全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 042296203
N + 注入诱变芽孢杆菌选育高产抗菌物质菌株
沈　娟　别小妹　陆兆新　吕凤霞　朱筱玉
(南京农业大学食品科技学院 ,江苏 南京　210095)
摘 　要 :本研究通过 N + 注入芽孢杆菌选育高产抗菌物质菌株。注入 N + 的能量为 25keV ,剂量为 50 ×216
×1013 、80 ×216 ×1013 、100 ×216 ×1013 、120 ×216 ×1013和 150 ×216 ×1013 N + Πm2 。结果表明最佳的注入剂
量为 50 ×216 ×1013N + Πm2 ,选育出了 1 株高产菌株 ( Bacillus subtilis fmbJ224) ,其抗菌物质产量是出发菌
株的 1196 倍 ,经传代培养 ,其高产性能稳定。同时通过对该菌株的发酵特性研究 ,发现其产抗菌物质的
模式为延滞合成型。
关键词 :N + 离子 ; 芽孢杆菌 ; 抗菌物质 ; 突变体
THE SCREENING OF Bacillus subtilis STRAIN WITH HIGH2PRODUCED
ANTIMICROBIAL SUBSTANCE USING N+ ION IMPLANTATION
SHEN Juan 　BIE Xiao2mei 　LU Zhao2xin 　LU Feng2xia 　ZHU Xiao2yu
( College of Food Science and Technology , Nanjing Agrucultural University , Nanjing , Jiangshu 　210095)
Abstract :N + ion implantation was used to obtain higher2yield antimicrobial substance. Bacillus subtilis fmbJ was mutated by
25keV N + ion implantation with the dose of 50 ×216 ×1013 , 80 ×216 ×1013 , 100 ×216 ×1013 , 120 ×216 ×1013 and 150 ×
216 ×1013 N + Πm2 1 Results showed that the optimal N + ion dose was 50 ×216 ×1013 N + Πm2 , and a strain of high2yield
antimicrobials was obtained and named as Bacillus subtilis fmbJ2241 Its antimicrobial substance yield was increased by 96 %
than the initial . The fermentation characteristic of the strain was studied , and the mode of producing antimicrobial substance
for the selected strain was arrearage synthesis type.
Key words :N + ion implantation ; Bacillus subtilis ; antimicrobial substance ; mutant
收稿日期 :2005203201
基金项目 :江苏省高新技术资助项目 (BG 2003311)
作者简介 :沈娟 (19812) ,女 ,江苏苏州人 ,硕士研究生 ,主要从事食品微生物及生物技术研究。陆兆新为通讯作者 ,Tel :025 84395683 ,Email : fmb @
njau. edu. cn
　　食品防腐剂对保持食品在加工贮藏中的品质具有
重要作用。目前食品中主要使用的化学防腐剂有苯甲
酸钠、山梨酸钾。虽然化学防腐剂具有成本较低、化学
性能稳定、抑菌谱较广等优点[1 ,2 ] ,但是对人体存在着
不同程度的副作用。随着人们生活水平的日益提高 ,
社会愈来愈崇尚绿色食品和有机食品 ,因此开发天然
食品防腐剂具有重要意义。
近几年来 ,本课题组发现了 1 株 Bacillus subtilis
