全 文 ：ll8
文章编号：1000—8551(2004)02—1l8．03
核 农 学 报 2004，18(2)：118—120
Acta AgriculturaeNttdeatae S／n／ca
苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎
发生的形态学研究
达克东 张 松 臧运祥。 吴禄平 束怀瑞
(1．山东农业大学园艺学院，山东 泰安 271018；2．沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳 110161)
摘 要：研 究了苹果离体叶片直接体细胞胚胎发生体 系和外植体直接体细胞胚胎发生过程中的
形态学特征。结果显示，苹果直接体细胞胚胎发生过程经历原胚、球形胚 、心形胚、子叶形胚、
成熟胚等阶段 ；子叶形胚以前的阶段没有观察到形态学多样性 ，发育至子叶形胚期的直接体细
胞胚胎表现 出形态学多样性 ，分别观察到一子叶胚、两子叶胚、三子叶胚、杯状胚、多子叶胚、畸
形胚等 ，这些类型的胚最终都 能发育成正常的成熟胚进而发育成小植株 。
关键词：苹果 ；离体叶片；直接体细胞胚胎；形态学
M oRPHoLoGICAL STUDY oF DIRECT SoM_ATIC EM_BRYo．GENESES
FRoM IN WZRD LEAVES oF APPLE(Malus domestica Borkh．)
DA Ke-dong ZHANG Song ZANG Yun．xiang SHU Huai—rui
(1．Colege ofHorticulture，Shanclong Agricultural Uniz ersit)，Taian，Shandong， 271018；
2．Colege ofHorticulture，Shenyang Agricultural[niz ersit Shenyang，Liaoning， 110161)
Abstract：Direct somatic embryogenesis from in vitro leaves of apple cultivar Gala(Malus domestica Borkh．)was
established．Morphological characters of the developing direct somatic embryo on the explant were studied．The
results showed that apple direct somatic emb ryo undergo pre—embryo，ball—emb ryo，heart-emb ryo，cotyledon-emb ryo
and mature-emb ryo to become plantlet．No polymorphism was observed in the developing stage before cotyledon—
emb ryo，but emb ryos in cotyledon—emb ryo stage showed polymorphic characters，monocotyledon-emb ryo，dicotyledon—
emb ryo，tricot-emb ryo，muhicotyledon—emb ryo，cup-emb ryo，clavated-emb ryo，radial—emb ryo and ealabashy-emb ryo
were observed．Al these kinds of emb ryos could develop into normal mature—emb ryo and become plandet．
Key words：apple；leaf in vitro；direct somatic emb ryo；morphology
体细胞胚胎发生在高等植物上是一个普遍现象。但不同作物又有其特殊性，在体细胞胚胎发生的
形态学上表现为形态学多样性：板栗杂种胚的体细胞胚胎是多子叶类型为主 ；胡萝 卜的体细胞胚胎是
多种类型子叶的⋯；棉花的体细胞胚胎是多种类型子叶的 。形态学上的多样性是物种特性还是环境
条件造成尚没有详细研究。本文报导苹果叶片直接体细胞胚胎发生过程的形态学特征观察。
1 材料与方法
试验材料是苹果栽培品种嘎拉(Malus domestica Borkh．)试管苗。胚性细胞诱导培养基为 MS加 BA
1．0mCL、NAA 5n~dL和 2．4一D 0．5mg／L；胚胎发生诱导培养基为 Ms+BA 1mg／L。具体方法见参考文
，
收稿 日期 ：2003—01-01
基金项目：山东省“三零”工程资助项目
作者简介：达克东(1967 )，男，甘肃兰州人，博士，副教授，主要从事园艺植物生物技术及其产业化研究。
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2期 苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生的形态学研究 l l9
献⋯。体细胞胚胎发生诱导培养 7～35d，每隔 3d取材一次 ，在奥林 巴斯体视显微镜下观察形态。
2 结果与分析
2．1 苹果叶片直接体细胞胚胎发生过程
创伤叶片经过 7d胚性细胞诱导后大部分叶片基本形态无明显变化 ，个别叶片形态发生扭曲 ，但伤
口处无愈伤组织发生 ，伤口细胞呈淡褐色 ，伤口附近细胞呈淡黄色 ，整个 叶片形态显示为一种活力旺盛
的状态。转接到体细胞胚胎发生培养基后刺伤后的伤口部位微微隆起 ，至第 7d个别叶片上面发生发育
阶段为原胚期的直接类型体细胞胚胎 ，至第 15d达到体细胞胚胎发生高峰。直接类 型体细胞胚胎发生
依次经过原胚 、球形胚 、心形胚和子叶形胚诸阶段而形成一个新个体(图 l一4、8)。苹果叶片直接体细胞
胚胎发生发育是不同步的 ，在体细胞胚胎发生高峰期 ，同一块外植体上可观察到不同发育阶段 的体细胞
胚胎 (图 1．8)。
2．2 苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生模式
在苹果离体叶片直接体细胞胚胎发生过程中，外植体在发生正常体细胞胚胎的同时 ，还发生一些不
同于正常类型的体细胞胚胎 ，依据其子叶的形态特征可分为 5类 ：(1)单子叶胚 (图 1．10)，这类胚发育至
