯地下
块茎 PAL 基因 cDNA 序列的中间段。反应体系 :014μl
dscDNA(约含 30 ng) , 10 × PCR 反应缓冲液 (含 20
mmolΠL MgCl2 ) 510μl , 110μl dNTP ( 10 mmolΠL ) , 引物
(10μmolΠL)各 4μl ,110μl Taq DNA 聚合酶 (含 115U) ,加
灭菌 ddH2O 至 50μl。扩增条件 :94 ℃预变性 3min ;94 ℃
变性 45 s ,50 ℃退火 50 s ,72 ℃延伸 2min ,共 35 个循环 ;
72 ℃延伸 10min ,4 ℃保存。
11213 　基因 3’端序列的分离　分别根据所得中间序
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列和反转录所用 3’端接头序列设计 RACE扩增该基因
3’端序列的上、下游特异引物 SPF1 和 SPR1 (表 1) 。
PCR反应体系、扩增条件除退火温度为 52 ℃外 ,其他
均与 PAL 基因中间片段的扩增相同。
11214　基因 5’端序列的扩增 　根据 Terauchi 等[14 ]
TAIL2PCR 方法扩增 5’端序列。在所得中间序列的基 础上设计巢式的上游特异引物 SP0～4 共 5 条 (表 1) ,依次距离中间序列 5’端的碱基数 452、280、174、84 和31 个 ,并参照 Terauchi 等[14 ]自行设计随机引物 AP0～9共 10 条为下游引物 (表 1) 。第 1、2、3 轮反应体系参照Terauchi 等[14 ] ,反应条件见表 2。
表 1 　本研究所用的所有引物序列
Table 1 　The primers used in the study
上游引物名称和序列 names and sequences of forward primers 下游引物名称和序列 names and sequences of reverse primers
DPF : 5’2TAYGGTGTNACNACNGGNTT23’ DPR : 5’2TCYTGRTTRTGYTGYTCNGC23’
SPF1 : 5’2TCCATGGTGGTAACTTCCAAGGG SPR1 :5’2AGGCCGAGGCGGCCGACATGTTTT23’
SP0 : 5’2GCCAACAGCAGTGCCATTAACT23’ AP0 : 5’2CAATCGCCGT23’　AP5 : 5’2ACAGCCTGCT23’
SP1 : 5’2GGAACAAGATCACCAGAAGCAG23’ AP1 : 5’2GAAACACCCC23’　AP6 : 5’2AGGCAGAGCA23’
SP2 : 5’2CCAGAATATCCCTGCAAGAGAGT23’ AP2 : 5’2CCGATATCCC23’　AP7 : 5’2CCAACGGCT23’
SP3 : 5’2CCAAAGATTCCAGCATTCAG23’ AP3 : 5’2AAGACCCCTC23’　AP8 : 5’2AGGCTTCCCT23’
SP4 : 5’2CCCTGCTTCGCTCTCCGATGAG23’ AP4 : 5’2TCGCATCCCT23’　AP9 : 5’2GATGGGCCTG23’
SPF2 : 5’2GAA GGATCCATGGAAAGCATTTGCCAGA23’ SPR2 : 5’2GCGCTCGAGTAATAGTCCATGAGTCAGGG GC23’
RTF : 5’2CTGAATGCTGGAATCTTTGG23’ RTR : 5’2TCCCTTGGAAGTTACCACCA23’
RTAF : 5’2TCTCTATGCCAGTGGTCGTA23’ RTAR : 5’2CCTCAGGACAACGGAATC23’
