全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 012045204
利用二次回归正交设计优化香石竹叶片再生体系中
62BA 和 NAA 的浓度组合
刘彩霞1 　孙振元1 　刘　军2 　李银凤1
(11 中国林业科学研究院林业研究所Π国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091 ;
21 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 ,北京　100091)
摘 　要 :以香石竹叶片为外植体 ,利用二次回归正交设计对其再生体系建立中的关键因素 62BA 和 NAA
的浓度及其组合进行定量优化。结果表明 ,增殖培养基中 62BA 浓度为 1121mgΠL、NAA 浓度为 0135mgΠL
时 ,不定芽增殖数量可达 3165 ; 62BA 浓度为 1120～1179mgΠL ,NAA 浓度为 0115～0163mgΠL 时 ,不定芽增
殖系数大于 2 ,可靠性为 95 %。
关键词 :香石竹 ;再生体系 ;二次回归正交设计 ;增殖系数
APPLICATION OF QUADRATIC REGRESSIVE ORTHOGONAL DESIGN TO OPTIMIZE
REGENETATION SYSTEM OF Dianthus caryophyllus L.
LIU Cai2xia1 　SUN Zhen2yuan1 　LIU Jun2 　LI Yin2feng1
(11 Research Institute of Forestry , Chinese Academy of ForestryΠKey Laboratory of Forest Cultivation , State Forestry Administration , Beijing 　100091 ;
21 Research Institute of Forest Ecology , Environment and Protection , Chinese Academy of Forestry , Beijing 　100091)
Abstract :Optimal concentrations of 62BA and NAA and their combinations were tested with quadratic regressive orthogonal
design for their effect on shoot regeneration of Dianthus caryophyllus L. Results showed that the best combination of the 62BA
and NAA for the shoot regeneration was 62BA 1121mgΠL and NAA 0135mgΠL , and the propagation coefficient reached 31651
When 62BA concentration was in a range of 1120～1179mgΠL and NAA concentration in 0115～0163mgΠL , the propagation
coefficient more then 2 with the probability of 95 %.
Key words : Dianthus caryophyllus L. ;regeneration system ;quadratic regressive orthogonal design ;propagation coefficient
收稿日期 :2007201223 　接受日期 :2007206201
作者简介 :刘彩霞 (19812) ,女 ,河北宣化人 ,硕士研究生 ,主要从事植物组织培养与分子生物学研究。
