全 文 ： 核 农 学 报 2004，18(2)：113—117
Acta agrlcalturaeNucleatae Sinica
文章编号 ：1000-8551(2004)02—113．05
抗生素对高粱离体培养反应的影响
张明洲 崔海瑞 舒庆尧 夏英武
(浙江大学原子核农业科学研究 所，浙江 杭州 310029)
摘 要：探讨了5种抗生素对高粱离体培养反应的影响。在 3种抑菌抗生素中，羧苄青霉素和
头孢霉素的抑菌效果较好。头孢霉素对高梁外植体离体培养的毒性比羧苄青霉素大，羧苄青
霉素对愈伤组织的生长起促进作用 ，且只在高浓度 才对分化有抑制作用。在农杆菌介 导高梁
遗传转化 时，选用 250～500mg／L的羧苄青霉素来抑 茵是合适的。高梁不同基 因型和外植体对
潮霉素和卡那霉素的反应表现不同，但对潮霉素的反应比卡那霉素敏感。在 筛选转化体时，以
潮霉素较好 ，使 用浓度对茎尖和幼胚以 25～50mg／L为宜，对愈伤组织则以 50—75rng／L为宜。
关键词：高梁；离体培养；抗生素
EFFECTS OF ANTIBIOTICS ON THE RESPoNSE OF
SoRGHUM JⅣ W 豫 D CULTURE
ZHANG Ming—zhou CUI Hat—rut SHU Qing—yao XIA Ying一、Vu
(Institute ofNnclear Agricultural Sciences， atlg {ersity，Hangzhou，Zhejang 310029)
Abstract：Effects of five kinds of antibiotics on the response of sorghum in vitro culture were studied．Among three
kinds of antibiotics，carbenicilin and cefotaxime showed beter results than ampicilin for the removal of
Agrobacterium cells maintained in explants after CO—culture Higher toxicity of cefotaxime to sorghum explan ts was
observed than that of carbenicillin，which could promote callus growth and only showed inhibition to plantlet
regeneration under higher concentration．Thus，250～500mg／L of carbenicillin is optional for the removal of bacterial
cels in sorghum transformation mediated by Agrobacterium．Sensitivity to kanamycin and hygromycin varied with the
sorghum varieties and explants，but they are all more sensitive to hygromycin than to kanamycin．For screening
transform ast，hygromycin is preferable with the concentration of 25～50mg／L to shoot apex and immature embryo and
50～75rng／L to callus．
Key words：sorghum；in vitro culture；antibiotics
利用转基因技术进行植物品种改良已引起了广泛关注。高梁是全球仅次于小麦、水稻、玉米、大豆
和马铃薯等的重要作物之一⋯，与同为禾谷类作物的玉 米、水稻等相 比，其转基因研究进展相对 比较缓
慢。到 目前为止，用于高梁转基因技术的方法主要有基因枪法 ～ 、农杆菌介导法⋯、电激法 和花粉
管通道法 。¨ 等。其中，农杆菌介导转化由于方法简单、效率高和拷贝数少等优点倍受人们关注。在农
杆菌介导转化中，筛选培养基中需要添加不同的抗生素来杀灭农杆菌或筛选转化体。不同种类的抗生
素对农杆菌菌株的抑制效果不同，不同植物离体培养时对抗生素的反应也存在差异，且某些抗生素在使
收稿 日期 ：2o03—03—25
基金项目：安徽省合肥市政府科研专项
作者简介：张明洲(1970～)，男，浙江泰顺人，博士生，主要从事植物生物技术研究。
*通讯作者
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用中表现出植物激素类似物的效应。 ” 因此，在进行农杆菌介导的遗传转化时，确定适宜的抗生素及
其使用浓度是非常重要 的。对高粱在这方面的研究尚未见详细报道。本研究探讨了离体培养过程中高