表 2 　TAIL2PCR 扩增 PAL 基因的 5’端 cDNA 序列的反应条件
Table 2 　The amplified conditions of 5’cDNA end sequences of PAL gene by TAIL2PCR
反应
reaction
程序
procedure
循环数
circular number
参数
parameter
第 1 轮 1 1 93 ℃,1min ;95 ℃,1min
2 5 94 ℃, 30s ; 62 ℃, 1min ; 72 ℃, 215min
3 1 94 ℃, 30s ; 25 ℃, 3min ; 缓慢升到 72 ℃( > 3min) ; 72 ℃, 215min
4 15 94 ℃, 10s ; 68 ℃, 1min ; 72 ℃, 215min ; 94 ℃, 10s ; 68 ℃, 1min ; 72 ℃, 215min ; 94 ℃, 10s ;
29 ℃, 1min ; 72 ℃, 215min
5 1 72 ℃, 5min
第 2 轮 6 12 94 ℃, 10s ; 64 ℃, 1min ; 72 ℃, 215min ; 94 ℃, 10s ; 64 ℃, 1min ; 72 ℃, 215min ; 94 ℃, 10s ;
29 ℃, 1min ; 72 ℃, 215min
5 1 72 ℃, 5min
第 3 轮 7 20 94 ℃, 10s ; 29 ℃, 1min ; 72 ℃, 215min
5 1 72 ℃, 5min
11215 　PCR 产物的回收、克隆与测序 　用 DNA 凝胶
回收试剂盒回收琼脂糖凝胶电泳分离的目的片段 ,与
p GEM2Teasy 载体连接后转入大肠杆菌 DH5α的感受态
细胞中 ,涂于含 IPTG、X2gal、Amp 的 LB 固体培养基上
培养、筛选 ,取白色单菌落于含 50 mgΠml Amp 的 LB 液
体培养基中培养 ;用碱裂解法小量提取质粒 DNA[16 ] ,
经 EcoR I酶切、电泳鉴定为阳性克隆的菌液送上海晶
泰生物技术有限公司测序 ,每个目的片段测序时分别
挑选 3 个阳性克隆进行菌液培养测序 ,以便验证克隆
序列的一致性。
11216 　基因 cDNA 全长序列的拼接和验证 　为证实
所得的 3 段 cDNA 序列来自同一个基因 ,在拼得的全
长 cDNA 序列的 5’2和 3’2端上设计上、下游特异引物 SPF2 和 SPR2 (表 1) , SPF2 添加有 BamhI 酶切位点GGATCC和保护碱基 GAA ,SPR2 添加有 XhoI 酶切位点 CTCGAG和保护碱基 GCG。PCR 反应体系、扩增条件除退火温度为 58 ℃和循环数为 30 个外 ,其他均与PAL 基因中间片段的扩增条件相同。11217 　PAL 基因表达的 RT2PCR 分析 　根据获得的PAL 基因全长 cDNA 序列设计上、下游特异引物 RTF和 RTR(表 1) ;以植物中普遍表达的 Actin1 基因为表达的内参照系设计上、下游引物 RTAF 和 RTAR(表 1) 。取反转录合成的各时期地下块茎 dscDNA、等浓度混合的叶片 dscDNA、等浓度混合的茎蔓 dscDNA 为模板进行 RT2PCR 分析 ,除 2 个基因的引物同时各加 215μl(10μmolΠL) 、退火温度 55 ℃和循环数 30 个外 ,其他均
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与 PAL 基因中间片段的扩增条件相同。
11218 　序列生物信息学分析 　参照魏兆军等[17 ] 方法
对基因进行生物信息学分析。将所得中间片段 cDNA
序列在 GenBank 中进行 blast 比较 ( http :ΠΠwww. ncbi .
