全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 062898206
收稿日期 :2008204223 　接受日期 :2008207224
基金项目 :国家科技支撑计划 ,畜禽及其制品安全生产的质量控制技术研究 (编号 2006BAK02A21)
作者简介 :赵银丽 (19732) ,女 ,山东莘县人 ,博士研究生 ,讲师 ,主要从事兽药残留免疫学检测方法研究。E2mail :zhaoyinli73 @yahoo. com. cn
通讯作者 :张改平 (19602) ,男 ,河南内黄人 ,博士生导师 ,研究员 ,主要从事动物免疫学与生物技术研究。E2mail :zhanggaiping2003 @yahoo. com. cn ;
王建华 (19482) ,男 ,教授 ,河南南阳人 ,博士生导师 ,从事动物中毒性与营养代谢性疾病研究。E2mail :jhwang1948 @sina. com
抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及
竞争 ELISA 试剂盒的研制
赵银丽1 ,2 　王建华1 　王自良4 　滕　蔓3 　刘庆堂3 　邓瑞广3 　范国英4 　张改平3
(11 西北农林科技大学 动物医学院 ,陕西 杨凌　712100 ;21 河南工业大学 生物工程学院 ,河南 郑州　450001 ;
31 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室 ,河南 郑州　450002 ;41 河南科技学院 ,河南 新乡　453003)
摘 　要 :利用合成的完全抗原 (BSA2ENR) 免疫小鼠 ,通过细胞融合技术和间接竞争 ELISA 筛选出了能分
泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,以此为基础研制恩诺沙星残留检测的竞争 ELISA 试剂盒
(competitive ELISA ENR2Kit) ,并测定其性能。结果表明 :筛选出的 2 株杂交瘤细胞 ,单抗亚类均为 IgG1
型 ,其中 4G12B3 株的 ENR mAb 间接 ELISA 效价为 1 :11024 ×106 ,亲和常数 ( Ka) 为 9 ×1010LΠmol ;竞争
ELISA 试剂盒的线性检测范围为 0105～10116μgΠL、灵敏度 0105μgΠL、半数抑制浓度 ( IC50 ) 111μgΠL ,与其他
化合物的交叉反应率 (CR %)均小于 0101 % ,鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别
为 8115 % 、8716 %、8413 %和 95 % ,不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争 ELISA 对 ENR2Kit 检测结果影
响小 ,试剂盒保存期 6 个月以上。结果说明该竞争 ELISA 试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点 ,适
用于 ENR 残留的快速检测。
关键词 :恩诺沙星 ;杂交瘤细胞 ;竞争 ELISA 试剂盒
SCREENING OF HYBRIDOMA SECRETING MCAB TO ENROFLOXACIN AND
DEVELOPMENT OF COMPETITIVE ELISA ENR2KIT
ZHAO Yin2li1 ,2 　WANGJian2hua1 　WANG Zi2liang4 　TENG Man3
LIU Qing2tang3 　DENG Rui2guang3 　FAN Guo2ying4 　ZHANG Gai2ping3
(11 College of Veterinary Medicine , Northwest A &F University , Yangling , Shaanxi 　712100 ;
21 College of Bioengineering , Henan University of Technology , Zhengzhou 　450001 ;
31 The Provincial Key Laboratory of Animal Immunology , Henan Academy of Agricultural Sciences , Zhengzhou , Henan 　450002 ;
41 College of Animal Sciences , Henan Institute of Science and Technology , Xinxiang , Henan 　453003)
Abstract :Immunogen antigen was prepared by active ester method coupling enrofloxacin to BSA. BalbΠc mice were immunized
with BSA2ENR. Hybridoma lines that secreted antibody against ENR were generated with cell fusion and Screened of
hybridoma was screened by indirect competitive ELISA. ENR mAb was generated by inducing ascites in mice. A competitive
ELISA kit for detect ENR was developed with ENR mAb and its traits were tested. Two hybridoma lines were filtered and the
best one was 4G1 - B3 , which secreted ENR mAb with indirect ELISA titers of 1∶11024 ×106 in ascites. Isotype of the two
mAb was IgG1 . ENR mAb had a high affinity constant ( Ka) with 9 ×1010LΠmol. The ENR2Kit had the linear detection range of
0105～10116μgΠL , the sensitivity of 0105μgΠL and a good sensitivity with an IC50 of 111μgΠL to ENR , cross2reactivity to
other compounds less than 0101 %. The average recoveres of ENR spiked in chicken , liver , fish and milk were 8115 % ,
8716 % ,8413 % and 95 % respectively.
