全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 032168204
转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究
王彩霞　吴殿星　沈圣泉　舒庆尧
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :研究了转基因及常规水稻幼苗叶面喷施潮霉素 B 溶液后的反应。结果发现 ,常规水稻
吸收潮霉素 B 后 ,叶片会出现以褐斑为特征的中毒症状。在 50～100mgΠL 浓度范围内 ,褐斑的
数目和面积随时间和浓度的增加而增加 ,溶液中滴加 DMSO 可提高潮霉素对稻苗的毒性。浓
度在 75mgΠL 及以上时 ,喷后第 7 天 ,处理的所有幼苗都出现症状。而浓度在 50mgΠL 时 ,个别
幼苗经处理后未出现中毒症状。在上述浓度范围内 ,带潮霉素磷酸转移酶基因 ( hpt) 的 Bt 转
基因水稻 (克螟稻)幼苗均未出现中毒症状。苗期鉴定与抽穗前后成株期鉴定的结果相一致。
讨论了叶面喷施潮霉素 B 溶液在转基因水稻育种和筛选潮霉素敏感转基因水稻突变体中的
可能应用。
关键词 :水稻 ;潮霉素 ;敏感性 ;潮霉素磷酸转移酶基因 ( hpt) ;无标记基因转基因植物
IN SITU SUSCEPTIBILITY OF TRANSGENIC AND CONVENTIONAL RICE
SEEDLING TO HYGROMYCIN B
WANG Cai2xia 　WU Dian2xing 　SHEN Sheng2quan 　SHU Qing2yao
( Institution of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 310029)
Abstract :The effects of hygromycin B on transgenic and conventional rice seedling were studied by foliar spraying.
Results showed that conventional rice was susceptible to hygromycin B with toxic symptoms of brown spots in the
leaves after foliar spraying. The number and area of spots increased with the time after treatment and showed
concentration dependent within levels of 50～100mgΠL. The toxic symptoms were enhanced with the addition of
dimethyl sulfoxide (DMSO) into hygromycin B solution. All seedlings in each treatment exhibited toxic spots at the
7th day when the concentration of hygromycin B equaled to or higher than 75mgΠL. However , a few seedlings did not
show any toxic symptom when the concentration was 50mgΠL. All of the transgenic rice with hygromycin
phosphotransferase gene ( hpt ) was resistant to hygromycin B , none appeared any toxic symptoms over the
concentrations mentioned above. Susceptibility test of rice plants to hygromycin B around heading stage showed
consistent results with seedling. The applicability of foliar application of hygromycin B for screening of transgenic
rice resistantΠsusceptive to hygromycin B was also discussed in this paper.
Key words :rice ; hygromycin ; susceptibility ; hygromycin phosphotransferase ( hpt) ; marker2free transgenic plants
(MFTP)
收稿日期 :2004207214
作者简介 :王彩霞 (1978 - ) ,女 ,湖南石门人 ,在读硕士研究生 ,从事植物诱变与分子改良研究。舒庆尧为通讯作者 ,
Email :qyshu @zju. edu. cn
潮霉素 B 是一种氨基糖苷类抗生素 ,可破坏各种细胞中核糖体的功能。在植物中 ,潮霉素通过竞
争细胞叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子 EF22 的结合位点 ,从而抑制肽链的延长 ,破坏细胞的翻
译功能 ,使敏感组织褐化死亡。潮霉素对水稻细胞也有较强毒性 ,但由于潮霉素磷酸转移酶基因 ( hpt)
