全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 032237204
烟粉虱与温室白粉虱内共生菌的分子比较研究
谭周进1 ,2 　谢丙炎1 3 　肖启明2 　杨宇红1 　冯兰香1
(11 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ,北京　100081 ; 21 湖南农业大学植物保护学院 ,湖南 长沙　410128)
摘 　要 :利用 PCR 技术对烟粉虱与温室白粉虱内共生菌进行分子比较研究 ,筛选出 C、D、G和 H
等 4 对引物 ,分别能够扩增出烟粉虱内共生菌的 groEL 基因、初生内共生菌与次生内共生菌的
16SrDNA 基因 ,与 GenBank 中相应序列的同源性分别为 99 %、99158 %、98 %和 98 % ,而不能从
温室白粉虱内共生菌中扩增出该类基因 ,表明烟粉虱与温室白粉虱内共生菌存在分子差异。
关键词 :烟粉虱 ;温室白粉虱 ;内共生菌 ;分子分类
收稿日期 :2003211212
基金项目 :国家重点基础研究发展规划项目 (2002CB111401) , 农业部农作物病虫草害生物防治资源研究与利用重点开放实验室开放
基金 (LOBCR22003201)
作者简介 :谭周进 (1971～) ,男 ,湖南涟源人 ,博士 ,从事昆虫传毒分子生态学与应用微生物学研究。3 通讯作者
STUDY ON THE MOLECULAR DIFFERENCE OF ENDOSYMBIONTS FROM Bemisia
tabaci( GENNADIUS) AND Trialeurodes vaporariorum( WESTWOOD)
TAN Zhou2jin1 ,2 　XIE Bing2yan1 3 　XIAO Qi2ming2 　YANG Yu2hong1 　FENGLan2xiang1
(1. Institute of Vegetable and Flower , Chinese Academy of Agricultural Science , Beijing , 100081 ;
2. College of Plant Protection , Hunan Agricultural Universituy , Hunan Changsha , 410128)
Abstract :PCR technique was used to distinguish Bemisia tabaci from Trialeurodes vaporariorum . The results showed
that C , D , G and H special primers were acquired , C and D for groEL , G and H for 16Sr DNA of primary
endosymbiont and secondary endosymbiont from Bemisia tabaci were amplified respectively ,and similarity between
the sequences from the four primers and the sequences from GenBank is 99 % ,99158 % ,98 % and 98 %. But the
four primers were not suitable for amplifying from Trialeurodes vaporariorum ,indicating that the endosymbionts were
different between Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum .
Key words : Bemisia tabaci ; Trialeurodes vaporariorum ; endosymbionts ; molecular classification
昆虫内共生菌分为初生内共生菌 ( Primary endosymbiont) 与次生内共生菌 (Secondary endosymbiont) 。
初生内共生菌是垂直传递的 ,与宿主共同进化 ,产生的 GroEL 蛋白保护病毒在昆虫体内免遭降解。而次
生内共生菌发生比较近 ,在宿主中不稳定或者说是暂时的 ,有些次生内共生菌垂直传给子代 ,但在不同
种之间可以水平传递。初生内共生菌与宿主进化关系的一致性 ,次生内共生菌遗传多样性与可塑性及
与宿主之间系统发育的不一致性、对研究昆虫的系统进化及其生物多样性都是好的证据[1 ,2 ] 。内共生菌
