全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 032276204
星形孢菌素产生菌的选育研究
蒲小明1 　林壁润1 　胡美英2 　沈会芳1
(11 广东省农业科学院植物保护研究所 ,广东 广州　510640 ; 21 华南农业大学 ,广东 广州　510640)
摘 　要 :用紫外线和微波复合诱变星形孢菌素产生菌 ( Stretomyces sp . 4138) ,以硫酸链霉素抗性偶联进行
筛选。结果表明 :紫外线处理 50s 后 ,在含硫酸链霉素 018μgΠml 的分离培养基上筛选到突变株 HZ209 ,比
原始菌株 H20 效价提高了 30146 % ;再以 HZ209 为出发菌株进行微波处理 30s 后 ,硫酸链霉素抗性筛选
获得突变株 HW225 ,比原始菌株 H20 效价提高了 284120 %。菌株 HW225 经多次传代 ,遗传性状稳定。
关键词 :紫外线 ;微波 ;硫酸链霉素
SCREENING OF STAUROSPORINE2PRODUCING MUTANT STRAIN
PU Xiao2ming1 　LIN Bi2run1 　HU Mei2ying2 　SHEN Hui2fang1
11 Plant Protection Research Institute , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangzhou , Guangdong 　510640 ;
21South China Agricultural University , Guangzhou , Guangdong 　510642)
Abstract :A staurosporine2producing strain Stretomyces sp . 4138 was treated with ultraviolet and microwave , and then selected
by resistant combined material streptomycin sulfate. With 50 seconds ultraviolet treatment , a mutant strain HZ209 was obtained
after plate screening on the isolation medium plus ( streptomycin sulfate 018μgΠml) . The titer of HZ209 was 30146 % higher
than the parent strain H201 Then the strain HZ209 was treated 30s by microwave and combined with streptomycin sulfate to get
a mutant strain HW225 , whose titer was 284120 % higher than that of the original H201 The high productivity of the strain
HW225 could be inherited stably.
Key words :ultraviolet ;microwave ;streptomycin sulfate
收稿日期 :2007208210 　接受日期 :2007210210
基金项目 :国家“863”计划 (2006AA10A209)和国家自然科学基金 (30471161)
作者简介 :蒲小明 (19812) ,男 ,湖南芷江人 ,硕士研究生 ,从事微生物诱变育种研究。E2mail :Pxm96 @21cn. com
通讯作者 :林壁润 (19632) ,男 ,广东揭阳人 ,研究员 ,农用抗生素的研制。Tel :020287597453 ; E2mail :linbr @1261com　　从自然环境中分离到产活性物质的野生菌株 ,其代谢产物含量一般都非常低。链霉菌 4138 ( Stretomycessp . 4138)是从南海近海岸红树林泥土中分离得到的 ,星形孢菌素[1 ]是其代谢产物之一。目前国内外对星形孢菌素的研究是诱导各类细胞调亡[2 ,3 ] ,涉及的应用主要在抗肿瘤药物方面。Stretomyces sp . 4138 的原始菌株效价仅为 12μgΠml ,远远达不到生产的要求。本研究试图通过诱变来提高菌株的生产性能 ,然后再进行发酵条件优化研究。在实际生产中常用的诱变方法包括以紫外线诱变和微波诱变为主的物理诱变及以碱基类似物 (52BU、22AP 等)和烷化剂 ( EMS、NTG等) 为诱变剂的化学诱变。紫外线和微波复合诱变选育优良突变株 ,被国内科研工作 者所采用 ,并取得了很好的效果[4 ,5 ] 。紫外线诱变的机制主要是形成的嘧啶二聚体发生交联作用 ,阻碍双链分开 ,使子代 DNA 形成缺口 ,造成碱基序列与母链不同而引起突变 ;微波诱变机制是高频交变的电磁波造成极性分子的迅速震动 ,使 DNA 分子氢键和碱基堆积化学力受损 ,使得 DNA 结构发生变化 ,从而发生遗传变异。通过诱变处理 ,在微生物群体中会出现各种突变型的个体 ,但其中多数是负变株 ,正变株所占比例极小 ,必须设计和采用效率较高的筛选方法。目前常用的筛选方法有随机筛选和推理选育两种 ,而采用常规随机筛选的方法效率低 ,故本文采用硫酸琏霉素抗性偶联进行选育。