心形胚后只有 1个子叶生长迅速 ，另外的子叶基本不长，至速生子 叶发育至一定大小时，在速生子叶基
部发生另外的子叶，继而胚萌发成熟 ；(2)三子叶胚 (图 l—l1)，此种类型胚发育至心形胚 以后 ，进入子叶
发生期时有 3个子叶同时发育 ，当这 3个子叶发育至一定阶段 ，在胚的中心部位发生一生长点 ，胚萌发
成熟 ；(3)杯状胚(图 1．13)，杯状胚是一类当胚发育至心形胚以后 ，在子叶发生期 ，子叶不是单独发生而
是蹼状连接在一起成杯状，发育至一定阶段在连体子叶的基础上沿杯的边沿不同部位发生单生子叶，子
叶发生至一定时期 ，在杯底中心部位发生一生长点，胚萌发成熟 ；(4)多子叶胚(图 l—l2)，该类胚在发育
至心形胚以后，发生 3个以上呈莲座状的子叶，是可萌发胚；(5)畸形胚，包括棒槌状胚、放射状子叶胚
(畸形胚)和葫芦状胚等(图 l—l4、l5、l6)。无论子叶期形态差别如何 ，各种类型的体细胞胚胎最终都能
经过成熟胚阶段发育为小植株。
图 l Fig．1
1～4：直接体细胞胚胎 发生的一般过程 (1．原胚 ；2．球形胚 ；3．心形胚 ；4．
子叶形胚 ；)×40；5～7：直接根 发生的形态学特 征(5．无 毛根 ；6．绒 状根
毛根 ；7 絮状根 毛根 ：)×40：8：同一外植 体上 的心形胚 和成熟 胚 ；9～
16：直接体细胞胚胎发 生的形 态学 多样性 (9．双子 叶胚；10．单子 叶胚 ；
11三子 叶胚；12 多子 叶胚 ；13．杯 状 胚；14．棒 状胚 ；15．放射状 胚 畸形
胚 ：16．葫芦状胚)×40
1～4：normal stage of direct somatic embryogenesis(1．pre—embryo；2．bal—
embr3 0： 3 heart—embryo；4．cotyledon—embryo)× 40： 5 ～ 7：morpholgieal
characlers of direct root fomlation(5．rot with no hair：6．root with velvet hair；
7．rot with flufly hair)×40：8：heart—embryo and mature—embryo in one explant
×40；9～ 16：polymorphism of direct somatic embryogenesis(9．dicot—embryo；
10．fllOtlOCOl—embryo； 11．tricot—embryo； 12．multicot—embryo； 13．cup-embryo；
14．claxaled—embryo；15．radial—embryo；16．ealbashy．embryo)×40
2．3 苹果离体叶片培养中的直接根发生
苹果离体叶片直接体细胞胚胎发生过程 中，除了发生不同类型直接体细胞胚胎 ，还有直接根发生现
象 ，发生部位是主脉、侧脉和分支脉。这些再生根依据其有无根毛及其根毛的形态特征可分为有毛根和
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无毛根。无毛根表面无根毛，根尖为一角质化组织(图 l一5)；有毛根表面被有绒毛，根尖端为一段类似无
根毛区的区段 ，有毛根依据其根毛形态可分为绒状根毛根(图 l一6)和絮状根毛根(图 1—7)。各种类型再
生根在无菌空气中只有有限生长 ，当接触到培养基时有一定的加长生长 。
3 讨论
3．1 体细胞胚胎发生与物种抗逆性的获得
植物组织培养植株再生有两条途径 ，另一条是不定芽发生途径 ，一条是胚状体发生途径。不定芽发
生在植物界是一个普遍现象 ，因为大部分植物可以通过不定芽途径再生植株。随着研究 的深入胚状体
发生也在大部分植物上获得成功。研究显示 ，植物组织培养胚状体发生，在再生上更具基本性和普遍
性，由于培养环境对于细胞是一种逆境，按照进化伦的观点，适者生存，胚状体发生是对逆境的最高级适
应，首先，单细胞起源使适应性细胞表达胚性而再生植株，其次，发育良好的根端和芽端使胚状体存活的
机会大于不定芽，因为不定芽总是成簇发生，不具根端，在逆境中处于不利地位。
3．2 形态学多样性与体细胞无性系变异
苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生过程在子叶形态上表现出多种形态 ，但不论何种形态 ，最终
都能发育为正常植株 ，DNA多态性分析显示个体间没有遗传性差异 ，说明体细胞胚胎子叶形态的多
形性不能作为衡量体细胞无性系变异的指标，这是因为离体培养的植物组织和细胞所面临的是一个与
整体植株明显不同的生长环境和条件，尽管实验尽可能地为离体植物细胞创造 了一个接近于活体状况
下的营养、激素、大气和各种物理因素的生长条件，但对这些细胞来说，培养容器依然是一个相当异端的
生活环境 ，起源于表皮的胚性细胞和周围细胞之间在空间上和几何学上的关系 ，同在完整植物中的也截
然不同，这些都能极大的影响胚性细胞的生长 、发育和分化 ，所以培养细胞发育形态的异常性 ，反应了它
们对特定的生长环境和外界因素的反应。培养细胞的这种生理性变异的特征和它们的出现是暂时的、
可逆的，一旦恢复到正常的条件下，这些异常性即会消失。 。已发现胡萝 卜体细胞胚子叶数目的变化受
所用品种的基 因型影响，而与染色体数 目变异不相关 。
参考文献：
[1] 达克东，张松，李雅志，亓增军．苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生研究．园艺学报，1996，23(3)：241～245
[2] 达克东，张松，金德敏，米瑞芙，王斌，束怀瑞．苹果体细胞无性系变异的RAPD评估．核农学报，2000，14(4)：26～30
[3] 张宝红，王清连，丰蝾，李付广，李风莲，李秀兰．棉花体细胞胚胎发生模式和植株再生．农业生物技术学报，1996，4(1)：44～49
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[5] Vieitez F J，San-Jose M c，Balester A，Vieitez A M．Somatic embryogenesis in cultured immature zygotic embryos in ehesmut．J．Plant Physio1．
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