通讯作者 :孙振元 (19642) ,男 ,河北献县人 ,研究员 ,主要研究方向为园林植物分子育种。Tel :010262889626 ; E2mail :sunzy @caf . ac. cn　　植物的组培再生是一个复杂的生物学系统 ,除了植物激素浓度和配比之外 ,还受到外植体类型、温度、光照、pH值等许多内外因素的影响 ,因此 ,要实现植株再生体系的最优化 ,采用常规正交设计往往需要大量的试验。二次回归正交设计是回归分析法和正交试验法的有机结合。它采用组合设计 ,对试验结果用方程拟合 ,得到数学模型 ,利用计算机进行模拟 ,从而求得最优解和相应的最优组合。二次回归正交设计具有试验次数少 ,数据处理简便 ,并可进行优化分析等优点 ,是一种广泛用于处理多因素试验的科学方法[1 ,2 ] ,在杂交水稻[3 ] 、微型月季[4 ] 、爆仗竹[5 ] 等植物组织培养研究 中已有应用。香石竹 ( Dianthus caryophyllus L. ) 又名康乃馨、麝香石竹 ,是世界四大切花之一 ,园林应用广泛。对香石竹的离体培养虽已有研究 ,但对于其组培再生体系中各影响因素优化研究报道较少。另外 , 多选用茎尖[6 ,7 ] 、茎段[8～10 ]作为外植体 ,利用叶片作为外植体的再生率较低 ,报道较少。许多研究认为再生体系中62BA和 NAA 的浓度及其组合是关键因素[11 ,12 ] 。因此 ,本研究选取香石竹叶片为外植体 ,利用二次回归正交设计对香石竹再生体系中 62BA 和 NAA 的浓度及其组合进行了定量优化 ,既为进一步优化温度、光照、pH 值
54　核 农 学 报　2008 ,22 (1) :45～48Journal of Nuclear Agricultural Sciences
等组培影响因素奠定基础 ,也为遗传转化提供良好的
受体系统。
1 　材料和方法
111 　试验材料
香石竹栽培种 Tasman 无菌苗由中国农业科学院
蔬菜花卉研究所提供。
112 　二次回归正交试验设计
11211 　二次多项式回归方程的确立 　本试验只对 62
BA 浓度和 NAA 浓度两个因素进行筛选 ,因此建立二
元二次回归方程 y = b0 + b1χ1 + b2χ2 + b12χ1χ2 +
b11χ21 + b22χ22 ( b0 为常数项 , b1 、b2 为一次项回归系数 ,
b12 为交互项回归系数 , b11 、b22 分别为 62BA 浓度 和
NAA 浓度的二次方效应回归系数) 。
11212 　62BA 和 NAA 各 5 个浓度水平的确定 　根据本
实验室前期研究 ,确定 62BA 的浓度范围为 0～2mgΠL ,
NAA 的浓度范围为 0～1mgΠL。在此范围内 ,根据二次
回归正交设计 ,62BA 和 NAA 浓度分别取 5 个水平 ,编
码值记为 - γ, - ι,0 ,ι,γ, 各因素变化区间记为Δj ,
在零水平试验组合设置 6 次重复。各编码值确定及各
浓度计算方法参考续九如等[13 ]的方法 ,结果见表 1。
11213 　试验方案的确定　选用 L4 (23 ) 正交表 (续九如
等 ,1995) [13 ] (表 2) 。把 62BA 浓度和 NAA 浓度编码值
分别安排在所选正交表的有关列上 ,表内的处理组合
号即为试验号。为估算回归方程中的常数项 b0 ,在正
交表的最前面添上一个编码值全为“1”的χ0 列。在正
交表的各因素χ1 、χ2 列下面均添加γ与 - γ行。交
互列χ1χ2 的编码值为χ1 、χ2 列编码值的积。为避免
直接平方后组合设计的正交性受到破坏 ,对二次项列
χ21 和χ22 的编码值进行中心化处理 ,转变成离均差 ,以
中心化编码值 x′j 代替平方项编码值 :
x′j = x2j - 1N ∑
N
1
x
2
j
其中 xj 为正交设计中各因素在不同处理中的编码值。
表 1 　二次回归正交设计的 62BA 与 NAA 的编码与浓度
Table 1 　Code and concentration of 62BA and NAA
in quadratic regressive orthogonal design
编码 code 62BA(mgΠL) NAA(mgΠL)
-
γ= - 1132 0 0
-
ι= - 1 0. 24 0. 12
0 1. 00 0. 50
ι= 1 1. 76 0. 88
γ= 1132 2. 00 1. 00
Δj 0. 76 0. 38
113 　62BA 和 NAA 优化组合筛选试验
香石竹栽培种 Tasman 无菌苗在不添加任何植物
激素的 MS 培养基上培养 30d 后 ,用镊子轻轻撕下新
增殖的顶芽下的叶片 (带叶子基部) ,接种于 14 种含不
同 62BA 和 NAA 浓度组合的增殖培养基上 (表 2) 。其