在昆虫中以“瓶颈”方式进行传递 ,对不同宿主“瓶颈”效应的研究有可能帮助阐明不同内共生菌菌株核
苷酸替代的不同之处[3 ] 。这种“瓶颈”方式也影响遗传漂移、有益或有害突变的积累过程、种群结构、基
于内共生菌基因的生殖选择效力、内共生菌与宿主之间的互选效果等[4 ] 。对内共生菌功能基因的研究 ,
有助于解释内共生菌在宿主昆虫进化与传毒等方面的作用。
烟粉虱 ( Bemisia tabaci Gennadius)属同翅目 ,粉虱科 ,小粉虱属。也称棉粉虱 (cotton whitefly)或甘薯粉
732　核 农 学 报　2004 ,18 (3) :237～240Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
虱 (sweetpotato whitefly) 。已报道的生物型多达 27 种 ,并有继续发展的趋势 ,主要是生物型 A 和 B[5 ,6 ] 。
烟粉虱寄主范围广泛 ,温室白粉虱不嗜好的十字花科植物也是烟粉虱的寄主。烟粉虱能传播 WFT联体
病毒 (whitefly2transmitted geminiviruses)等多种植物病毒 ,除传播植物病毒病外 ,还传播植物细菌病和真菌
病[7 ] ,传播的病毒病害比直接取食造成的损失要大得多。温室白粉虱 ( Trialeurodes vaporariorum
Westwood)属于同翅目 ,粉虱科 ,蜡粉虱属 Trialeurodes ,不能传播联体病毒。烟粉虱与温室白粉虱二者虫
体微小 ,靠肉眼观察有一定难度。借助显微立体解剖镜观察 ,可以从成虫、蛹壳等进行区别 ,也可以从酶
系等方面进行区别 ,烟粉虱的羧酸酯酶活性与谷胱甘肽转移酶活性都显著高于温室白粉虱 ,烟粉虱的乙
酰胆碱酶活性低于温室白粉虱[8 ] 。温室白粉虱的酯酶酶谱可分为 2 组区带 ,过氧化物酶酶谱可分为 5
组区带 ,烟粉虱的酯酶酶谱可分为 5 组区带 ,过氧化物酶酶谱可分为 4 组区带[9 ] 。为了探索内共生菌与
昆虫进化、传毒及生活等方面的关系 ,我们开展了内共生菌功能基因的研究。本文报道利用现代分子生
物学技术对烟粉虱与温室白粉虱内共生菌进行的比较研究。
1 　材料与方法
111 　材料
B 型烟粉虱和温室白粉虱雌成虫分别采自连续 5 年饲养在中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所温
室中的黄瓜上 ,置于 25～30 ℃的防虫温室里 ,饲养于烟草上 ,光周期 16hΠ8h (DΠN) ,多代转接并将单头虫
克隆 4～5 代后 ,采集一定数量成虫置于 - 20 ℃冰箱中快速冻死备用。Taq 酶、DNA 回收试剂盒、p GM2T
Easy 载体、dNTPs 购自北京清华大学天为时代科技有限公司 ,蛋白酶 K、dNTPs 购自 Bebco 公司。其它试
剂的配制见参考文献[10 ] 。
112 　方法
11211 　模板 DNA 的提取 　将 100 头冰冻的烟粉虱或温室白粉虱用无菌双蒸水快速洗涤 2 次 ,于 200μl
STE缓冲液中匀浆 ,加入 4μl 20mgΠmL 的蛋白酶 K,20μl 50gΠL 的 SDS ,5000rΠmin 离心 30S 后 ,于 65 ℃水浴
中裂解 60min ,然后在 75 ℃水浴中处理 3min ,冰上放置 5min 后 ,5000rΠmin 短时离心 ,上清液分别用等体
积的酚∶氯仿 (1∶1)抽提 3 次、氯仿抽提 1 次 ,加 215 倍体积的冷无水乙醇置于 - 20 ℃30min 以上沉淀
DNA ,12000rΠmin 离心 10min ,DNA 沉淀用 75 %的酒精洗涤 2 次 ,最后用无水乙醇洗涤 1 次 ,晾干或风干
酒精 ,加 50μl 无菌双蒸水在 4 ℃溶解 DNA ,紫外法测定 DNA 的浓度与质量。
11212　引物设计与合成 　引物 C[11 ] : F286 : 5’2GACATT ( T , C) T (A , G) GCAAT TGTT23’, OUT: 5’2
ATGTGTGTGATGTTTT TGG23’用于扩增 1668bp 的 groEL 基因 ; 引物 D 参照 GenBank 发表的序列
(AF130421) , 采用 PRIMER2MASTER 引物设计软件 (版本 110 ) 自行设计引物 , 序列为 : fwd : 5’2
atggcagctaaagacttaaaatttgg23’,rev : 5’2ttacatcataccattcattccgccc23’用于扩增 1668bp 的 groEL 基因 ;引物 F[12 ] :
28F25’TGCAAGTCGAGCGGCATCAT3’, 1495R25’CTACGGCTACCTTGTTACGA 3’用于扩增 1500bp 的
