全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032229204
水稻高无机磷突变籽粒检测方法的简化
刘庆龙1 ,2 　任学良1 　王玉华1 　舒庆尧1
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ;21 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所 ,浙江 杭州　310021)
摘 　要 :以 1 份高无机磷 (HIP)突变体 (HIPi1)及其亲本协青早 B (协青早 B) 为材料 ,研究了样本前处理、
提取时间和温度、显色时间等因素对水稻籽粒中无机磷 (Pi)含量测定结果的影响 ,提出了适用于 HIP 水
稻突变籽粒筛选和育种的简化检测方法 ,并将其应用于明恢 86 突变体的筛选 ,获得了 7 份 HIP 株系。
关键词 :水稻 ;无机磷 ;突变体 ;测定方法 ;育种
A SIMPLIFIED METHOD FOR SCREENING HIGH INORGANIC PHOSPHORUS
MUTANT GRAINS IN RICE, Oryza sativa L.
LIU Qing2long1 ,2 　REN Xue2liang1 　WANG Yu2hua1 　SHU Qing2yao1
(1. Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029 ;
2. Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang 　310021)
Abstract :Using a high inorganic phosphorus (HIP) mutant line (c. v. HIPi1) and its parent variety (c. v. Xieqingzao B) as
test materials , systematic analysis was conducted for investigating the effects of factors , i . e. , sample pre2treatment , extraction
time and condition , color development time , etc , which affect the measurement of inorganic phosphorus (Pi) content in rice
grains. Based on the results , a simplified method was proposed for screening and development of HIP grains in rice breeding ,
and was successfully applied in the isolation of 7 HIP mutants isolated from Minghui 86 induced by 300 Gy ofγ2irradiation.
Key words :rice ; inorganic phosphorus ; mutant , determination method ; breeding
收稿日期 :2005208223
基金项目 :浙江省科技厅项目 ( G20050191、04 - 06 水稻工程) ,国家自然科学基金项目 (30571131)
作者简介 :刘庆龙 (19682) ,男 ,湖南衡山人 ,副研究员 ,在读博士生 ,从事水稻遗传育种研究 , Email : lqdragon6180 @2631net。舒庆尧为通讯作者 ,
Email : qyshu @zju. edu. cn
　　水稻等禾谷类作物成熟种子中的磷素主要以植酸
磷的形式存在 ,占总磷的 75 %以上 ,其他则为无机磷
(Pi) 和细胞磷以及少量的低价肌醇磷酸磷[1～3 ] 。植
酸 ,即肌醇 - 6 - 磷酸 ,由于易与 Fe、Zn 等金属离子络
合形成人和非反刍动物不易吸收利用的植酸盐 ,从而
被普遍认为是一种抗营养物质 ,在局部地区可能还是
环境中磷富营养化的重要原因之一[1 ,4 ,5 ] 。为此 ,国内
外相继开展了低植酸作物的培育和研究 ,迄今已通过
物理和化学等诱变方法在大麦、玉米、水稻和大豆[6～12 ]
等主要农作物中获得了低植酸突变体[1 ] 。通过对育成
突变体成熟籽粒的磷素组成和含量的研究 ,发现突变
体中植酸含量的下降总是伴随着 Pi 含量的不同程度