nlm. nih. govΠBLAST) ,以确认目的基因 ;用 DNASTAR
和 DNASIS 等软件分析基因核苷酸序列及其推定氨基
酸序列的结构特征和同源性 ;在线分析氨基酸序列的
保守功能域 ( http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. govΠStructureΠ
cddΠwrpsb. cgi) 。应用 CLUSTAL W 1182 软件对基因核
苷酸序列及其推定氨基酸序列进行多序列比较 ,然后
用 TreeView 软件读取和构建系统树。
2 　结果与分析
211 　大薯 PAL 基因 cDNA中间特异片段序列的获得
利用简并引物 DPF 和 DPR ,从大薯’Zixiao’地下块
茎的 dscDNA 中扩增到大小为 1000～1200bp 的预期条
带 (图 12A) ,对该条带回收、克隆、酶切鉴定和测序后 ,
得片段大小为 1145bp , 通过 与 GenBank 中 木 薯
( Manihot esculenta : AAK62030 ) 、殴 芹 ( Petroselinum
crispum : P45729 ) 、拟南芥 ( Arabidopsis thaliana : NP
-
19604312) 、油菜 ( Brassica napus :ABC6991611) 、普通烟 草 ( Nicotiana tabacum : P45733) 、矮笔花豆 ( Townsvillestylo : P45732) 、甘薯 ( Ipomoea batatas : P14166) 、莴苣( Lactuca sativa : AAL55 242) 、甜樱桃 ( Prunus avium :AAC7845711) 、柠檬 ( Citrus limon :AAB6773311) 等植物的 PAL 基因比对 ,核苷酸序列同源性达 6212 %～7717 % ,对应片段序列所推定的氨基酸序列同源性达7010 %～8812 % ,且该片段核苷酸序列编码的 381 个氨 基 酸 包 含 PAL 酶 活 性 中 心 的 特 征 序 列GTITASGDLVPLSYIA(图 2) ,故推测所得中间特异片段为大薯地下块茎 PAL 基因 cDNA 序列的一部分 ,该基因命名为 Dioscorea alata phenylalanine ammonia2lyase 1( DaPAL1) 。212 　Da PAL1 全长 cDNA序列 3’端和 5’端的获得为了获得 DaPAL1 的 3’端 cDNA 序列 ,利用设计的特异引物 ,通过 RACE 扩增出一条长约 1100bp 的预期特异条带 (图 1 - B) ,经测序该条带长 1151bp (不含引物序列) ,与中间特异序列有引物设计时既定的 240个重叠碱基 ;同时含有 25 nt 的 Poly (A + ) 尾 ,且在距离该尾 76 个碱基处含有典型的 Poly (A + ) 加尾信号AATAAA ,这些是真核生物基因全长 cDNA 在 3’端的特征序列 ,因此 ,推定该片段为 DaPAL1 的 3’端序列。
图 1 　山药地下块茎 DaPAL1 的 cDNA 的中间片段 (A) 、3’端 (B) 、5’端 (C)和全长 (D)扩增验证产物的电泳图
Fig. 1 　Electrophoresis of amplified products of middle segment (A) , 3’end (B) ,5’end (C) and
complete sequence verification of DaPAL1 gene full2length cDNA sequence from underground yam tuber
M:DNA ladder marker ;1 :简并引物 PCR 扩增产物 (A) 、特异引物扩增 PCR 产物 (D)和 RACE技术扩增 3’端产物 (B) ;
图 C的 1、2、3 泳道分别为 TAIL2PCR 第 1 (引物对 SP1 和 AP0) 、2 (引物对 SP2 和 AP0) 、3 (引物对 SP3 和 AP0)轮扩增结果。
M:DNA ladder marker ; 1 : products amplified by PCR with degenerate primers (A)or with specific primers(D) or amplified by
RACE technique (B) ; 1 , 2 , 3 in Fig. C : products by TAIL2PCR amplification at 1st ,
2nd ,3th time with the primers of SP1 and AP0 , SP2and AP0 , SP3 and AP0 , respectively.
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图 2 　大薯块茎 DaPAL1 的三段 cDNA 核苷酸所拼接的全长序列及其推定的氨基酸序列
Fig. 2 　Complete nucleotide sequence combined with three parts of DaPAL1 cDNA and its
deduced amino acid sequence in Dioscorea alata L. tuber
加方框的氨基酸表示苯丙氨酸解氨酶的酶活性中心特征氨基酸序列 ;加下划线的碱基为全长验证时设计引物的区域
Amino acid sequence emphasized with pane is the typical amino acid sequence of the
center for PAL activity. Nucleotide sequences emphasized with underlines were
the regions of the designed primers for the verification of full2length cDNA.