fmbJ 产生的抗菌物质具有很广的抑菌谱 ,对食品中主
要的革兰氏阳性菌 (蜡样芽孢杆菌 ,藤黄微球菌) 、革兰
氏阴性菌 (荧光假单胞菌 ,大肠杆菌) 和霉菌 (黑根霉 ,
黑曲霉 ,点青霉和总状毛霉) 都具有显著的抑制效果 ,
与以前报道过的微生物防腐剂相比具有明显优势[3 ] 。
离子注入法与传统的物理诱变源 ———紫外诱变、
X射线等相比 ,具有许多独特的特性 :离子注入可产生
集能量沉积、动量传递、质量沉积、电荷中和与交换四
种联合作用为一体的综合生物学效应 ,有较高的突变
频率和丰富的诱变谱 ,已从物质表面修饰等方面发展
成一种新型的生物诱变手段[4 ,5 ] 。本研究应用N + 离子
注入 ,对 Bacillus subtilis fmbJ 进行了诱变 ,以提高抗菌
物质的产量 ,为其进一步工业化应用打下基础。
692　 核 农 学 报　2006 ,20 (4) :296～298Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料与方法
111 　菌种
本实验室保存的芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis fmbJ) 。
112 　培养基
琼脂营养斜面培养基 :牛肉膏 3 gΠL ,NaCl 5 gΠL ,蛋
白胨 10 gΠL ,琼脂 20 gΠL ,蒸馏水 1000ml ,pH712～714 ,
121 ℃高压灭菌 20min。用于转接菌种。
种子培养基 :牛肉膏 5 gΠL ,NaCl5 gΠL ,蛋白胨 10 gΠ
L ,蒸馏水 1000ml , pH712 ～ 714 , 121 ℃ 高压灭菌
20min。用于制备种子液。
摇瓶液体发酵培养基 :Landy 培养基。用于菌体发
酵产抗菌物质。
113 　离子注入
11311 　样品的制备 　经测定出发菌的生长曲线得出 ,
在 12～14h 时菌体浓度在 107～108Πml ,取种子年龄为
14h 的种子液 ,用生理盐水稀释到 105～106Πml , 准确吸
取 1ml ,均匀涂布于 9cm 无菌培养皿上 ,无菌风吹干制
成菌膜后进行离子注入。
11312 　注入方式 　本实验所用的离子束辐照设备由
中国科学院离子束生物工程学重点实验室提供 ,整个
装置由离子源、聚焦系统、质量分析、加速系统、真空系
统、靶室和测控系统等基本部分构成。采用 N+ 注入 ,
注入能量为 25keV ,注入剂量为 0 (CK) ,50 ×216 ×1013 ,
80 ×216 ×1013 , 100 ×216 ×1013 , 120 ×216 ×1013 , 和
150 ×216 ×1013 N + Πm2 , 注入靶室的真空度为 10 - 3 Pa ,
以每个脉冲 5s ,间隔 55s 注入。取出平皿后用 1ml 无
菌水洗脱 ,涂平皿培养 24h。
11313 　筛选 　从平板上随机挑选单菌落转接斜面 ,
37 ℃,培养 24h 后 ,摇瓶培养发酵。测定其抗菌物质产
量。突变株抗菌物质含量大于对照 10 %的突变株指
定为正突变 ,而小于 10 %的菌株指定为负突变 ,在 ±
10 %之间指定为未突变。
11314 　遗传稳定性实验 　将复筛得到的菌株进行传
代 ,共传 10 代 ,对第 1 ,5 ,10 代以 3 个平行样进行诱变
菌产抗菌物质稳定性的测定。
114 　分析方法
11411 　培养方法 　菌株接种到种子液培养基 ,37 ℃,
130rpm ,培养 24 h 后 ,以 5 %(vΠv) 的接种量接入 Landy
培养基 ,30 ℃～35 ℃,160～180rpm ,培养 72 h。
11412 　抗菌物质的提取 　将发酵液于常温下 5000rΠ
min ,15min 离心后取上清液 ,浓 HCl 调 pH 至 210 ,静置
过夜 ,离心收集沉淀 ,再用 NaOH 调 pH 至 710 ,甲醇溶
解 ,过滤后获得提取物 ,待测。
11413 　抗菌物质含量的测定 　抗菌物质含量的测定
采用 HPLC 法 ,色谱条件 :Agillent C18 柱 (250 nm ×416
mm) ;流动相 :乙腈 - 水 (体积比为 1∶4) ,三氟乙酸 012
% ;流速 :015mlΠmin ;检测波长 :230nm ;柱温 25 ℃;进样
量 :20μl。
11414 　菌体含量的测定 　发酵液经一定稀释后在