梁不同外植体对几种抗生素的反应，为进一步建立农杆菌介导高梁遗传转化的体系奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材 料
所用的高粱试材有 KS034、抗四、622B、21B、115、0-30、ICS21和5—27。除抗四是杂种外，其余均为纯
系品种。试验用 5种抗生素为氨苄青霉素 、羧苄青霉素 、头孢霉素 、卡那霉素和潮霉素，除氨苄青霉素为
国产外 ，其它均为进 口产品。各抗生素的浓度设置见“结果与分析”部分。所用农杆菌菌株为 EHA105，
内含 pKUB质粒 ，其 T—DNA区携带 CaMV35S引导的 n 1I、hph、gus及 Ubquitin引导的杀虫结 晶体蛋白
基 因 crylAb基 因 。
1．2 方法
取健康种子用0．1％ HGC1，进行表面消毒 10～15rain，无菌水冲洗多次，萌发培养 3d。然后在解剖
镜下把大小约 1．0mm的茎尖分离出来 ，接种于添加不 同抗生素的培养基上进行培养。2周后调查茎尖
的再生率和褐化(死亡)率。取套袋授粉后 9～12d种子．用 l0％NaOC1进行表面消毒20min，无菌水冲洗
多次 ；将大小约 2．0mm的幼胚从消毒种子中剥离 ，接种于添加不同抗生素的培养基上进行培养。2周后
调查幼胚的出愈率及褐化(死亡 )率。取长约 2～5cm的幼穗 ，用 70％酒精进行表面消毒 3min，无菌水冲
洗多次；切成薄片接种于添加不同抗生素的培养基上进行培养。2周后调查幼穗的出愈率及褐化(死
亡)率 ，5周时调查愈伤组织的生长情况 ，7周时调查愈伤组织的分化情况。
所用培养基参照 Zhao等的方法⋯。将单菌落的农杆菌振荡培养液，转移到50ml YEP液体培养基中
振荡培养 (28℃，150r／min)过夜 ，然后离心收集菌体并稀释到 0D 值为 0．5～0．7的悬浮液。将预培养
3d的外植体在此菌液 中放置 10min，弃去菌液并用无菌滤纸去除残液 ，共培养 3d后转移到含抑菌抗生
素的培养基上 ，培养 5d后 ，以农杆菌复发率(Frequent)r of Agrobactorium Re．growth，FAR)为指标考察抗生
素对农杆菌的抑制作用，复发率以有农杆菌生长的外植体数占总外植体数的百分率来表示。
2 结果与分析
2．1 抗生素对农杆菌的抑制作用
将共培养过的高梁不同外植体转移 到含有氨苄青霉素 、羧苄青霉素 、头孢霉素 的培养基上，培养 5d
后的农杆菌复发率见表 1。由表 1看出，随着使用浓度的提高，农杆菌复发率明显降低，说明此3种抗生
素都可以抑制农杆菌繁殖 ，但抑制效果不同。以头孢霉素的抑菌效果最好 ，100rag／L就可完全抑制农杆
菌繁殖；羧苄青霉 素次之，要用 250mg／L才可完全 杀灭农杆菌；氨 苄青霉素抑 菌效果较 差，浓度达 到
表 1 共培养后外植体在含不 同抗生素培养基上的农杆菌复发率
Table 1 FAR of CO．cultivated explants subsequently cultured on the medium
containing different antibiotics (％ )
Note：SA：shoot apex；lE：immature embryo
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2期 抗生素对高梁离体培养反应的影响
500mg／L尚不能阻止幼胚和愈伤组织 中农杆菌 的复发。
2．2 抗生素对高梁茎尖再生和幼胚及幼穗愈伤组织诱导的影响
由于羧苄青霉素和头孢霉素抑菌效果较好，进一步考察了它们对高梁茎尖再生和幼胚及幼穗 愈伤
组织诱导的影响，结果见表2。试验结果表明，头孢霉素对茎尖再生和幼胚及幼穗愈伤组织诱导的影响
比羧苄青霉素大，随着头孢霉素浓度的增高茎尖再生率、幼胚及幼穗愈伤组织诱导率迅速下降，而褐化
(死亡)率迅速上升。不同外植体对头孢霉素的反应也不同，茎尖较幼胚和幼穗敏感。浓度低于500mg／L
的羧苄青霉素对高梁外植体的影响不明显。综合考虑抑菌效果和此结果，在农杆菌介导的高梁遗传转
化中，选用羧苄青霉素是合适的，浓度以250～500mg／L为宜。
表 2 抗 生素对 高梁茎尖再生和幼胚、幼穗愈伤组织诱导 的影 响
Table 2 Effects of antibiotics on regeneration of shoot apex，calus induction of
immature embryo and immature inflorescence in sorghum
Note：POB：percent of browned；POR：pe rcent of regeneration；POC：pe rcent of calus induction
2．3 抗生素对高梁愈伤组织生长和分化的影响
浓度低于 500mg／L的羧苄青霉素对高梁愈伤组织的生长具有促进作用，高梁愈伤组织 日增鲜重随