587　6 期 山药 PAL 基因全长 cDNA 序列的克隆、表达与分析
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图 3 　大薯与其他物种的 PAL 同源基因编码氨基酸序列比较
Fig. 3 　Alignments of putative amino acids encoded by homologous PAL genes from
Dioscorea alata L. with other plant species.
687 核　农　学　报 22 卷
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　　由于用 RACE 技术未得到 DaPAL1 的 5’端 cDNA
序列 ,故按 Terauchi 和 Kahl[14 ] 方法依次进行 3 轮 PCR
扩增 ,结果仅 SP1 和 AP0、SP2 和 AP0 及 SP3 和 AP0 三
对引物扩增出明显的特异条带 ,而且片段大小差异与
预期相符 (图 1 - C) 。于是将第 2 轮目的产物测序 ,该
条带长 424bp (不含该轮引物对序列) ,与中间片段有
引物设计时既定的 84 个重叠碱基 ,同时含有第 3 轮
PCR 扩增的特异引物 SP3。这段序列在起始密码子
ATG周围的 - 3、+ 4 处碱基分别为 A、G,而且位于起
始密码子上游的 - 3、- 2、- 1 处的碱基为 A、C、C ,这
些均是基因 cDNA 序列 5’端的特征序列[18 , 19 ] 。因此 ,
该序列为 DaPAL1 的 5’端序列。
213 　Da PAL1 全长 cDNA序列的获得、验证及分析
根据获得的 DaPAL1 三段 cDNA 序列的重叠区 ,拼
接得到长度为 2376bp 的 DaPAL1 全长 cDNA 序列 (图
2) 。为了验证 3 段 cDNA 序列是否来自同一个基因 ,
在所拼接的全长 cDNA 序列两端附近选取一段序列
(图 2)设计一对加有酶切位点的特异引物 ,可从大薯
地下块茎的 dscDNA 中 PCR 扩增到预期大小的目标特
异条带 (图 1 - D) 。挑选 3 个克隆进行测序 ,表明 3 个
克隆的序列均为同一序列 ,长为 2140bp (不含引物序
列) ,与拼接所得 DaPAL1 的 cDNA 序列相应部分所含
碱基完全一致。因此 ,3 段 cDNA 序列来自同一个基
因 ,拼接的序列为 DaPAL1 全长 cDNA 序列。用
DNASTAR 软件对获得的 DaPAL1 全长 cDNA 序列进行
分析可知 ,该全长 cDNA 含有 1986bp 的最大开放阅读
框 (ORF) ,第一个编码蛋氨酸的起始密码子 ATG位于
第 29～31 碱基 ,在 5’端非翻译区有 28bp ,3’端非翻译
区有 362bp。同时 ,与上述所选 10 个物种的 PAL 同源
基因全长 cDNA 序列的同源性达 73 %～77 %。
214 　Da PAL1 所推定氨基酸序列及其特征分析
用 DNASTAR 软件分析 DaPAL1 全长 cDNA 所编码
的氨基酸及其序列特征 (图 2) 发现 , DaPAL1 最大 ORF
可编码 661 个氨基酸 ,分子量为 711974kDa ,等电点为
61310 ;每类氨基酸所占比例不同 ,碱性氨基酸 ( K、R) 70
个 ,酸性氨基酸 (D、E) 78 个 ,疏水氨基酸 (A、I、L、F、
W、V) 240 个 ,极性氨基酸 (N、C、Q、S、T、Y) 170 个 ,分
别占总氨基酸的 1016 %、1118 %、3613 %和 2517 %。同
时 ,在线对 DaPAL1 所编码的氨基酸序列进行功能保
守区域分析 ,结果表明 ,661 个氨基酸中含有 2 个保守
功能域 ,一个是 PAL2HAL 功能域 ,在第 85～525 个氨基
酸之间 ;另一个为 PAL 功能域 ,在第 85～550 个氨基酸
之间 ,两个功能区域都包含该类型裂解酶的酶活性中
心序列 GTITASGDLVPLSYIA ,位于 195～210 个氨基酸