898　 核 农 学 报　2008 ,22 (6) :898～903Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
The coefficient variation was below 10 %. The competitive ELISA ENR2Kit possesses characters of rapidity , sensitivity ,
specificity and briefness , which is to be used for the rapid detection of ENR residues in animal food.
Key words :enrofloxacin ; hybridoma ; competitive ELISA ENR2Kit
　　恩诺沙星 ( ENR) 是人工合成的氟喹诺酮类抗菌
药 ,在畜禽疾病的治疗中发挥了重要的作用 ,比如家禽
细菌和支原体病的治疗 ,奶牛乳腺炎等疾病的治疗 ,近
年来在水产养殖中的应用也非常广泛。由于恩诺沙星
在动物组织中的半衰期长 ,易于在组织中形成残留 ,越
来越多的研究报道表明氟喹诺酮类药物的广泛应用与
人类食源性疾病的流行有很大关系[1 ,2 ] ,所以世界各国
对恩诺沙星在动物性食品中的最高残留限量都做了规
定 ,比如欧盟规定组织中恩诺沙星最大残留不得超过
30μgΠkg ,日本为 10μgΠkg。目前残留检测主要是高效液
相色谱 ( HPLC) 和液质 ( HPLC2MS) 联用等理化方
法[3 ,4 ] ,但色谱检测方法需要昂贵的仪器和专门的工作
人员 ,且样品处理较烦琐 ,所以其应用受到一定的局
限 ,尤其在基层大规模筛选和现场检测中更加突出 ,常
常用来做残留确证。酶联免疫分析 ( ELISA)方法快速、
简便、敏感、特异 ,克服了以上的不足 ,适合大规模筛
选 ,在残留检测的筛选和大量样品的检测中得到广泛
应用。本研究目的是利用免疫学原理合成恩诺沙星的
完全抗原免疫小鼠 ,然后应用细胞融合技术将小鼠的
脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤 ,通过酶联免疫试
验筛选分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并
以抗恩诺沙星的单克隆抗体 ( ENR mAb)为基础研制检
测恩诺沙星残留的竞争 ELISA 试剂盒 ( competitive
ELISA ENR2Kit) 。
1 　材料与方法
111 　材料与仪器
11111 　材料与试剂 　BalbΠc 小鼠 (SPF 级) ,购自郑州
大学医学院实验动物中心 ,在本研究室动物房饲喂 ;小
鼠骨髓瘤细胞株 NS0 细胞由英国国家动物健康研究
院惠赠。牛血清白蛋白 (BSA) 、卵清白蛋白 (OVA) 、辣
根过氧化物酶 (HRP) 、12乙基232(32二甲基氨基丙基)碳
化二亚胺盐酸盐 ( EDC) 、N2羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 、三
丁胺、氯甲酸异丁酯、弗氏完全佐剂 ( FCA) 、弗氏不完
全佐剂 (FIA) 、RPMI1640 细胞培养基、HAT、HT培养基、
PEG1500、鼠单克隆抗体分类试剂盒等均为 Sigma 产
品 ;羊抗鼠酶标二抗 ( GaMIgG2HRP) ,华美产品 ;恩诺沙
星、环丙沙星、诺氟沙星、二氟沙星、达氟沙星、磺胺嘧
啶、氯霉素、链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素 ,中国兽医
药品监察所产品 ,纯度 ≥99 % ;3 ,3′,5 ,5′2四甲基联苯
胺 (TMB) 购自上海华美 ;其他试剂市售所得 ,均为 AR
级 ;试验用水为超纯水。
0101molΠL PBS (NaCl 8g、KH2 PO4 012g、Na2 HPO4·12
H2O 219g、KCl 012g、dd H2O 1000ml) ;洗液 ( PBST) 为含
体积比 0105 % Tween20 的 PBS 液 ; 包被液 (CBS) 为