着羧苄青霉素浓度的增高而逐渐提高(表3)。当羧苄青霉素浓度为250mg／L时，高梁愈伤组织 日增鲜重
提高了近 1倍。而在分化培养基中添加羧苄青霉素，对高梁愈伤组织的分化表现出明显的抑制作用(表
4)。随着羧苄青霉素浓度的增高，高梁愈伤组织的分化率迅速下降，而只长根的愈伤数迅速增加。可
见 ，虽然羧苄青霉素对高梁外植体的毒性较小 ，但对 高梁外植体的生长表现 出植物生 长激素类似效应 ，
尤其是在高梁愈伤组织生长和分化中表现明显。因此，在农杆菌介导的高梁遗传转化中，选用羧苄青霉
素等抗生素作为抑菌剂添加到培养基中时，对培养基中原有的植物激素作适当的调整是必要的。
表 3 羧苄青 霉素对高 粱愈伤 组织生长的影响
Table 3 Effects of carbenicilin on growth of callus induced from sorghum
Note：20DW ：increased weisat after 20 days：W／D：fresh weislit increased pe r day
2．4 高梁外植体对卡那霉素、潮霉素的不同反应
图1和图2显示了卡那霉素和潮霉素对高梁茎尖、幼胚和愈伤组织褐化(死亡)率影响的结果。高
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梁茎尖、幼胚与愈伤组织对卡那霉素的敏感性不同，以茎尖反应最敏感，幼胚、愈伤组织次之；不同基因
型对卡那霉素的反应也有差异 ，以0—30最不敏感。潮霉素对高梁外植体生长的影响 比卡那霉素更加明
显。3种外植体中以茎尖褐化速度最快，潮霉素浓度为 25mg／L时，高梁茎尖的褐化(死亡)率均达到或
接近 90％。在不同基因型中，以0—30褐化较轻，当潮霉素50mg／L时，0—30愈伤组织的褐化率为66．7％，
而其余基因型褐化率均已达到 100％，外植体生长完全被抑制。
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图 l 卡那霉素、潮霉素对高粱茎尖、幼胚褐化(死亡)率的影响
Fig．1 Efects of kanamycin and hygromycin on brown percentage of shoot apex and
immature embryo in sorghum
0 25 50 75 100
卡那●素浓度 concenll-ation of
kttnamyein(Bs／L)
0 25 50 75 100
潮霉素浓度 ~otlcclitratiol ofhygromycil(ms／L)
图2 卡那霉素、潮霉素对高梁愈伤组织褐化(死亡)率的影响
Fig．2 Efects of kanamycin and hygromycin on brown percentage of callus induced from sorghum
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3 讨论
在农杆菌介导遗传转化中，外植体与农杆菌共培养后，尽管经过清洗，但外植体表面及组织浅层仍
附着或共生一些农杆菌。为杀死和抑制农杆菌的继续生长，以便使受体细胞正常生长发育，有必要进行
抑菌培养 。抗生素对农杆菌生长起抑制作用的同时 ，对植物组织也有一定 的毒害作用 。为减轻或消除
这种毒副作用 ，进行抗生素种类和浓度的筛选是必要的。本试验结果表明 ，头孢霉素和羧苄青霉素均表
现出较好的抑菌效果。但头孢霉素对高梁外植体生长和分化的不利影响比羧苄青霉素大，易造成外植
体的褐化、死亡。而羧苄青霉素在有效抑菌浓度范围内，对高梁外植体的影响不明显。综合考虑，在农
杆菌介导高梁遗传转化中，选用羧苄青霉素作为抑菌剂是合适的，浓度以250～500mg／L，为宜。
植物离体培养中，愈伤组织 的形成和分化出苗主要取决于培养基中植物生长激素与激动素的比例。
本研究的结果表明，浓度低于500mg／L的羧苄青霉素对高梁愈伤组织的生长具有促进作用，而在分化出
苗时，羧苄青霉素却表现出明显的抑制作用，表现出植物生长激素类似效应。这与 un等的报道n 相
似。可见，在农杆菌介导的遗传转化中，使用抑菌的抗生素后，应对培养基中的激素配比做适当的调整，
以利于转化细胞的再生。
用于筛选转化体的抗生素种类与所用转化质粒中携带的标记基因有关，卡那霉素和潮霉素是其中
常用的两种抗性筛选标记。本研究的结果表明，高梁不同基因型对卡那霉素和潮霉素的反应不同，即使
是同一基因型其不同类型的外植体对这两种抗生素的敏感性也存在较大差异，如茎尖的反应最敏感，幼
胚、愈伤组织则次之。因此，在进行不同高梁基因型和不同外植体的转化时，要合理地筛选转化体，应对
所用材料对抗生素的敏感性进行测定和确定适宜的浓度。在农杆菌介导高梁遗传转化中，建议选用潮
霉素作为抗性选择标记，选择压对茎尖和幼胚为 25～50mg／L，对愈伤组织以 50～75mg／L为宜。
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