间。
215 　Da PAL1 所推定氨基酸序列的比较和分子进化
分析
将 DaPAL1 全长 cDNA 所推定的 661 个氨基酸序
列与 GenBank 中所登陆的 244 个 PAL 同源基因所编码
的氨基酸序列进行同源性比较 ,发现大薯与其他已报
道的高等植物的 PAL 基因所编码的氨基酸序列同源
性达 76 %～82 % ,说明 PAL 酶蛋白氨基酸序列在系统
进化上有高度保守性。同时 ,从 GenBank 中挑选 11 种
植物的 PAL 基因 (悬钩子含有 2 个 PAL 同源基因) 全
长 cDNA 所编码的氨基酸序列 ,应用 ClustaW 1182 软件
将 DaPAL1 所推定氨基酸序列和挑选的 12 个氨基酸
序列进行多序列比较 ,发现功能区域的氨基酸序列较
为保守 ,而 C2端、N2端区域的差异较大 ,尤其 N2端的差
异最大 (图 3) ;同时以它们的 PAL 同源基因所编码的
酶蛋白氨基酸序列构建系统树 (图 4) 显示 , 大薯
DaPAL1 与其他 11 个物种的 PAL 同源基因不能归为
一类。
图 4 　大薯与其他高等植物 PAL 酶蛋白氨基酸序列经
ClustalW和 TreeView 构建的系统树
Fig. 4 　Phylogenetic tree generated by multiple PAL
amino acid sequences of Dioscorea alata L. and other
higher plants through ClustalW and TreeView
216 　Da PAL1 的时空表达分析
通过以植物中普遍表达的 Actin1 基因为内参照
系 ,用 RT2PCR 技术对 DaPAL1 在山药生长发育过程中
的时空表达进行研究 ,结果 (图 5) 显示 , DaPAL1 不在
叶片和茎蔓表达 ,仅在地下块茎特异表达 ,而且在块茎
形成的不同时期所表达的丰度有差异 ,在块茎形成的
初前期表达量最大 ,此后逐渐减少 ,但到收获时表达量
又增大。
787　6 期 山药 PAL 基因全长 cDNA 序列的克隆、表达与分析
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图 5 　山药地下块茎 DaPAL1 时空表达的 RT2PCR 分析
Fig. 5 　Analysis of the spatial and temporal
expressions of DaPAL1 by RT2PCR
M:3kbp DNA ladder marker ;1～5 :分别为地下块茎形成的初前期、盛前
期、盛中期、盛后期、后中期 ;6 :收获期 ;7 :叶片 ;8 :茎蔓
M: 3kbpDNA ladder marker ;1～5 : the initiation of the early2forming stage ,
the initiation of the rapidly2bulking stage , the part of the rapidly2bulking
stage , the termination of the rapidly2bulking stage , the part of later stage ,of
yam tubers , respectively ; 6 : the harvesting time ; 7 :leaves ; 8 : stems
3 　讨论
苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 是植物酚类物质代谢的第
一个关键酶 ,编码该酶的同源基因在许多物种中得到
了克隆和描述。GenBenk 数据库中所报道物种的 PAL
同源基因全长 cDNA 序列及其推定的氨基酸序列的长
度分别为 2 096～2 650bp 和 628～730 个氨基酸。本研
究所获得的 DaPAL1 是迄今发表最早的山药 PAL 同源
基因 ,该基因全长 cDNA 序列大小为 2 376bp ,可编码