011molΠL pH916 的碳酸盐缓冲液 ( Na2 CO3 01795g、
NaHCO3 1147g、dd H2O 500ml) ; 封闭液、稀释液为含体
积比 5 %猪血清的 PBST;酶底物为 TMB 的磷酸 - 柠檬
酸缓冲液 ;终止液为 2molΠL 硫酸。
11112 　仪器　倒置生物显微镜 ,德国LEICA 公司 ;CO2
细胞培养箱 ,美国 Precision 公司 ;高速匀浆机 ,低温离
心机 ,Beckman 公司 ;550 型酶标仪 ,美国 Bio2Rad 公司。
112 　方法
11211 　人工抗原的合成 　利用恩诺沙星分子 ( ENR)
上的羧基 , 采用活性酯法[5 ,6 ] 合成完全抗原 ( ENR2
BSA) 。
11212 　细胞融合用小鼠的筛选 　将完全抗原免疫 6
周龄 BalbΠc 小鼠 ,剂量 50μg·012 mlΠ只 ,颈背部皮下分
点注射。首次免疫加等体积的福氏完全佐剂进行乳
化 ,加强免疫加福氏不完全佐剂进行乳化 ,间隔 3 周进
行 ,第 3 次加强免疫后 1 个月断尾采血分离血清 ,间接
ELISA 检测抗 ENR 多克隆抗体 (pAb) 效价 ,间接竞争
ELISA 检测 ENR pAb 对 ENR 的半数抑制浓度 ( IC50 ) ,
挑选效价高和 IC50低的小鼠为融合备用鼠。
11213 　细胞融合与杂交瘤细胞株的筛选　细胞融合
前 7d ,复苏骨髓瘤细胞。经传代培养 ,细胞生长旺盛、
形态良好、边缘透亮时 ,对融合小鼠进行超强免疫。超
免时不加佐剂 ,尾静脉和腹腔各注射 25μg 抗原。准备
生长良好的 4～5 瓶瘤细胞 ,细胞计数后 ,将细胞悬液
离心 ,以去除血清。离心时准备脾细胞。处死小鼠 ,将
脾脏无菌取出。通过无菌滤网将脾细胞滤至洗液中 ,
计数后取适量 (5 倍量瘤细胞) 与瘤细胞同时离心。离
心后弃上清 ,然后将瘤细胞和脾细胞混在一起离心。
离心后弃上清 ,打散细胞团 ,做细胞融合。在 37 ℃水
浴条件下 ,在 1min 内加 1ml PEG1500 ,边加边摇匀。然
后在 90s 内加 15ml 洗液 (30s 1ml ,30s 3ml ,30s 11ml) 。
37 ℃水浴 5min 后离心 ,弃上清 ,用 HAT 选择培养基稀
释细胞团 ,形成细胞悬液。将融合后的细胞悬液加到
998　6 期 抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争 ELISA 试剂盒的研制
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已铺有滋养细胞层 (小鼠腹腔巨噬细胞) 的 96 孔细胞
培养板中 ,HAT选择培养基培养。融合细胞培养至第
10 天 用 HT培养基半量换液 ,第 14 天抽取细胞上清进
行检测 ,用间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 进行阳性杂
交瘤细胞株的筛选 ,选择强阳性、抑制效果好、细胞生
长旺盛的细胞孔转至 24 孔细胞培养板中扩大培养 ,7d
左右抽取上清再次筛选。对筛选出的细胞孔进行有限
稀释克隆化 ,通过细胞计数 ,每个孔中大约 1 个细胞
量。采用 HT选择培养基选择培养。5 - 7d 后新的细
胞克隆长出 ,吸取细胞上清进行筛选 ,将效价高和抑制
效果好的单克隆转至 24 孔培养板。经过多次筛选和
克隆 ,最后转至细胞培养瓶中。经过对培养上清进一
步检测和筛选后 ,确定能够分泌恩诺沙星单克隆抗体
的杂交瘤细胞株。将其冻存一部分 ,其余的继续培养
至细胞浓度达 5 ×105个Πml ,制备腹水。采用体内诱生
腹水法制备单抗 ,14d 左右采集腹水。将小鼠腹水经
4 ℃12000rpm 离心 30min 的预处理后 ,吸取上清 ,然后
采用饱和硫酸胺盐析法纯化 ENR mAb。用间接 ELISA
法测定亲和常数 ( Ka) [7 ,9 ]和 Ig 亚类鉴定。用亲和力最
高和抑制效果最好的 1 株杂交瘤细胞制备的单抗研制
竞争 ELISA 试剂盒。
11214 　ENR2Kit 的研制
