全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 042297204
培养的睾丸间质细胞对 hCG刺激的反应性
王鲜忠　吴建云　孙　燕　潘红梅　张家骅
(西南农业大学动物科技学院 ,重庆　400716)
摘 　要 :本文介绍了用酶解法结合差速离心分离仔猪睾丸间质细胞 ,并研究其对促性腺激素的
反应性。结果表明在 0～50IUΠml 内 ,睾酮的分泌量随着 hCG剂量的增加而增加 ,在 50IUΠml～
100IUΠml 内 ,加大 hCG剂量并不能增强间质细胞的分泌功能。研究还发现随着培养时间的延
长 ,间质细胞分泌睾酮的功能逐渐减低 ,培养 1d 和 2d 时对 hCG(人绒毛膜促性腺激素) 刺激的
反应能力最强 ;随着培养时间的进一步延长 ,间质细胞的反应性下降 ,4d 时与对照无明显差异
(P > 0105) 。间质细胞对首次刺激的反应敏感 ,当连续给予刺激时 ,睾酮的分泌受到抑制 ,在
24h 的分泌峰后不再出现分泌高峰。而首次刺激后间隔 2d 再刺激 ,间质细胞虽有反应 ,但反
应较弱。
关键词 :睾丸间质细胞 ;睾酮 ;人绒毛膜促性腺激素 ;反应性
CULTURED LEYDIG CELLS’REACTIVITY TO HUMAN CHORIONIC GONADOTROPN( hCG)
WANG Xian2zhong 　WU Jian2yun 　SUN Yan 　PAN Hong2mei 　ZHANGJia2hua
( College of Animal Technology , Southwest Agricultural University , Chongqing ,400716)
Abstract :The paper reports culturing leydig cells’reactivity to human Chorionic Gonadotropn ( hCG) , and also
introduces the separation method of leydig cells by enzyme decomposing and centrifugation at different speed. The
results are as following : (1) with the increasing of hCG concentration , the testosterone concentrationincreases.
When hCG concentration is over 50 IUΠml , the testosterone concentration in culturing leydig cells was not
significantly changed. (2) with the culturing time increasing , testosterone concentration decreases compared with
control . Using cultured leydig cells for 4 days , the difference between the control and the treatment was not
significant . (3) Leydig cell was sensitive to the first hCG stimulation. With repeat hCG stimulations , the reactivity
decreases and there is no testosterone concentration peak appeared after 24h. Break hCG use for 2d interval ,
cultured leydig cells’reactivity to hCG will increase but it keeps weak.
Key words :leydig cell ; testosterone ; human chorionic gonadotropn (hCG) ; reactivity
收稿日期 :2004208231
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30270955)和教育部重点科学技术项目及重庆市教委项目 (01106)
作者简介 :王鲜忠 (1973 - ) ,男 ,讲师 ,博士 ,从事方面的研究。张家骅为通讯作者 ,Email :xianzhong2001511 @sohu. com