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Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
导入水稻后 ,使细胞具备了潮霉素磷酸转移酶 ( HPT) 活性 ,可以忍耐较高浓度潮霉素的毒性 ,对转化细
胞的生长和分化影响较小。因此 ,在水稻遗传转化中 , hpt 基因已成为最有效的选择基因之一[1 ] 。在用
农杆菌介导法育成的转基因水稻中 ,大多数含有 hpt 基因 ,潮霉素抗性是检测转基因水稻的方法之一。
但是 ,除对浸种催芽[2 ]和离体叶片[3、4 ]对潮霉素处理的效果进行过简短报道外 ,直接用潮霉素对水
稻活体进行处理评判其敏感性的研究尚少有报道。本试验用潮霉素溶液喷洒幼苗叶片的方法 ,对转基
因及常规水稻幼苗对潮霉素的敏感性进行了研究 ,并对所得结果在转基因水稻育种和筛选潮霉素敏感
突变转基因水稻中的可能应用进行了探讨。
1 　材料和方法
本试验以秀水 11 和华池 B6、克螟稻 1 号以及克螟稻 1 号Π常规粳稻和克螟稻 1 号Π常规籼稻杂交分
离群体为材料。其中华池 B6、克螟稻 1 号分别为本试验室育成的早籼型和晚粳型带 hpt 基因的 Bt 转基
因水稻纯合株系[5 ] 。杂交分离群体则从育种材料中随机选定。
潮霉素 B 为 Roche 公司产品 ,纯度 > 80 %。试验用蒸馏水配成水溶液 ,设置 50、75、100mgΠL 3 种浓
度处理 ,每种浓度又分不加 DMSO( - ) 和加 DMSO ( + ) 两种处理 ,6 种处理分别记为 50、50 + 、75、75 + 、
100 和 100 + 。待水稻幼苗长至 4 叶 1 心时 ,直接将潮霉素溶液喷洒至幼苗叶片上。处理后观察叶片中
毒症状 ,统计叶片斑点数目和面积。斑点面积由透明坐标纸测得。对分离群体、纯合群体 ,于苗期检测
后插牌标记抗Π感性 ,在抽穗前后 ,再次用浓度为 100mgΠL 的潮霉素溶液处理 ,观察成株的症状并比较苗
期和成株期鉴定结果的异同。
2 　结果与分析
在本试验浓度范围内 ,经潮霉素处理后 ,华池 B6 和克螟稻 1 号幼苗均未出现明显的中毒症状 ,表现
对潮霉素有很强的抗性 ,如图 1 (a) 。常规水稻秀水 11 的 6 个处理均出现不同程度的非致死中毒症状。
以下主要分析潮霉素对秀水 11 的影响。
211 　潮霉素中毒症状
图 1 　潮霉素溶液处理后水稻幼苗叶片 (a)和成株 (b)的中毒症状
Fig. 1 　Toxic symptom of transgenic and conventional rice seedling leaves (a) and
rice plants (b) after foliar application of hygromycin B solution
如图 1 (a)所示 ,喷施潮霉素后 ,常规水稻秀水 11 幼苗叶片出现了以褐色斑点为特征的中毒症状 ,但
植株不死亡。褐斑多为圆形或不规则圆形 ,少量沿叶脉方向带有单柄或双柄。随时间的增加 ,斑点数目
有所增加 ,单个斑点面积扩大或多个斑点合成一个大斑点。
212 　剂量效应
潮霉素对常规水稻幼苗的毒性存在明显的剂量效应。这主要表现在叶片呈现斑点的迟早、呈现斑
点的植株数、斑点的数目和斑点的面积 4 个方面。
961　3 期 转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究
图 2 　秀水 11 各处理幼苗叶片呈现斑点的植株的百分比 (a) 、
平均斑点数目 (b) 、平均斑点面积 (c)随喷后时间的变化
Fig. 1 　Percentage of plants exhibiting brown spots (a) , average spot number per seedling (b) ,
average spot area per seedling (c) of different treatment at various
days after application of Hygromycin B on Xiushui 11 seeding leaves
表 1 　喷施后第 7 天不同浓度处理的秀水 11 幼苗叶片
平均斑点数目和平均斑点面积的差异比较
Table 1 　Comparison on differences of spots number
and area after foliar application of hygromycin B
of different concentration (mgΠL) with ( + ) or
without ( - ) DMSO of Xiushui 11 seeding leaves
处 理
treatment 3 平均斑点数目 (个)average spot numberper seedling 平均斑点面积average spot areaper seedling (mm2)
100 + 9155 ±1183a 13190 ±1163a
100 8170 ±1190ab 11145 ±1165ab
75 + 8190 ±1190ab 12110 ±1158ab
75 7135 ±1132ab 9180 ±1130b
50 + 6160 ±2145b 9175 ±1197b
50 4120 ±2114c 5165 ±2188c
　　注 : 3 100 + :100mgΠL 加 DMSO ;100 :100mgΠL 不加 DMSO ;75
+ :75mgΠL 加DMSO ;75 :75mgΠL 不加DMSO ;50 + :50mgΠL
加 DMSO ; 50 :50mgΠL 不加 DMSO