1121411 　酶标半抗原 ( HRP2ENR) 的合成和鉴定 　采
用活性酯法[5 ]合成酶标半抗原 ,通过间接 ELISA 测定
酶的效价 ,效价至少达 1∶1000 可用于研制竞争 ELISA
试剂盒。
1121412 　ENR mAb 与 HRP2ENR 工作浓度的确定　用
方阵滴定法[8 ] 确定 ENR2Kit 中 ENR mAb 与 HRP2ENR
的最佳工作浓度。
1121413 　竞争 ELISA 方法的操作[10 ] 　配制恩诺沙星
标准品 ,用灭菌 PBS 溶解 (少量盐酸助溶) ,其质量浓
度分别为 256、128、64、32、16、8、4、2、1μgΠL ,并依下列
程序操作 : (1)将 gamIgG包被于固相载体 ,质量浓度为
4μgΠml ,100μlΠ孔 ,4 ℃包被过夜 ,PBST 洗板 ,洗 3 次 ,每
次浸泡 3 min ; (2) 含 5 %猪血清 PBST 封闭 ,300μlΠ孔 ,
37 ℃,温育 1h ,PBST 洗板 ; (3) 加入最佳工作浓度的单
抗 ,100μlΠ孔 ,37 ℃,温育 30min , PBST 洗板 ; (4) 分别加
游离恩诺沙星标准品 (256～1μgΠL) ,设 0 标准对照和
空白对照 ; 然后每孔再加 50μl 酶标半抗原 ( HRP2
ENR) , 37 ℃,温育 30min , PBST 洗板 ; ( 5) 加酶底物 ,
100μlΠ孔 ,显色 10min ; (6) 加终止液 ,酶标仪读取吸光
值。
1121414 　灵敏度和标准曲线　以 ENR mAb 对不同浓
度 ENR 标准品的抑制率 BΠB0 (B 是 ENR 不同标准品
浓度的 A450值 ,B0 是 ENR 0 浓度的 A450值) 为纵坐标 ,
不同标准品浓度的对数值为横坐标 ,在半对数坐标纸
上绘制标准曲线 ,推导回归方程。灵敏度通常用检测
限 (LOD)和半数抑制浓度 ( IC50 ) 来表示 ,测定 20 个空
白标准品 ,计算 A450 值的平均值 ( X) 和标准差 ( SD) ,
LOD 为 (X22s )ΠX 值所对应的标准曲线的恩诺沙星浓
度[11 ] 。在标准曲线上查出对应的 ENR 质量浓度则为
ENR2Kit 理论上的检测限 ,通过标准曲线和回归方程
可计算 IC50 。
1121415 　特异性 　ENR 及 ENR 结构相似物喹诺酮
类、氯霉素等其他抗生素类作抑制物 ,竞争 ELISA 测定
各抑制物的 IC50 ,以 ENR mAb 对 ENR 的 IC50与各抑制
物 IC50的百分比为其交叉反应率 (CR %) 。交叉反应率
越低 ,特异性越强。
1121416 　空白样品添加回收试验　鸡肉样、鸡肝样和
鱼肉样的处理[12 ] :1g 样品用 1ml 提取物 (甲醇∶PBS = 1
∶1)匀浆 ,加入不同浓度的标准品 ,在旋涡震荡器上混
匀 5s , 然后用高速搅拌器剧烈搅拌 30min , 4 ℃
12000rpm离心 1h ,取上清用 PBS 做 1∶10 倍稀释后备
用 ,恩诺沙星的终浓度分别为 8、32、64μgΠL ;牛奶样品
处理参考范国英的方法[10 ] ,鲜牛奶样用 0101molΠL PBS
缓冲液按体积比 1∶1 稀释成含体积分数 50 %的奶样处
理液 ,加入不同浓度的标准品 ,使恩诺沙星的终浓度分
别为 8、32、64μgΠL。每种样品均设 6 个重复 ,以回收率
和变异系数 (CV)确定其准确度。
1121417 　基质效应性 　以 PBS、鸡肉样、鸡肝样、鱼肉
样和牛奶样 5 种空白样品处理液为恩诺沙星标准品的
基质 ,按照 ENR2Kit 的操作方法测定 ,绘制曲线并进行
比较分析。
1121418 保存期　对保存 30、60、90、120、150 和 180d 的
ENR2Kit 做竞争 ELISA 试验 ,比较其半数抑制浓度
( IC50 )和相关系数。
2 　结果与分析
211 　杂交瘤细胞株的建立
小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后 14d ,对杂交瘤
细胞初次筛选 ,将细胞上清 1∶10 稀释做间接 ELISA ,