间质细胞 (leydig cell)的主要功能是合成和分泌睾酮 ,以调节生精作用、全身代谢和雄性第二性征。
睾丸间质细胞分布在曲细精管间的结缔组织中 ,约占睾丸总重量的 2 % ,但分泌的睾酮却占睾酮总量的
95 %。仔猪在出生 1 个月内 ,间质细胞数量有一个高峰期 ,大约占睾丸所有细胞的 60 %以上 ,这一时期
大量的间质细胞是引起第二个睾酮分泌峰的直接原因。由于此时曲细精管初步形成 ,尚无管腔 ,仅有精
原细胞 ,分离、纯化间质细胞相对容易 ,而间质细胞中促黄体生成素受体位点数量最多 ,对促性腺激素的
反应性最强 ;因此成为研究睾丸间质细胞功能的较好选材[1 ] 。睾丸间质细胞一般采用睾丸剪碎、Ⅰ型胶
原酶消化分离法 ,分离得到的间质细胞纯度过低 ,其中不但有所需要的间质细胞 ,而且还有大量的各级
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生精细胞和支持细胞 ,常常不能精确计算间质细胞含量 ,其含量也随消化程度不同有所改变[2 ] 。自从
Klinefelter[3 ]采用以 Percoll 梯度离心为基础的多步法分离间质细胞以来 ,间质细胞分离的技术有了长足
的发展 ,但是由于这一方法要求的设备和条件较高 ,加之分离后间质的存活率较低 ,因此许多研究都对
这一方法进行改进。我们根据本实验室的具体情况 ,对间质细胞的分离方法进行了摸索 ,并通过检测
3β2HSD 的活性 ,发现所建立的方法能满足实验需要。本文报道了采用此方法 ,研究培养的间质细胞对
促性腺激素的反应性 ,确定最佳的刺激条件 ,以期为研究外源性化学物对睾酮合成和分泌的影响及其机
制奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料和试剂
仔猪睾丸取材于重庆本地 2～3 周龄长白仔猪。主要试剂有 :DMEMΠF212Hams ( Hyclone) 、DL2α2
Tocopherol (Merck) 、Insulin2Transferrin2Sodium(Roche) 、Sodium Bicarbonate (Sigma) 、Ⅰ型胶原酶 (Roche) 、125Ⅰ2
睾酮测定试剂盒 (中国原子能科学研究所) 、hCG(山东蓬莱华泰制药有限公司) ,实验所用的其余试剂为
国产分析纯。
112 　仔猪睾丸间质细胞的分离
在无菌条件下采集 2～3 周龄的仔猪睾丸 ,放入盛有 011molΠL 的冰浴 PBS 液中 ,2h 内送回实验室。
用新鲜的 011molΠL PBS 液清洗 3～4 次 ,将睾丸转入清洁灭菌平皿中 ,每只平皿放两只睾丸。剥离被膜 ,
用两支眼科镊和眼科剪将睾丸组织剪碎为 1mm3 的小块 ,32 ℃下用胶原酶消化液 (间质细胞无血清培养
液的组成参照张家骅[4 ]的配方 ,消化时在无血清培养液中加入临用时现配的浓度为 015mgΠml 胶原酶)
消化 90min。将得到的消化液用 PBS 稀释 ,两层细纱过滤 ,收集滤液 ,1500rΠmin 离心 10min ,将沉淀用 PBS
清洗后离心 ,用培养液溶解沉淀并用移液枪轻轻吹打使睾丸间质细胞分散成为单细胞 ,用 2 层铜网过筛
(分别为 200 目和 250 目)过滤。
113 　睾丸间质细胞活力和纯度鉴定
睾丸间质细胞活力的测定采用取 1 滴细胞悬液和 1 滴 014 %台盼蓝溶液混匀 ,静放 3min ,用力摇匀 ,
显微镜下观察 ,无色透明为活细胞 ,蓝色为死细胞。
存活率公式计算 :存活率 ( %) = 活细胞数Π(活细胞数 + 死细胞数) ×100 %
染色鉴定睾丸间质细胞的纯度 :将 15μl 细胞悬液均匀涂抹在洁净的载玻片上 ,室温下至完全干燥。
加入 3β2羟类固醇脱氢酶 (3β2HSD)染色液完全覆盖细胞 ,37 ℃孵育 90min ,显微镜下 (400 倍) 检测 ,出现
清楚可见的蓝色后 ,倾去反应液 ,用三蒸水冲洗终止反应 ,固定液固定后 ,中性树胶封片。显微镜下观察
细胞质中颗粒的阳性细胞即为间质细胞计数。
114 　间质细胞对不同浓度 hCG的反应
根据计数结果将间质细胞稀释至 1 ×108 细胞Πml ,32 ℃,5 %CO2 , 饱和湿度下培养 48h。用浓度为 0、
25 、50IUΠml 的 hCG培养细胞 24 h ,离心收集上清液。
115 　不同培养时间的间质细胞对 hCG的反应
按 114 培养间质细胞。分别于培养的 1、2、3 和 4d 加入 50 IUΠml hCG组 ,培养 24h ,离心收集上清
液。除刺激组外 ,其余各组均每天更换培养液。