672　 核 农 学 报　2008 ,22 (3) :276～279Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料与方法
111 　材料
供试菌株链霉菌 4138 ( Stretomyces sp . 4138) 由广东
省农业科学院植物保护研究所提供。
分离培养基成分为 KNO3 012 %、K2 HPO4 011 %、
MgSO4 011 %、NaCl 0105 %、海水精 013 %、可溶性淀粉
2 %、琼脂粉 116 %、水 1000ml ,pH :712～714。
发酵培养基成份为蔗糖 2 %、大豆蛋白粉 3 %、海
水精 013 %、CaCO3 012 %、KNO3 012 %、MgSO4 ·7H2O
011 %、K2 HPO4 ·3H2O 0106 %、FeSO4 ·7H2O 01002 %、水
1000ml ,pH 712～714。
112 　方法
11211 　孢子悬浮液制备 　茄子瓶菌种斜面在 28 ℃±
1 ℃恒温培养箱中培养 4 - 6d ,用 100ml 0185 %灭菌生
理盐水洗下孢子 ,加入适量玻璃珠 ,振荡 30min ,然后
用纱布过滤 ,制得孢子悬浮液 ,再用 0185 %灭菌生理
盐水稀释至所需浓度 ,血球计数板计数孢子浓度约为
106～107 个Πml。
11212 　菌株培养条件 　32 ℃下 160rΠmin 振荡培养 90
- 96h。
11213 　硫酸链霉素对产生菌的抑制 　配置硫酸链霉
素浓度分别为 012、014、016、018、110、112μgΠml 的分离
培养基 ,取稀释的 011ml 孢子悬浮液均匀涂布于以上
培养基平皿 ,每处理重复 3 次 ,置于 28 ℃±1 ℃培养箱
中倒置培养 4d。
11214 　星形孢菌素产生菌的诱变选育　紫外诱变采
用紫外线灯照射 ,功率为 15W ,波长 25317nm ,照射距
离为 30cm。吸取孢子悬浮液菌液 5ml 于直径 9cm 的
无菌培养皿中 ,分别进行 20、30、40、50 和 60s 的紫外线
照射。紫外线处理后 ,孢子悬浮液均匀涂布于分离培
养基平皿上 ,28 ℃±1 ℃避光倒置培养 4d。
微波诱变采用频率为 2450M Hz 的微波炉 ,最小功
率 80W ,最大功率 800W。选取最小功率为诱变剂量。
取 10ml 孢子悬浮液注入直径 9cm 无菌培养皿中 ,分别
处理 15、20、25、30 和 40s 后 ,均匀涂布于分离培养基平
皿上 ,28 ℃±1 ℃避光倒置培养 4d。
11215 　优良菌株的菌落形态比较 　诱变选育的优良
菌株 HW225、HW208、HW239、HZ209 和原始菌株 H20 接
种平皿 ,28 ℃±1 ℃培养 5d ,观察比较菌落表面气生菌
丝形态和可溶性色素颜色。
11216 　HW225 遗传稳定性研究 　优良菌株 HW225 连
续传接 5 代 ,摇瓶发酵测量菌株效价。
113 　星形孢菌素检测
11311 　样品的前处理 　量取 20ml 发酵液于离心管
中 ,4800rΠmin 离心 10min ,弃上清液 ,沉淀菌丝体用
20ml 80 %的乙醇浸泡并振荡 (160rΠmin) 5h 以上 ,用直
径 0145μm 微孔滤膜过滤 ,滤液备用。
11312 　色谱检测方法 　采用反相高效液相色谱法测
定发酵产物中星形孢菌素含量[6 ] 。staurosporine 标准
品为美国 Sigma 公司产品 ,纯度 ≥99 %。Waters Delta
600 型高效液相色谱仪 ,色谱柱为 Waters Sun FireTM C18
5μm 416mm ×250mm Column ,柱温 40 ℃,流动相比例为
V甲醇∶V水 = 80∶20 ,流动相流速 015mlΠmin ,进样量 10μl。
标准曲线 : Y= 50580X + 135557 ,R2 = 019999 ,线性范围
(7178μgΠml～500μgΠml) 。
2 　结果与分析
211 　硫酸链霉素对孢子萌发的影响
从表 1 可知 ,随着硫酸链霉素浓度的提高 ,孢子致
死率逐渐提高。当硫酸链霉素浓度为 018μgΠml 时 ,孢
子致死率为 81184 % ,孢子致死生长受到明显的抑制。
表 1 　不同硫酸链霉素浓度处理的孢子致死率
Table 1 　The spores lethal rate cultured at different concentration of streptomycin sulfate
硫酸链霉素浓度
concentrations of streptomycin sulfate (μgΠml) 014 016 018 110 112 CK
孢子致死率 spores lethal rate ( %) 52156 61146 81184 91164 99134 0
注 :孢子致死率为 3 次重复平均值。下表同。
Note : The lethal rates are the average of three replicates. The same as in the following tables.