有 10 孔的吸光值大于 110 ,对这 10 孔做间接竞争
ELISA ,半数抑制 IC50在 10μgΠL 以下。将这 10 孔杂交
瘤细胞转入 24 孔细胞培养板中扩大培养。7d 后第 2
次筛选 ,选出 IC50在 2～4μgΠL 的 2 孔 (4G1 和 5D2)杂交
瘤细胞进行单细胞克隆化。
009 核　农　学　报 22 卷
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将待克隆的细胞悬液进行细胞计数。4G1 的细胞
个数为 516 ×105 个Πml ,5D2 的细胞个数为 217 ×105 个Πml。用 HT培养基稀释后 ,4G1 每孔约 1112 个细胞 ,
5D2 每孔约 1135 个细胞。将细胞悬液加到铺有饲养
细胞的 96 孔培养板。7 d 后对有单克隆的 70 孔采用
间接 ELISA 筛选 ,从 70 孔中选出 OD 值大于 015 的 17
孔 ,做间接竞争 ELISA ,确定 IC50 。选出 IC50 在 1～
4μgΠL之间的 3 孔转至 24 孔细胞培养板继续扩大培
养。7～10 d 再进行检测和筛选 ,从中又选出 IC50在 1
～2μgΠL之间 (4G12G1 和 4G12B3) 的两株转入细胞培养
瓶进行传代培养。经多次传代培养和检测 ,细胞株分
泌抗体稳定。
用 4G12G1 和 4G12B3 两株杂交瘤细胞制备腹水 ,
经饱和盐析法纯化腹水后 ,根据与抗原结合率为 50 %
所对应的抗体浓度的倒数值为亲和力大小 ,用间接
ELISA 测定亲和常数 ,其中 4G12B3 株的亲和常数为 9
×1010LΠmol ,4G12G1 株的亲和常数为 415 ×1010 LΠmol ,
结果见图 1 ,依据抗体亲和力理论[13 ,14 ] ,亲和力较好。
Ig 亚类鉴定为 IgG1 亚型。
选择亲和常数最大的 4G12B3 株制备的腹水研制
竞争 ELISA 试剂盒。
图 1 　恩诺沙星单抗的亲和常数测定曲线
Fig. 1 　Association constant ( Ka) curve of ENR mAb
212 　竞争试剂盒的性能参数
21211 　ENR mAb 与 HRP2ENR 工作浓度　方阵滴定结
果显示 ,ENR mAb 的最佳工作浓度为 1∶128000 ; HRP2
ENR 的最佳工作浓度为 1∶1000。
21212 　灵敏度和标准曲线　ENR mAb 对 ENR 的抑制
曲线如图 2 所示 ,回归方程 Y = - 012538 X + 015095 ,
相关系数 R2 = 019913。竞争 ELISA 检测 20 个空白标
准品 ,所得平均值为 1102 ,标准差为 01085 ;LOD 为 (B0
- 2s)ΠB0 的值所对应的标准曲线的恩诺沙星浓度 ,代
入曲线回归方程计算出LOD = 0105μgΠL ,即 ENR2Kit 的
灵敏度为 0105μgΠL。ENR2Kit 的线性检测范围为 0105
～10116μgΠL。根据回归方程计算出 ENR mAb 对 ENR
的半数抑制浓度 IC50为 111μgΠL。
图 2 　ENR24G12B3 单抗对 ENR 的抑制曲线
Fig. 2 　Inhibitory curve of 4G12B3 mAb
21213 　特异性　由表 1 可知 ,恩诺沙星与其他沙星类
化合物以及其他常用抗生素类化合物的交叉反应率均
小于 0101 % ,说明恩诺沙星单抗特异性较好。
表 1 　4G12B3 单克隆抗体与多种抗生素的交叉反应性
Table 1 　The cross reactivity of 4G12B3 mAb
and multi antibiotics
抑制物
inhibitors
半数抑制浓度
IC50 (μgΠL) 交叉反应率cross2reactivity( %)
恩诺沙星 enrofloxacin 111 100
环丙沙星 ciprofloxacin > 1125 ×104 < 0101
达氟沙星 danofloxacin > 1125 ×104 < 0101
二氟沙星 difloxacin > 1125 ×104 < 0101