116 　刺激频率对间质细胞分泌睾酮的影响
按 114 培养间质细胞 24h ,采用如下方式处理细胞 : (1) hCG连续刺激 24h ; (2) hCG连续刺激 4d , (3)
hCG刺激 1 次 (24h) ,间隔 2d 再刺激 1 次 (24h) 。hCG的刺激浓度均为 50 IUΠml。以上处理分别于培养
24、48、72 和 96h 收集上清液。
117 　RIA 质量控制
细胞悬液中睾酮含量测定采用125 Ⅰ2睾酮放射免疫法测定 ,所用试剂盒批内变异系数 514 %～
714 % ,批间变异系数 311 %～6. 1 %。试剂盒与前体之间的交叉反应性 :雄烯二酮 < 0114 ;脱氢表雄酮
< 0101 ;胆固醇 < 0101。
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118 　统计分析
每个处理点设 3 个重复 ,每个实验重复 3 次 ,测定结果以 x ±SD 表示 ,多组数据比较采用 F2Q 检
验 ,两组之间用 t 检验。
2 　结果
211 　间质细胞存活率和纯度
图 1 　不同浓度的 hCG对睾酮合成影响
Fig. 1 　Effect of different dose of hCGon
testosterone synthesis
间质细胞分离后 ,细胞存活率为 (95 ±413) % ( n =
4) 。由于睾丸组织细胞中只有间质细胞内含有 3β2HSD ,
故可通过 3β2HSD 染色鉴定分离的间质细胞纯度[3 ] 。采
用本法选 100 个细胞进行阳性细胞计数 ,统计 4 次的结
果 ,间质细胞的纯度百分率为 (87 ±516) %( n = 4) 。
212 　不同浓度的 hCG对间质细胞睾酮分泌的影响
从图 1 中可以看出 ,培养 48h 后 ,间质细胞睾酮分泌
量随 hCG 浓度的升高而增加 , 当 hCG 浓度为 50IUΠml
时 ,睾酮分泌达最大值 ,睾酮的浓度为 23185 ±3125ngΠ
ml ;与对照组相比差异显著 ( P < 0101) 。超过这一浓度 ,
hCG诱导间质细胞睾酮分泌量增加趋于平缓。
表 1 　用 hCG( 50IUΠml)刺激不同培养时间的间质细胞( 108 )的睾酮变化
Table 1 　Changes of testosterone concentration using hCG stimulating
leydig cells at different culturing time (ngΠml)
不同的培养时间
different culturing time (d)
培养时间 culturing time (d)
1 2 3 4
control 3132 ±1148 2134 ±1125 1189 ±0193 1128 ±0132
1 24198 ±4139 33 7185 ±1134 3 8. 57 ±2114 3 3134 ±0145
2 313 ±2114 26. 86 ±4182 33 8. 97 ±2108 3 715 ±1124 33
3 3125 ±1178 3115 ±1126 3 18195 ±3153 3 7185 ±1102 33
4 3138 ±2136 2158 ±1127 2135 ±0178 1138 ±0142
　　注 : 3 和 3 3 分别代表 0105Π0101 水平差异显著。土后为标准误差。其它表相同。
Note : 3 and 33 indicated significant at 0105 and 0101 levels , respectively , ±Standard deviation. The same as other tables.
213 　不同培养时间的间质细胞对 hCG的反应
从表 1 可以看出 ,在无 hCG刺激的情况下 ,随着培养时间的延长 ,睾酮的分泌量逐渐下降 ;对 hCG
刺激的反应也随着时间的延长逐渐减低 ;培养 1d 增加的绝对值约为 21166ngΠml ,2d 约为 24132ngΠml ;3d
降为 17106ngΠml ;到培养 4d 时睾酮的增加量与对照组已无明显差异。
214 　刺激频率对间质细胞分泌睾酮的影响
表 2 　刺激次数对间质细胞分泌睾酮的影响
Table 2 　Effect of hCG stimulating times on testosterone concentration (ngΠml)
刺激时间
stimulating times
刺激前的睾酮值
level of testosterone