600nm 处测光密度值。
11415 　pH的测定 　采用酸度计测定。
11416 　还原糖的测定 　DNS 测定法[6 ] :准确吸取 1ml
已离心过的发酵液 ,加入 5ml 的 DNS ,在沸水浴中煮沸
5min ,定容摇匀至 10ml ,空白调零 ,480nm 处测定吸光
度值。
2 　结果与分析
211 　N+ 注入对菌体存活的研究
不同剂量的N + 注入对 Bacillus subtilis fmbJ 的存活
变化如图 1 所示。从图中可以看出 ,小剂量注入时存
活率较高 ,随着剂量的增加存活率下降 ,但随着剂量的
进一步增加存活率有所回升 ,然后逐渐下降 ,整个曲线
成马鞍型变化 ,与文献报道的相同[7 ,8 ] 。与紫外线或 X
射线辐照下的直线型存活曲线有所不同 ,充分说明了
离子注入与其他电离辐射的作用机制存在很大差异。
根据有关报道[4 ,9～11 ] ,低剂量的时候 ,由于离子注入的
射程较短 ,只对细胞表面进行损伤和刻蚀 ,因此存活率
较高。随着剂量的增加 ,细胞表面刻蚀严重 ,离子损及
细胞内部并产生大量自由基和软射线等 ,致使存活率
下降 ;但增加一定剂量后 ,由于连续注入的电荷堆积产
生很强的库仑力 ,对注入细胞形成一个“保护屏障”,阻
碍了后续注入离子对细胞损伤 ,起到了对细胞的保护
作用 ,而且大量堆积的电荷形成一个弱电场 ,这种电场
的效应可以激活细胞的各种修复酶 ,从而提高了损伤
修复的效率。
212 　注入剂量对突变率的影响
本研究选择了 50 ×216 ×1013 、80 ×216 ×1013 、100
×216 ×1013 、120 ×216 ×1013和 150 ×216 ×1013 N + Πm2 5
个剂量对出发菌的突变率进行研究。其结果见图 2 ,
随着注入剂量的增加 ,正突变率先增后减 ,在剂量 50
×216 ×1013N + Πm2 时正突变率达到 3 %为最大。而负
突变率随着剂量的增加不断增加 ,到达一定值后开始
下降 ,随后又略有上升。通过比较 (图 1 和图 2) 存活
率与突变率发现 ,在剂量为 50 ×216 ×1013 、120 ×216 ×
1013N + Πm2 时存活率都比较高 ,约为 35 % ,此时的正突
792　4 期 N + 注入诱变芽孢杆菌选育高产抗菌物质菌株
图 1 　25keV N + 注入芽孢杆菌的存活效应
Fig. 1 　Survial fraction of Bacillus subtilis fmbJ
by N + ion implanation
变都比较高。而注入剂量在 80 ×216 ×1013 、100 ×216
×1013 和 150 ×216 ×1013 N + Πm2 时 ,存活率在 10 %～
20 % ,这时的负突变率高于正突变率。
图 2 　25keV N + 注入芽孢杆菌的突变率
Fig. 2 　Mutation rate of B . subtilis fmbJ treated
by N + with an energy of 25keV
213 　筛选
从斜面挑取 363 株诱变菌 ,经初筛得到 149 株高
于出发菌的菌株 ,对其中明显高于原始菌的 71 株进行
复筛 ,得到 32 株进行传代 ,共传 10 代。对这些菌株第
1 ,5 ,10 代以 3 个平行样进行稳定性测定 ,经过 10 代以
后 ,有些菌株产生抗菌物质的含量明显下降 ,其中有 7
株菌较稳定 ,而编号为 224 的菌株稳定且产量最高 ,3
个平行样误差较小 ,所以命名 Bacillus subtilis fmbJ224
为诱变高产菌株 ,其抗菌物质含量是出发菌的 1196
倍 ,结果如表 1。
214 　高产菌 Bacillus subtilis fmbJ224 的发酵动态分析
所选育的菌 Bacillus subtilis fmbJ224 活化后接入到
种子培养基 ,然后以 5 %的接种量接入发酵培养基进
行摇瓶培养 ,每隔 10h 测产物含量 ,菌体数量 ,pH 值和
还原糖 ,结果见图 3。在前 20h 菌体增加 ,20h 后进入
平衡期且缓慢下降。发酵过程中还原糖前 20h 消耗比
较快 ,20h 后趋于平缓 ,这表明碳源在发酵过程中的作
用是供菌体的生长。发酵前 30h 抗菌物质的产量迅速
上升 ,到 50h 时到达高峰 ,50h 后趋于平缓下降。抗菌