212 　紫外诱变
21211 　紫外线诱变剂量的选择 　紫外线对原始菌株
H20 致死情况如表 2 所示。随着紫外照射时间增长 , 孢子致死率逐渐增加。照射 50s 孢子致死率达到94 % ,照射 60s 孢子致死率达到 99193 %。因此选择紫外线诱变的时间为 50s。
772　3 期 星形孢菌素产生菌的选育研究
21212 　紫外线诱变选育抗硫酸链霉素菌株　紫外线
处理 50s 后 ,在含有 018μgΠml 硫酸链霉素的分离培养
基上选育出 32 个菌株 ,成功转接 27 个菌株。摇瓶发
酵 ,液相色谱测定各菌株的发酵单位 ,菌株 HZ209 的效
价为 16102μgΠml ,提高了 30146 % ,因此把菌株 HZ209
作为下一步微波诱变的出发菌种。
表 2 　不同时间紫外线照射处理后菌株 H20 孢子致死率
Table 2 　The spore lethal rate of strain H20 treated by UV irradiation
照射时间 irradiation time (s) 0 20 30 40 50 60
孢子致死率 spore lethal rate ( %) 0 67159 76106 84191 94100 99193
表 3 　不同时间微波处理后菌株 HZ209 孢子致死率
Table 3 　The spore lethal rate of strain HZ209 after microwave treatment
处理时间 time span of treatments(s) 0 15 20 25 30 40
孢子致死率 spore lethalrate ( %) 0 48181 65103 85185 97148 99197
213 　微波诱变
21311 　微波诱变剂量的选择 　用不同时间的微波处
理菌株 HZ209 ,其孢子死亡率随着处理时间的延长而
增加。处理 30s 孢子死亡率为 97148 % ,处理 40s 孢子
死亡率为 99197 % ,故选择 30s 为微波诱变的诱变时
间。
21312 　微波诱变选育抗硫酸链霉素菌株　微波处理
30s 后 ,在含有硫酸链霉素浓度为 018μgΠml 的分离培 养基上选育出 51 个菌株 ,成功转接 39 个菌株。摇瓶发酵 ,液相色谱测定各菌株的发酵单位 ,发现 3 个菌株HW208、HW225 和 HW239 的效价分别为 23141、47118和 32123μgΠml ,相对于原始菌株的效价分别提高了90164 %、284120 %和 162146 %。214 　优良菌株的菌落形态比较诱变选育出的优良菌株菌落形态见图 1 ,菌落形态描述见表 4。
图 1 　突变菌株的菌落形态
Fig. 1 　The colony morphology of mutant strains after UV and microwave treatment
表 4 　突变菌株的菌落形态特征
Table 4 　The morphological characteristic of mutant strains
突变菌株
mutant strains
直径
diameter (mm)
菌落表面形态
surface morphology of colony
HW225 4～6 青灰色 ,凹皱不平 ,不产色素 bluish grey , not smooth , no dye
HW208 3～5 乳白色 ,草帽状 ,不产色素 milk white , straw2hat shaped , no dye
HW239 2～4 青白色 ,中间凸出并有小黄点 ,不产色素 bluish white , bulge in the center with yellow dots , no dye
HZ209 3～5 灰白色 ,扁平 ,不产色素 grey , flat , no dye
H20 2～4 青白轮纹相间 ,不产色素 cyan and white alternated , no dye
215 　优良菌株 HW225 遗传稳定性
由表 5 可知 ,优良菌株 HW225 在斜面培养基上连 续传接 5 代后 ,其效价水平均差异不显著 ,说明菌株HW225 多代传接后发酵单位比较稳定。
872 核　农　学　报 22 卷
表 5 　HW225 传接 5 代发酵效价
Table 5 　Titers of the strain HW225 subcultured for five generations
传代数 generations F1 F2 F3 F4 F5
发酵效价 titers (μgΠml) 47180 ±0108a 46195 ±0119a 47109 ±0191a 46196 ±0110a 46196 ±0150a
注 :a 表示在 5 %水平差异不显著 (DMRT)
Note : a indicates that the difference is not statistically significant by DMRT at p = 0105.
3 　讨论
星形孢菌素作为一种活性化合物 ,具有抗肿瘤、抗
真菌和杀虫的作用[7 ,8 ] 。1977 年由 Omura 等从链霉菌
AM22282 中发现 ,1978 年 Furasaki 等通过 X 射线分析
确定了星形孢菌素的化学结构。星形孢菌素市场价格
昂贵 ,目前只用于医学领域进行理论研究 ,要想真正应
用于农业生产 ,必须进行选育来提高产生菌的发酵效
价 ,但关于星形孢菌素产生菌的诱变研究未见报道。
在诱变筛选试验中 ,诱变剂量对产量性状的诱变
作用 ,有如下特点 : 处理剂量大 ,杀菌率高 ( 90 %～
99 %) ,单位存活细胞中负变菌株多 ,正变菌株少 ,但在
不多的正变株中仍有可能筛选到产量大幅度提高的突
变株[9 ] ,所以选择孢子致死率在 90 %～99 %之间的诱
变剂量。利用抗性物质进行筛选不仅提高工作效率 ,
而且获得突变株的可能性大大提高。近年来利用链霉
菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系来
定向筛选正向突变株是目前农用抗生素科研领域的研
究热点[10 ] 。研究工作表明 ,抗生素生物合成有关的基
因与对抗生素的耐受性有关基因常常是连锁在一起
的 ,因此随着对自身产物耐受性的提高 ,很多产生菌合
成抗生素的能力同时得到提高 ,不仅如此 ,提高对来自
其他抗生素产生菌产物的抗性 ,也能使自身合成抗生
素的能力得到提高[11 ] 。本试验利用硫酸链霉素作为
抗性物质来筛选突变株 ,获得了优良菌株 HW225 ,比原
始菌株的效价提高了 284120 % ,但其发酵相对效价仍
然很低 ,有待进一步加强高产菌株的选育和发酵工艺
的研究。
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