before stimulating
刺激后的睾酮值
testosterone concentration after stimulating
24h 48h 72h 96h
control 1196 ±0191 4183 ±2134 6. 35 ±2196 9. 73 ±3196 9. 29 ±3156
24h 2177 ±0184 23187 ±5179 3 30169 ±5124 3 40175 ±7176 3 38184 ±6123 3
48h 2135 ±1124 18186 ±4125 3 21138 ±3131 3 25159 ±3198 3 23143 ±2195 3
24h + interval (2d) + 24h 2153 ±0158 20121 ±3156 3 23138 ±3157 3 27162 ±4128 3 25162 ±4156 3
　　从上表可以看出 ,间质细胞对首次刺激的反应敏感 ,睾酮的分泌是刺激前的十几倍 ,于刺激后 72h
达到高峰后逐渐下降。当连续给予刺激时 ,睾酮的分泌受到抑制 ,在 24h 出现分泌峰后不再出现分泌高
峰。而首次刺激后间隔 2d 再刺激 ,间质细胞虽有反应 ,但反应较弱。
992　4 期 培养的睾丸间质细胞对 hCG刺激的反应性
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3 　结论和讨论
体外培养的间质细胞对于 hCG刺激的内分泌反应受到 hCG的浓度、间质细胞的状态和刺激的频率
等多种因素的影响。低浓度的 hCG因不能充分与间质细胞膜上的功能性受体结合 ,达不到最佳刺激效
果 ;浓度过高则易引起脱敏现象 ,使睾酮的分泌受到抑制[5 ,6 ] 。我们的实验结果表明 50 IUΠml (hCG) 能够
起到较好的刺激作用 ,增加 hCG的浓度不能明显促进睾酮的分泌。
在体内 ,睾丸间质细胞在促黄体生成素的脉冲性刺激下分泌睾酮。但在体外 ,间质细胞接近于单一
细胞 ,失去了体内细胞相互作用的环境 ,也失去了促性腺激素节律性刺激作用和某些促生长刺激因子的
作用 ,使间质细胞的功能不能像在体内能得到迅速的调节 ,对于突然性、外源性的敏感性开始下降[7 ,8 ] 。
Risberidge 等、窦京涛等[8 ,9 ]等人的研究表明 ,培养的大鼠间质细胞在前 3d 用 hCG刺激的效果较明显 ,随
着培养时间的延长分泌开始下降。吴婷等[10 ] 的研究则表明转代的睾丸间质细胞不再具备分泌睾酮的
能力。Clark 等[11 ]发现将仔猪睾丸间质细胞 (3～4 周) 进行体外培养 ,发现 3β2HSD mRNA 始终以组成型
方式表达 ,但表达水平始终较低 ;而 P450scc、P45017α mRNA 随着培养时间的延长表达逐渐降低 ,并认为
引起这两种酶 mRNA 水平下降与培养液中能抑制 mRNA 降解的胰岛素水平下降有关 ; 在体外 ,hCG对
于 3 种酶刺激效果在作用 36～48h 时到达最大 ,约为 2～3 倍。我们的结果发现在前 2d 刺激效果特别明
显 ,此后开始下降 ,尽管我们没有直接测定 3 种酶的表达 ,但由于 hCG对于间质细胞功能的影响在较长
时间内是通过影响酶的表达来实现的 ,因此可认为在我们的实验中 ,3 种酶的表达要受到影响 ,这与
Clark 等人的结果有一定的差异。造成这一差异可能与我们直接采用无血清培养基 ,而不是先采用血清
培养液有关 ,因为在血清中存在许多目前尚不清楚的可能影响 hCG作用的因子存在。尽管具体的调节
方式有差异 ,但是上述这些实验都证明了随着在体外的时间的延长 ,睾丸间质细胞分泌睾酮的功能逐渐
减弱。
采取何种频率的刺激才能达到最佳刺激效果 ,对于临床用药有十分重要的意义。夏国良等[12 ] 在研
究催乳素对绵羊间质细胞分泌睾酮的作用机制时 ,发现 hCG在 0～100ngΠml 范围内 ,连续刺激 (每次
48h)会使间质细胞的敏感性降低。我们的研究发现 ,首次刺激的作用效果较好 ,连续刺激 4d (每次 1d) ,
由于 hCG受体全被占据 ,可循环利用的受体数量较少 ,使再次添加的 hCG不能发挥作用 ,因此其分泌活
动受到抑制。间隔 2d ,间质细胞虽然有一定的反应性 ,但刺激效果仍然不理想 ,这可能与间质细胞上可
利用的受体数量较少 ,仅有部份解离的受体能被利用有关。Risberidge 等[7 ] 认为大鼠睾丸间质细胞功能
的恢复至少要 6～10d。综上所述 ,在临床上间隔 10d 左右用药效果可能会更好。
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