中 9～14 为重复 6 次的零水平浓度组合。每个处理接
种 10 皿 ,每皿 5～6 个外植体。培养温度为 20 ℃～
22 ℃,光照 12hΠd ,光照强度 2000lx。培养 30d 后统计各
处理的不定芽数。不定芽增殖系数为不定芽数与接入
外植体数之比。
表 2 　香石竹二次回归正交设计的试验方案与试验结果
Table 2 　The quadratic regressive orthogonal design and results of 62BA and NAA for shoot propagation of carnation
处理
combination
Χ0
χ1
(62BA) χ2( NAA) χ1χ2 χ′1 χ′2 外植体数No. of
explants
不定芽数
No. of
shoots
增殖系数
propagation
coefficient
1 1 1 1 1 014654 014654 60 137 2128
2 1 1 - 1 - 1 014654 014654 58 164 2183
3 1 - 1 1 - 1 014654 014654 56 62 1111
4 1 - 1 - 1 1 014654 014654 60 108 118
5 1 1132 0 0 112078 - 015346 54 136 2152
6 1 - 1132 0 0 112078 - 015346 57 45 0179
7 1 0 1132 0 - 015346 112078 59 142 2141
8 1 0 - 1132 0 - 015346 112078 58 191 3129
9 1 0 0 0 - 015346 - 015346 60 212 3153
10 1 0 0 0 - 015346 - 015346 60 215 3158
11 1 0 0 0 - 015346 - 015346 55 199 3162
12 1 0 0 0 - 015346 - 015346 54 188 3148
13 1 0 0 0 - 015346 - 015346 57 193 3139
14 1 0 0 0 - 015346 - 015346 60 206 3143
∑χjy 38106 414836 - 214016 0114 - 615595 - 213952 38106
64 核　农　学　报 21 卷
2 　结果与分析
211 　统计分析
根据表 2 有关数据 ,参照续九如等[13 ] 的统计方法
计算各项回归系数 ,得到二元二次回归方程 y^ =
315072 + 01599χ1 - 013209χ2 + 01035χ1χ2 - 110806χ21
- 013946χ22 。显著性检验表明 ,所得回归方程极显著
(表 3) 。对应于 62BA 浓度的回归系数 b1 、b11和对应于
NAA 浓度的回归系数 b2 、b22 均极显著 ,而交互项系数
b12未达显著水平 (表 4) 。
由拟合测验 (表 5) 可知 ,纯误差平方和与失拟平
方和的差异性检验未达显著水平 ( F < F0105 ) ,说明回
归方程拟合良好。将自变量编码值χj 转换为原自变
量 Zj (因素 j 的浓度水平) ,得以 Zj 为自变量的回归方
程为
y^ = 016479 + 414693 Z1 + 117670 Z2 + 011212 Z1 Z2
- 118708 Z21 - 217325 Z22 。分别对 Z1 、Z2 微分求导 , 得不
定芽增殖系数达最大时 62BA 与 NAA 的浓度分别为
1121mgΠL 和 0135mgΠL。此时 ,不定芽的最大增殖系数
为 3165 ,明显高于原试验设计中所有处理组合的增殖
系数。
表 3 　回归方程的显著性检验
Table 3 　Significance test of regressive equation
变异来源 source 自由度 Df 平方和 SS 均方 MS F Fα(5 ,8)
回归 regression 5 1114946 212989 25611265 3 3 F0105 (5 ,8) = 3169
离差 deviation 8 010718 010090 F0101 (5 ,8) = 6163
总计 total 13 1115664
注 :33 ,表示差异显著水平 ( P < 0101) .