Note : 100 + : 100mgΠL with DMSO ; 100 : 100mgΠL without
DMSO; 75 + : 75mgΠL with DMSO ; 75 : 75mgΠL without
DMSO; 50 + : 50mgΠL with DMSO ; 50 : 50mgΠL without
DMSO
随潮霉素浓度的增加 ,呈现斑点的植株数增多 ,叶片
呈现斑点的时间变短、斑点数目增多、斑点面积增
大。如图 2 所示 ,处理后呈现褐斑的植株的百分比、
平均斑点数目和平均斑点面积一方面随时间的延长
而增加 ,同时随浓度的增高而增加。这种效应在低
浓度范围比高浓度范围明显 ,处理后第 7 天 50 和
75mgΠL 处理间平均斑点数目和平均斑点面积差异
达显著性水平 (表 1) 。在较低浓度下 (50mgΠL) ,个
别幼苗没有观察到典型的褐斑。
同时 ,从图 2 和表 1 可知 ,滴加 DMSO 可提高潮
霉素对常规水稻幼苗的毒性 ,且效果在低浓度范围
内特别明显。处理后第 7 天 50mgΠL 不加 DMSO 和
50mgΠL 加 DMSO 处理间平均斑点数目和平均斑点
面积差异达显著性水平。
213 　苗期和成株期效果比较
克螟稻 1 号Π常规粳稻和克螟稻 1 号Π常规籼稻
的两个杂交后代分离群体幼苗经 75mgΠL 加 DMSO
潮霉素溶液处理后 ,两者均出现了潮霉素抗Π感性分
离。在这些植株抽穗前后 ,再用 100mgΠL 加 DMSO 潮霉素溶液进行叶面喷施。结果发现 ,苗期敏感的植
株经潮霉素处理后叶片和穗出现以褐色斑块为特征的中毒症状 ,而所有纯合克螟稻植株及分离群体中
苗期鉴定为抗潮霉素的植株均未出现中毒症状 ,如图 1 (b)所示。
3 　讨论
本试验是有关水稻活体幼苗对潮霉素的敏感性研究的首次公开报道。研究表明 ,潮霉素对常规水
稻幼苗存在明显的非致死毒性并具有剂量效应 ,在溶液中加入 DMSO 可以提高潮霉素的毒性 ,而在本试
验浓度范围内 ,潮霉素对转基因水稻不存在明显的毒性。这些结果对开展潮霉素毒性机理、植物诱发突
变分子机制等基础研究具有重要参考意义 ,此外在转基因水稻的改良和研究中也具有一定的现实意义
和应用价值。
311 　在转基因水稻育种研究中的应用
071 核　农　学　报 19 卷
如前所述 , hpt 基因已成为水稻遗传转化中常用的标记基因 ,广泛用于转化愈伤组织的筛选。此
外 ,为间接筛选转基因植株 ,王忠华等提出了用潮霉素溶液浸种催芽 ,排除非转基因种子方法[2 ] ;Wang
M B 等提出将水稻叶梢的切口端插于含合适浓度潮霉素的固体培养基中 ,用以鉴定大田和组织培养中
的转基因植株[3 ] ;刘巧泉等则提出通过观察离体叶片片段在添加 62BA 的潮霉素溶液中的抗性来间接检
测转基因植株 ,并指出这种方法特别适合于转基因的遗传研究[4 ] 。本试验的结果表明 ,用潮霉素溶液喷
洒幼苗叶片应是一种新的辨别转基因与非转基因水稻的有效方法。采用 75mgΠL 加 DMSO 的潮霉素溶
液喷洒叶面 ,第 5 天所有幼苗会出现 1 个以上明显的褐斑 ,从而可以准确地鉴定出植株的 HPT活性 ,成
株期可采用同样的方法进行鉴定。该方法由于直接应用于植株 ,因此操作更加简便 ,效果更加直观 ,特
别适用于规模较大的群体。与目前转基因水稻的育种筛选通常采用 GUS 染色的方法[6 ] 相比 ,它还可以
从根本上避免取样、记载等过程中出现误差。
在试验中还发现 ,水稻活体经潮霉素溶液处理后中毒症状的表现在一定程度上受环境因子的影响 ,
如温度的升高会增强处理的效果 ,处理后短时间内降雨会削弱处理的效果 ,故在实际应用中应予注意。
312 　在筛选潮霉素敏感突变转基因水稻中的应用
标记基因 (报告基因和选择基因)是遗传工程中的重要工具基因 ,一般都与目的基因以连锁的方式
构建在同一 T2DNA 上。但是 ,在获得转基因植株后 ,从应用角度讲它们就成了多余的甚至是不受欢迎
的部分。因为它们的存在不但不利于再次转化 ,而且存在安全性风险 ,虽然迄今没有证据能证明转基因
植物中的抗生素抗性基因能够水平转移到其它微生物 ,但是 ,这种潜在的安全性风险仍引起人们的担
心 ,其中对 hpt 基因安全性的忧虑是目前我国转基因安全性评价中的一个重点。
无标记基因转基因植物 (Marker2free transgenic plants ,MFTP)培育技术是目前转基因技术研究的一个
重点[7 ] 。现已建立的 MFTP 培育方法主要有共转化法[8 ] 、转座子介导法[9 ] 重组系统[10 ] 等。但是 ,这些技
术只适用于新的 MFTP 的培育 ,无法应用于已经育成并具有重要应用价值的转基因植物中标记基因的
剔除。如本试验室育成的克螟稻[5 ] ,由于带有 hpt 基因 ,已成为获得安全证书的一种制约。通过人工理
化诱变 ,培育对潮霉素敏感的突变体 ,则可在一定程度上排除这种安全性顾虑。根据本试验结果 ,则可
以建立起一种简便、快捷的潮霉素敏感突变转基因水稻筛选技术 ,因此必将具有重要的应用价值。
313 　在植物诱发突变分子机制研究中的应用
目前 ,国内外利用诱变技术已经育成了大量作物优良品种 ,但对诱发突变的机制 ,特别是在 DNA 水
平上的研究甚少。由于转基因水稻中 hpt 基因图谱已知 ,与内源基因相比 ,研究潮霉素敏感突变转基因
水稻中 hpt 基因及其转录和表达的变化是研究植物诱发突变分子机制的一种有效方法。因此 ,本试验
建立的潮霉素敏感突变转基因水稻的筛选技术还将有助于推进对诱发突变分子机制的研究。
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