的增加 ,突变体的 Pi 含量高于普通野生型品种约 5～
10 倍[8 ,9 ] 。因此 ,在低植酸突变体培育及随后的遗传
改良中 ,往往是通过筛选高 Pi (HIP)籽粒间接选择目标
材料。先前 ,我们对水稻低植酸突变体的诱发、筛选和
培育技术进行了研究 ,并获得了 3 份非致死型突变
体[10 ] 。本实验的目的是通过进一步研究水稻 HIP 籽
粒的检测方法 ,建立起适用于突变体筛选及育种中检
测 HIP 籽粒的简化方法及程序。
1 　材料和方法
111 　供试材料和样本处理
研究材料为杂交籼稻保持系协青早B 及γ射线诱
变育成的低植酸ΠHIP 突变材料 HIPi1。HIPi1 糙米中植
922　核 农 学 报　2006 ,20 (3) :229～232Journal of Nuclear Agricultural Sciences
酸 P 含量比较野生型亲本品种协青早 B 下降约 35 % ,
Pi 含量上升约 315 倍 ,而总磷基本不变[10 ] 。试验所用
水稻成熟籽粒在相同条件下生产、风干。
在整个试验过程中 ,Pi 含量检测以 Larson 等[9 ] 根
据 Chen 等[13 ]建立的检测方法为基础 ,具体步骤为 :选
取饱满成熟籽粒 ,按以下方式进行前处理 : (1) 籽粒直
接破碎 ; (2)去壳 (糙米) 后破碎 ; (3) 去壳而不破碎 (完
整糙米) 。处理后的材料置入 96 孔的酶标板 (一般每
份材料测定 16 粒) ,每孔中放 1 粒 ;加入 200μl 014M
HCL 提取液在室温 (约 24 ℃) 或低温 (4 ℃冰箱) 下提
取。
112 　HIP籽粒检测与 Pi 含量的定量分析
用 8 管排枪吸取经上述消化、提取的浸提液 10μl
于另一酶标板相对应位置的孔中 ,加入 90μl 蒸馏水 ;
同时 ,在酶标板上设置 5 个用磷酸二氢钾配制的标准
P 为参照 ,溶液体积为 100μl ,P 含量分别为 ( I) 0100μg、
( Ⅱ) 01155μg、( Ⅲ) 01465μg、( Ⅳ) 0193μg 和 ( Ⅴ)
11395μg。在样本和标准 P 溶液中加入 100μl 显色剂
[用 2 体积的蒸馏水 , 1 体积 3 mol L - 1 硫酸 , 1 体积
215 %(WΠV)的钼酸铵和 1 体积 10 % (WΠV) 的抗坏血
酸配制而成 ,现配现用 ]。室温下静置 ,显色 1～2h 后 ,
标准溶液分别呈无色、微蓝、浅蓝、蓝和深蓝色。Pi 的
定量分析参照“植物组织中核酸的提取和测定”比色
法[14 ] ,用美国 Beckman 公司生产的 DU530 型紫外分光
仪在 660nm 波长下读取 OD 值。利用标样建立 Pi 浓度
与OD 值的线性方程 ,求得样本提取液中的 Pi 含量。
利用 Microsoft excel 2000 进行数据统计分析 ;利用南京
农业大学王绍华的 STST 方差分析软件分析显著性差
异水平。
113 　明恢 86 HIP突变体的筛选
籼型杂交水稻恢复系明恢 86 干种子 50g 于 2002
年经137 Csγ射线 300Gy 辐射处理后 ,杭州单季少本种
植 M1 ,成熟后 ,混收 M2 种子 320 克 ;2003 年杭州单本
种植 M2 代 ,分单株收获成熟种子 (M2∶3 ) ,去壳后用封
口塑料袋装上 ,密封 ,放在 - 20 ℃冰柜中保存 ,待测籽
粒 Pi 含量 ;2004 年夏天采用酶标板每孔放 2 粒 ,每株
测 8 粒 (4 个孔) 方式进行 HIP 籽粒的初步筛选 ;初选
材料于 2004 年冬海南种植 (M3∶4 ) ,2005 年 3 月籽粒成
熟后按单株收获 ;采用破碎籽粒方式 ,每孔中放 1 粒 ,
每株测定 8 粒进行突变体验证。
2 　结果与分析
211 　不同处理的显色效果
在试验中发现 ,协青早 B 用破碎糙米进行提取
时 ,不管在 4 ℃低温下还是在室温 (约 24 ℃) 条件下消
化 ,显色后颜色在无色与浅蓝色之间 ;而用破碎籽粒进
行提取时 ,显色后颜色接近浅蓝色。但是 ,无论是用破
碎糙米还是破碎籽粒 ,HIPi1 都呈显较深的蓝色 (在标
准 P IV 以上) ,与协青早 B 均有显著差异 (见定量分
析) ,因而 HIP 突变籽粒可以根据显色深浅与普通材料
通过肉眼加以区别。
完整糙米测定时 ,即使每孔加入 2 粒协青早 B 的
糙米 ,显色后仍表现为无色 ,与 1 粒协青早B 糙米呈相
似颜色 ;而 1 粒协青早 B 加 1 粒 HIPi1 的样本则显蓝
色 ,与 1 粒 HIPi1 呈显颜色相似 ,但其染色程度较 2 粒