661 个氨基酸。与 GenBenk 数据库中所登录的 PAL 同
源基因相比 ,完整的编码基因 DaPAL1 在核苷酸和氨
基酸水平上的大小与其他物种的差异不大 ,分别有
73 %～77 %和 76 %～82 %的同源性 ,尤其功能性区域
的氨基酸序列同源性更高 ,在系统进化上具有相当高
的保守性 ,但是在基因全长 cDNA 序列的 5’2和 3’2端
的非翻译区上核苷酸个数与其他物种有差异 ,大薯
DaPAL1 的分别是 28bp 和 362bp ,烟草[7 ] 、甘薯[20 ] 的分
别为 22bp、204bp 和 207bp、206bp ;同时 ,山药和其他物
种在 PAL 基因编码氨基酸序列的 N2端和 C2端的氨基
酸上相似性要低于作为功能区域的中间序列 ,特别是
N2端的差异更大 (图 3) ,这和悬钩子 2 个 PAL 同源基
因所编码氨基酸序列的 N2端也有很大差异的特征相
似[8 ] (图 4) ,说明 PAL 基因在系统进化时两端序列要
比中间序列更容易。此外 ,双子叶植物悬钩子 2 个
PAL 同源基因所编码的氨基酸序列与双子叶植物的亲
缘关系比单子叶植物的更近些[8 ] ,在本文中 DaPAL1
所推定的氨基酸序列与双子叶植物的 PAL 同源基因
所编码氨基酸序列的亲缘关系差异较远 (图 4) ,这可
能和山药虽为单子叶植物 ,但兼具单、双子叶植物特
性[21 ]有关。
PAL 同源基因在许多植物中是一个由 2～5 个成
员组成的小基因家族[7～12 ] ,基因家族各成员的表达具
有组织器官和发育时期的特异性 ,从而担负着不同的
功能。本研究从大薯地下块茎中所获得的 DaPAL1 仅
在大薯地下块茎表达 ,而且存在时空表达上的差异。
尽管 DaPAL1 在叶和茎蔓上没有表达 ,但是由于 PAL
是酚类物质代谢中一个催化公共反应的酶 ,酚类代谢
基本伴随植物整个生长发育 ,所以叶和茎蔓中可能有
大薯 PAL 同源基因的其他成员在起作用 ,至于该基因
家族在大薯中的成员数及它们的具体序列情况尚需进
一步分离验证。
目前 ,植物已知同源基因的克隆方法有多种 ,其中
RT2PCR 和 RACE相结合的技术是获得已知同源基因
全长 cDNA 序列最为简便有效的方法 ,但是 mRNA 在
反转录时 5’端接头的添加和保持是成功获得 5’端
cDNA 序列的关键。在本研究之前 ,我们用 RACE 技术
在同一份 dscDNA 中分别获得了蔗糖合成酶基因和花
青素合成酶基因的全长 cDNA 序列的 3’端和 5’端的
cDNA 序列 (结果未显示) ,而且在克隆 DaPAL1 时也获
得 3’端序列 ,但始终没能获得 5’端 cDNA 序列。为了
获得 DaPAL1 的 5’端 cDNA 序列 ,我们参照改良的
TAIL2PCR 方法[14 ] ,成功得到了 5’端 cDNA 序列。这说
明 RACE 扩增 5’端 cDNA 序列失败可能是试验时
dscDNA 多次冻融导致添加在 5’端的寡核苷酸序列脱
落 ,而非 RNA 质量差和反转录不成功所致 ;同时也说
明用 TAIL2PCR 方法能以 cDNA 为模板克隆基因序列。
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外源蛋白在大肠杆菌中高表达时往往形成包涵
体 ,因此探索重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是
抗体工程研究的一项重要任务。本研究选用 Origami 2
菌株进行 scFv 的表达 ,该菌株硫氧还蛋白还原酶和谷
胱甘肽还原酶均被突变 ,因而有利于胞浆内二硫键的
形成 ,可促进蛋白的正确折叠。另有研究表明即使总
体表达水平相似 ,Origami (DE3) 表达的活性蛋白比其
它宿主菌高 10 倍以上。本研究胞浆中的 scFv 经过纯
化后 ,经 ELISA 检测 ,发现其能够与对硫磷结合 ,说明
该单链抗体在胞浆中获得了正确折叠 ,具有特异的抗
原识别能力。
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