16SrDNA 产物 ;引物 G[12 ] :28F25’TGCAAGTCGAGCGGCATCAT23’;1098R25’AAAGTTCCCGCCTTATGCGT23’
用于扩增主要内共生菌约 1000bp 的 16SrDNA 产物 ;引物 H[12 ] :92F25’TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG23’;
1343R25’CCCGGGAACGT ATTCACCGTAG23’用于扩增次要内共生菌 1250bp 的 16SrDNA 产物。引物委托
上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
11213 　PCR 扩增 　首先在 25μl 体系中对影响 PCR 特异性扩增的条件进行了筛选 ,扩增 groEL 退火温度
从 46 ℃～58 ℃,每 3 ℃1 个梯度 ,共设 5 个梯度 ;Mg2 + 浓度从 110～210molΠL ,每 015molΠL 1 个梯度。经优
化后 ,烟粉虱内共生菌 groEL PCR 在 25μl 体系中进行 ,含每种引物各 016μmolΠL、模板 200ng、dNTPs
215mmolΠL、10 ×PCR buffer 5μl、Mg2 + 215～310mmolΠL、Taq 酶 1U ,加消毒双蒸水至 25μl。
groEL 基因 PCR 反应 :94 ℃预变性 5min 后 ,进行 94 ℃1min ,50 ℃1min、72 ℃2min ,共 35 个循环 ,72 ℃
延伸 10min 后 ,保存于 4 ℃冰箱中。内共生菌 16SrDNA 的 3 对引物 PCR 扩增分别在 25μl 体系中进行 ,反
应体系为 :10mM Tris2HCL (pH 813) 、5μg 模板 DNA、含每种引物各 1μM、每种 dNTPs 011mM、MgCl2 215mM
～310mM、KCl 50mM 及 Taq 酶 215U。
832 核　农　学　报 18 卷
扩增条件参照文献[12 ]进行。F 引物与 G引物的 PCR 反应 :95 ℃变性 1min ,60 ℃退火 1min ,72 ℃延伸
1min ,5 个循环 ,接着 95 ℃1min , 58 ℃1min ,72 ℃1min ,25 个循环 ,72 ℃延伸 10min ,保存于 4 ℃冰箱中。H
引物 :95 ℃变性 1min ,58 ℃1min ,72 ℃1min ,30 个循环 ,72 ℃延伸 10min ,保存于 4 ℃冰箱中。本实验中每
对引物经过 5 次 PCR 反复验证。
11214 　序列测定与分析 　分别将 C、D、G、H引物在 50μl 体系中扩增后 ,用 DNA 试剂盒回收 ,然后分别
PCR 重扩增 100μl ,电泳回收检测纯度后 ,D 引物扩增产物克隆到 p GM2T Easy 载体 ,C、G、H 引物扩增产
物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司测序 (测序仪为 ABI PRISM 377296 ,测序试剂为 BigDye
terminator v210) ,C引物的扩增产物测一个正向反应 ,得到约 600bp 序列 ,D、G、H 引物的扩增产物测序从
正反两方向测通 ,测得的全序列直接送 GenBank 进行登记。序列同源性分析通过 http :ΠΠwww. ncbi . nlm.
nih. gov 中的 Blast 软件进行。
2 　结果与分析
211 　引物 C与引物 D 对烟粉虱与温室白粉虱内共生菌的扩增
C、D 两对引物对烟粉虱与温室白粉虱内共生菌 groEL 基因的扩增经 5 次重复后得到同样的结果 ,
见图 1。由图 1 可知 ,C引物与D 引物均能够扩增出烟粉虱内共生菌的 groEL 基因 ,长度在 1650bp 左右 ,
而不能扩增出温室白粉虱的 groEL 基因。可见烟粉虱与温室白粉虱的初生内共生菌是不同的 ,它们产
生的对病毒起保护作用的 groEL 蛋白也不同 ,这为烟粉虱传播的病毒种类多 ,双联体病毒只由烟粉虱传
播 ,而不由温室白粉虱传播提供了一定的实验证据。C 引物与引物 D 可以作为区分烟粉虱与温室白粉
虱的特异性引物。
图 1 　烟粉虱与温室白粉虱内共生菌 groEL 基因的 PCR 扩增
Fig. 1 　PCR for groEL gene from endosymbionts of
Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum
with C and D primers
M:DNA marker ;1 :烟粉虱 ;2 :温室白粉虱 ;3 :CK;c :C引物 ;d :D 引物