HIPi1 的样本略浅 (图 1) 。同时 ,我们也发现 ,少量
HIPi1 糙米可能是由于消化不够彻底 ,有时显色较浅 ,
如图 1 之 3H、4D、4G,但仍然可与野生型水稻材料相区
别。
图 1 　完整糙米室温下提取无机磷的比色效果
Fig. 1 　Color development in solution for
Pi digested at room temperature from uncrushed
brown rice grains
1A～2H和 5A～6H 分别为每孔 1 粒和 2 粒协青早 B 糙米 ;3A～4H ,
7A～8H ,9A～10H ,分别为每孔 1 粒 HIPil 糙米 ,1 粒 HIPil + 1 粒协青
早 B 糙米及 2 粒 HIPil 糙米 ;11A～E为 5 个标准 P ,分别相当于每粒
含 P :010 ,311 ,913 ,1816 和 2719μg ;12A～H为空白对照
1A～ 2H and 5A～ 6H: one and two grains each well of XieqingzaoB ,
respectively ;3A～4H ,7A～8H ,9A～10H:one HIPi1 , one HIPi1 plus one
Xieqingzao B , and two HIPi1each well , respectively ; 11A～E are standard
Pi corresponding to P per grain of 010 ,311 ,913 ,1816 and
2719μg , respectively ;12 A～H are blank control
212 　定量分析的影响因子
21211 　前处理和提取时间 　用破碎籽粒和完整糙米
在室温 (约 24 ℃) 下消化不同时间测定 Pi 含量。由图
2 可见 , (1)籽粒经破碎后 ,提取速度较完整糙米快 ,前
者在消化 2h 后 Pi 含量已接近最高值 ,而完整糙米样
本需要在 5h 之后 ; (2) 以破碎籽粒为样本 ,3h 后 Pi 含
032 核　农　学　报 20 卷
量个体之间的差异已经很小 ,而完整糙米样本始终表
现很大 ; (3)无论以破碎籽粒还是完整糙米为样本 ,经
过一定时间 (015～3h) 提取后 ,突变体的 Pi 含量比其
野生型亲本高约 5～10 倍 ,因此上述 2 种样本前处理
方法均可用于区别 HIP 突变体和野生型亲本。
图 2 　样本前处理方式与提取时间室温下对
无机 P含量测定的影响。
Fig. 2 　Effect of sample pre2treatment and
extraction time on inorganic phosphorus content
assay rice grains at room temperature
HP :HIPi1 ;XB :协青早 B
HP and XB represent HIPi1 and its wild2type parent ,
Xieqingzao B , respectively
图 3 　消化温度对破碎籽粒样本无机 P含量测定
结果的影响 (RT:室温约 24 ℃)
Fig. 3 　Effect of temperature of treatment on assay for
inorganic phosphorus content in crushed2grains
RT: room temperature (about 24 ℃) .
完整糙米室温条件下消化 3h 后 ,经室温下显色
015～2 h ,就可以直接通过肉眼能区分 HIP 材料和野
生型品种。由图 2 可知 , HIPi1 消化 3h 后测得的以籽
粒为单位的 Pi 含量较协青早 B 高出 5 倍以上。
21212 　提取温度　提取温度对破碎籽粒 Pi 含量的测
定也有一定影响 (图 3) 。有趣的是 ,低温处理似乎更
有利于 Pi 的提取。采用破碎籽粒提取测定时 ,无论是
协青早 B 还是 HIPi1 突变体 ,4 ℃下过夜处理测得的 Pi
含量都高于在室温 (约 24 ℃) 下处理测得的值 ,但两者
不显著 ;而且两种温度条件下提取 , HIPi1 与协青早 B
的 Pi 含量差值相似 ,不影响高无机磷突变的鉴定结
果。此外 ,4 ℃下与室温下处理 , HIPi1 的变异相对较
小 ,协青早 B 变异较大。提取温度对完整糙米的测定
也得到相似的结果 (这里数据未显示) 。
213 　实例 :HIP突变体的筛选
采用酶标板上每孔放 2 粒完整糙米、每株测 8 粒
(4 孔)的处理方法 ,对γ射线处理的明恢 86 干种子产