Note :33 ,indicate significant difference at 0. 01 level ( P < 0101) 。
表 4 　各项回归系数的显著性检验
Table 4 　Significance test of regressive coefficients
系数 Coefficients b1 b2 b12 b11 b22
F 2991230233 851852533 015459 7891709633 1051294033
Fα F0105 (1 ,8) = 5132 F0101 (1 ,8) = 11126
表 5 　回归模型的拟合测验
Table 5 　Fitting test of regressive model
变异来源 source 自由度 Df 平方和 SS 均方 MS F Fα(3 ,5)
失拟 distoration fit verification 3 010329 010110 114059 F0105 (3 ,5) = 5141
纯误差 simple error 5 010390 010078
总计 total 8 010719
212 　模拟寻优
本试验为 2 因素 5 水平 ,共有 52 = 25 个组合 (处
理) 。其中不定芽增殖数 > 2 的组合有 12 个 ,这 12 个
组合在 62BA 和 NAA 各 5 个水平上的频率见表 6。
将表 6 中χ1 与χ2 的置信区间代入 Zj = Z0 j +
Δjχj ,可以算出χ1 、χ2 在 95 %置信区间的实际用量分
别为 1120～1179mgΠL 和 0115～0163mgΠL ,即当培养基
中 62BA 浓度和 NAA 的浓度分别控制在该范围内时 ,
不定芽增殖系数大于 2 ,其可靠性为 95 %。
3 　讨论
二次回归正交设计是根据数理统计学原理 ,利用
正交设计 ,对多个因素同时进行考查。在各个因素都
处于变动的情况下 ,用一套规范化的正交表来合理地
安排试验 ,可以实现以较少的试验获得精度较高的回
归方程。在许多作物和园林植物组织培养研究中均得
到成功应用。
一般认为 ,植物的器官分化决定于植物体内细胞
分裂素和生长素类激素的浓度和比例 ,62BA 可以有效
地诱导芽的萌发与不定增殖 ,而低浓度的 NAA 可以促
进茎的伸长。因此在香石竹植株再生体系的优化中选
择 62BA 浓度与 NAA 浓度组合作为主要研究因素。研
究中所用的实验材料香石竹无菌苗已经在不添加任何
植物激素的 MS 培养基上培养了 30d ,可以认为基本上
去除了外源激素背景的影响。
74　6 期 利用二次回归正交设计优化香石竹叶片再生体系中 62BA 和 NAA 的浓度组合
表 6 　12 个组合在 62BA 和 NAA 各 5 个水平上的频率
Table 6 　Frequency of factorial levels of 12 combinations
因素水平
levels
χ1 62BA χ2 NAA
次数
times
频率
frequency
次数
times
频率
frequency
-
γ= - 1132 0 　 0 　 3 　 012500
-
ι= - 1 0 0 3 012500
0 5 014167 3 012500
ι= 1 4 013333 2 011667
γ= 1132 3 012500 1 010833
合计 total 12 110000 12 110000
平均数 mean …X1 = 0166 …X2 = - 0130
标准误
standard error
S€x1 = 01173 S€x1 = 01287
95 %置信区间
95 % confidence limit 0128～1104 - 0193～0133
　　研究表明 ,62BA 与 NAA 两个因素对于香石竹不
定芽分化均有显著影响 ,培养基中 62BA 与 NAA 组合
的最 佳 浓 度 配 比 是 62BA 为 1121mgΠL ; NAA 为
0135mgΠL。在该培养基上 ,不定芽增殖系数可达 3165。
而在含 62BA 为 1120～ 1179mgΠL 和 NAA 为 0115～
0163mgΠL 的培养基上 ,不定芽增殖系数可达 210 以上
(95 %置信区间) 。为验证以上结果的可靠性 ,在该置
信范围内随机抽取的浓度组合 62BA 112mgΠL 和 NAA
013mgΠL 的浓度组合 ,按照 62BA 和 NAA 优化组合筛选
试验 (113)同样的条件下进行验证实验 ,得到平均增殖
系数为 3157。这进一步说明了所得结果的可靠。因
此可以认为利用二次回归正交设计可以实现植物再生
过程中的植物激素浓度和配比优化。
该研究在多个因素都处于变动的情况下 ,通过用
一套规范化的正交表来合理地安排试验 ,成功地实现
以较少的试验获得精度较高的回归方程和精确可靠的
试验结果。进一步的研究是将二元回归正交设计应用
于外植体类型、温度、光照、pH值等植株再生影响因素
的优化试验。
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