物质的产生随着菌体的生长而合成 ,在菌体进入平衡
期后产物的合成还延续较长时间。由此可见 ,该菌株
产抗菌物质的模式为延滞合成型。
表 1 　Bacillus subtilis fmbJ224 的遗传稳定性
Table 1 　The heredity stability of Bacillus subtilis fmbJ224
变菌株
mutation strain
抗菌物质含量
antimicrobial substance content (μgΠml)
第 1 代 the first generation 1303179 ±11134
第 5 代 the fifth generation 1317198 ±9181
第 10 代 the tenth generation 1311190 ±18117
原始菌 the original strain 665192 ±5149
图 3 　Bacillus subtilis fmbJ224 摇瓶发酵曲线
Fig. 3 　Fermentation curve of Bacillus subtilis
fmbJ224 in shaking flask
3 　结论
离子注入微生物体内能产生可见的生物效应 ,其
不仅可以引起细胞损伤死亡 ,而且可以导致突变的发
生[12 ] 。作为一种有效的诱变方法 ,我们采用 N+ 注入
选育芽孢高产抗菌物质菌株 ,表现出了很好的应用效
果。通过试验 ,最终筛选到了一株抗菌物质产量是原
始菌 1196 倍的高产菌 ,初步确定了注入的效应曲线和
最佳注入剂量。通过其发酵特性的研究 ,该菌株产抗
菌物质的模式为延滞合成型。本研究为下一步培养基
优化及进行工业化应用奠定了基础。
(下转第 330 页)
892 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (4) :296～298
图 2 双线内安排同一批产品辐照 ,双线外的安排另一
批辐照。
从双线内辐照产品的剂量分布情况看 ,原地翻面
辐照方式其剂量不均匀度 U = 2146 ,超过了质量控制
标准 ,在产品辐照中不宜采用。通过实验 ,了解了原地
各点辐照产品在辐射场中的剂量分布 ,为了保证辐照
质量 ,在实际工作中 ,产品的辐照主要在双线内进行 ,
并采用如下双面辐照工艺 :辐照一半时间后 ,两侧和中
间对调 ,同时上下和中间对调 ,并前后翻转 ,则产品箱
中的吸收剂量不均匀度 U 可控制在辐照加工质量控
制标准 (U < 2)以内 ,并在平时产品辐照中结合实际剂
量跟踪 ,确保产品辐照质量。
双线外作为产品辅助辐照方式 ,以提高60 Co 源的
利用率。
从表 2 可以看出 ,双线内模拟计算值与实验值大
多在 20 %以内符合 ,说明本文计算所采用的计算模
式、假设条件和计算参数是可行的 ,所采用的模型符合
辐射作用的主要因素 ,基本反映了辐照产品中剂量分
布的真实情况 ,可与实际测量相结合 ,在平时实际剂量
计跟踪有限的情况下 ,可通过模拟计算了解更多点的
剂量情况 ,双线外由于偏离单板源正面较远 ,模拟效果
较差。
模拟计算结果偏差的主要来源 : ⑴计算所用参数 ,
如几何结构参数的简化等 ; ⑵测量结果的不确定度 ,包
括剂量计本身及测量位置点的不确定度等引起的偏
差 ; ⑶计算时所用替代物与实际辐照物的等效性有差
异。
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(上接第 335 页)
用在于它具有使客户价值最大化的分析能力[2 ] 。辐射
加工企业只有对客户资料进行分析 ,了解客户需要什
么、追求什么样的利益、愿以何种方式达到等具体情
况 ,把握客户行为模式的变化及发展趋势 ,再结合本企
业的现实能力和条件 ,选择可行方案。
31314　依据自身特点制定并实施辐射加工企业的
CRM策略 　企业应根据客户资料分析提出的 CRM 实
施方案 ,制定切实可行的 CRM 决策和行动计划 ,并在
实际工作中倡导及不断地完善。实施 CRM 的目的是
开发和保持客户 ,这不仅要求市场分析、市场营销、销
售、客户服务等职能部门的积极合作 ,而且也涉及到研
发、生产、质量控制等系统 ,需要整个企业的全面配
合[3～6 ] 。
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