生的 3428 个 M2∶3单株材料进行 HIP 突变体筛选 ,获得
7 份种子中无机磷含量高的突变株 ;采用 1 孔 1 粒的
破碎籽粒方法测定 ,确定其中 4 个单株已经是纯合
HIP 突变。在此基础上 ,于 2004 年冬在海南将所获单
株剩余种子种植 ,成熟后按单株收获 M3∶4种子 ,采用破
碎籽粒处理方法测定、验证 ,每株测 8 粒 ,每孔放 1 粒。
结果初筛的 4 个纯合株系不再发生分离 ;另外 3 个杂
合株系有 2 个出现了纯合单株 ,另外 1 个仍处于分离
之中。经过 2 粒完整糙米的初步筛选和 1 粒破碎籽粒
的后代验证 ,可以快速准确地获得高无机磷水稻突变
体。
3 　讨论
本研究对水稻 HIP 籽粒的检测方法进行了实用性
简化的研究 ,明确了不同处理方式对测定结果的影响
及其程度。前人在检测 HIP 水稻籽粒时 ,一般采用破
碎糙米为前处理样本 ,4 ℃下进行消化过夜[9 ] 。从本试
验的结果可知 ,无论是用破碎糙米还是破碎籽粒 ,抑或
是整粒糙米 ,也不管在室温下还是在冰箱 (4 ℃) 中消
化 ,都可以用于 HIP 籽粒的检测。
用破碎籽粒代替破碎糙米可以省去人工去壳的步
骤 ,提高效率。虽然室温和 4 ℃条件消化、提取测得的
Pi 存在差异 ,但不影响比色分辨结果。本试验首次采
用整粒糙米提取、消化 ,虽然与破碎籽粒消化比较 ,籽
粒间变异有所增大 ,这可能与完整糙米消化不完全 ,无
机 P 释放困难有关。但是 ,突变体与普通品种之间的
差异仍然十分显著 ,完全可以在育种中加以应用。而
每孔 2 粒完整糙米消化试验结果表明 ,可以有效区分
待测样本中是否含有 HIP 糙米 ,从而初步筛选 HIP 突
变体 ,至于是否为纯合或杂合 ,肉眼难以区别 ,需要通
过破碎籽粒或破碎糙米、每孔 1 粒的处理方法进一步
132　3 期 水稻高无机磷突变籽粒检测方法的简化
验证。
根据上述结果和实例 ,结合育种中的实际需要 ,提
出如下 HIP 水稻突变体筛选的简化检测方法和程序 :
风干成熟的饱满种子去壳后 ,置入 96 孔酶标板 ,每孔
2 粒 ,每份材料测定 8 粒 (4 个孔) ;加入 200μl 014M
HCL ,室温下提取过夜 ;用 8 管移液枪吸取 10μl 提取
液 ,移入另一洁净酶标板相对应位置的孔内 ,用 90μl
蒸馏水稀释后 ,加 100μl 定磷试剂 ,室温下显色 015～
2h 后 ,通过肉眼观察溶液颜色 ,确定样本的性质 :显深
蓝色 (标准磷液 Ⅴ水平以上) 的样本属 HIP 籽粒 ;显无
色或浅蓝色 (标准磷液 Ⅲ水平以下)的 ,属普通籽粒 ,可
以直接淘汰 ;显蓝色 (标准磷液 Ⅳ水平) 的材料在初步
筛选时应予以保留。在样本前处理时也可以根据实际
情况 ,采用破碎籽粒 (或剪段籽粒 ,数据未发表) ,每孔
放 2 粒 ,每份材料测定 8 粒 (4 个孔) 的方式 ,同上步骤
进行初筛。在 HIP 突变体的改良育种中 ,一般采用 1
孔放 1 粒的破碎 (或剪段) 籽粒进行前处理 ,以后检测
Pi 步骤同上。
此方法与Larson 等[9 ] 的方法相比 ,除样本处理大
大简化外 ,还可以在室温条件下提取 Pi ,又无需 4 ℃条
件下提取过夜 ;在育种实践中 ,显色时也可省略加 90μl
蒸馏水稀释步骤 ,直接取 10μl 浸提液与 100μl 定磷试
剂反应、显色 (数据未发表) 。在本试验中 ,采用了磷酸
二氢钾取代容易吸潮的磷酸氢二钾配制标准 Pi ;在
660nm而不是 820nm 波长下测定 Pi 含量 ,因为此测定
更为灵敏。
利用本试验建立的简化方法和程序 ,较国外水稻
HIP 突变体筛选的方法 ,效率可提高数倍 ,并可以成倍
节约试验试剂。首先 ,样本改通常的 1 粒为 2 粒糙米
或籽粒 ,效率即可提高一倍 ;其次 ,用完整糙米代替破
碎籽粒或破碎糙米又可进一步减小工作量一倍左右。
HIP 的突变发生频率因不同水稻品种而异 ,王玉华等
在诱变处理的珍汕 97B、协青早 B 和秀水 110 等水稻
M2∶3代中筛选 HIP 突变 ,分别测定了 1060、4500 和
33000 株 ,获得真实突变材料分别为 0、2 和 3 份 ,这样
一般筛选群体常常需要几千到几万个单株 ,每个单株
需要检测 8 粒种子[10 ] ,其工作量比较大 ,因此 ,筛选方
法的改进 ,其意义是十分重要的。运用这一简化方法 ,
我们从 3428 份明恢 86 诱变后代 M2∶3中成功筛选获得
了 7 份 HIP 突变材料。
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