M:DNA molecular marker ; 1 : Bemisia tabaci ;
2 : Trialeurodes vaporariorum ; 3 :CK; c :C primer ; d :D primer 　
212 　烟粉虱与温室白粉虱内共生菌 16SrDNA的扩增
F、G、H 3 对引物对烟粉虱与温室白粉虱内共生菌 16SrDNA 的扩增经 5 次重复后得到同样的结果 ,
见图 2。由图 2 可知 ,F 引物能够分别对烟粉虱和温室白粉虱扩增出 1500bp 的产物 ,而 G引物和 H引物
则只能扩增出烟粉虱的内共生菌 16SrDNA ,长度分别约为 1000bp 和 1250bp ,而不能扩增出温室白粉虱的
内共生菌 16SrDNA。可见 ,烟粉虱与温室白粉虱的初生内共生菌具有一定的相似性 ,两者的 1500bp 的
16SrDNA可以被同一对 F 引物在相同条件下进行扩增。而 G、H 引物只能扩增烟粉虱内共生菌的
16SrDNA ,可以用于作为区分烟粉虱与温室白粉虱的特异引物。
图 2 　烟粉虱与温室白粉虱内共生菌 16SrDNA 的扩增
Fig. 2 　PCR for 16SrDNA gene from endosymbionts of
Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum
with f ,g and h primers
M:DNA marker ;1 :烟粉虱 ;2 :温室白粉虱 ;CK:空白对照 ;
f :F 引物 ;g : G引物 ;h :H引物
M:DNA molecular marker ; 1 : Bemisia tabaci ; 2 : Trialeurodes
vaporariorum ; 3 :CK; f :F primer ,amplifying 1500bp 16SrDNA from
primary endosymbionts ; g : G primer ,amplifying about 1000bp
16SrDNA from primary endosymbionts ; h :H primer ,amplifying
1250bp or so 16SrDNA from secondary endosymbionts　
932　3 期 烟粉虱与温室白粉虱内共生菌的分子比较研究
213 　序列及其分析
C引物的正向序列位于目的片段的 - 86 至 - 69 位处 ,反向序列位于目的片段的 + 21 至 + 3 处 ,扩
增产物经正向引物 F86 测得的约 600bp 序列长度与 GenBank 下载的烟粉虱内共生菌 groEL 基因
(AF130421)序列同源性为 99 %。D 引物扩增的序列已被 GenBank 接收 , 登录号为 AY445872 , 与
AF130421 序列同源性为 99158 %。说明其属于烟粉虱的 groEL 基因。
G引物扩增的序列已被 GenBank 接收 ,登录号为 AY429619 ,与 GenBank 中已知序列 Blast ,所得序列
与烟粉虱初生内共生菌 16SrDNA 的同源性为 98 % (现只报道有温室白粉虱初生内共生菌 1500bp 的
16SrDNA) 。H引物扩增的序列已被 GenBank 接收 ,登录号为 AY371187 ,与 GenBank 中已知序列 Blast ,所
得序列与烟粉虱次生内共生菌 16SrDNA 的同源性为 98 %(未见温室白粉虱次生内共生菌 16SrDNA 的报
道) 。
3 　结论与讨论
烟粉虱与温室白粉虱的区分可以借助内共生菌的特性进行 ,本研究已得到 4 对可以用于区分烟粉
虱与温室白粉虱的特异性引物 ,分别用于扩增烟粉虱内共生菌的 groEL、初生内共生菌的 16SrDNA 以及
次生内共生菌的 16SrDNA。内共生菌的特性可以反应宿主的某些特性 ,烟粉虱与温室白粉虱内共生菌
的具体差异还有待于进一步研究。
groEL 蛋白在病毒经虫传播中起着非常重要的作用[11 ] ,由烟粉虱传播的病毒病害所引起的危害要
远远超过其自身的取食危害 ,双联体病毒只能够由烟粉虱传播 ,而不能由温室白粉虱传播。本研究用于
扩增烟粉虱内共生菌 groEL 基因的 2 对引物不能扩增出温室白粉虱内共生菌的 groEL 基因 ,说明二者的
groEL 基因有差别 ,这为 2 种昆虫寄主植物与传播病害的差异提供了实验证据 ,其间的具体原因还有待
于进一步研究。烟粉虱与温室白粉虱内共生菌的 groEL (温室白粉虱内共生菌的 groEL 还未见报道) 及
其编码的蛋白差异还不清楚 ,有关烟粉虱传毒机理及 GroEL 蛋白在烟粉虱传病毒中的作用研究正在进
行之中。
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