诺氟沙星 norfloxacin > 1125 ×104 < 0101
磺胺嘧啶 sulfadiazine > 1125 ×104 < 0101
氯霉素 chloramphenicol > 1125 ×104 < 0101
链霉素 streptomycin > 1125 ×104 < 0101
庆大霉素 gentamycin > 1125 ×104 < 0101
氨苄青霉素 ampicillin > 1125 ×104 < 0101
21214 　准确度 　表 2 表明 , 鸡肉样的添加回收率在
7718 %～8615 % ,平均 8115 % ,CV 为 514 %～9181 % ,
平均 7162 % ;鸡肝样的添加回收率在 83 %～9117 % ,
平均 8716 % ,CV3155 %～814 % ,平均 611 % ;鱼肉样的
添加回收率在 8014 %～8918 % ,平均 8413 % , CV 为
513 %～10145 % ,平均 7165 % ;牛奶样的添加回收率在
9015 %～9814 % ,平均 95 % ,CV 为 416 %～915 % ,平均
618 %。说明 ENR2Kit 具有较高的准确度。
21215 　基质效应性 　如图 3 所示 5 种基质标准曲线
的 IC50分别是 :PBS 处理液为 111μgΠL、牛奶样处理液为
1145μgΠL、鸡肝样品处理液为 210μgΠL、鸡肉样处理液
为 2161μgΠL、鱼肉样处理液为 2194μgΠL。结果说明 ,尽
管不同生物基质对标准品的吸光值有一定影响 ,但其
IC50变化不大 ,对 ENR2Kit 的敏感性和检测结果影响不
大 ,可见上述样品的处理方法是可行的。
109　6 期 抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争 ELISA 试剂盒的研制
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表 2 　ENR2Kit 检测不同样品的添加回收试验
Table 2 　Recovery test of ENR added to different samples
by ENR2Kit ( n = 6)
样品
sample
ENR 添加量
amount of
ENR(μgΠL) 测定值measured value(μgΠL) 回收率Recovery( %) CVΠ%
鸡肉
chicken
鸡肝
liver
鱼肉
fish
牛奶
milk
8 6192 ±0153 8615 ±6163 7166
32 2517 ±1139 8013 ±4134 514
64 49179 ±4188 7718 ±7163 9181
8 7105 ±0125 8811 ±3113 3155
32 26156 ±1165 83 ±5116 6122
64 58169 ±4193 9117 ±717 814
8 7118 ±0175 8918 ±9138 10145
32 26143 ±119 8216 ±5194 712
64 51146 ±2173 8014 ±4127 513
8 7187 ±0175 9814 ±9138 915
32 30172 ±1141 96 ±4141 416
64 57192 ±3165 9015 ±517 613
图 3 　不同基质对竞争 ELISA 试剂盒的影响
Fig. 3 　Effect of different sample diluted solution on
competitive ELISA ENR2Kit
21216 　保存期　试剂盒 4 ℃保存 1～6 个月期间 ,定期
做竞争 ELISA 检测 ,其 IC50在 1～2μgΠL 之间 ,相关系数
R2 在 0198 以上 ,其吸光值变化不明显 ,说明本试验建
立的竞争试剂盒的保存期在 6 个月以上。
3 　讨论
311 　人工抗原的合成和细胞融合前的筛选
恩诺沙星属于小分子半抗原 ,必须与大分子载体
蛋白相偶联后 ,在载体蛋白产生免疫的基础上 ,才能使
动物机体产生针对小分子半抗原的抗体。牛血清白蛋
白 (BSA) 、卵清白蛋白 (OVA) 是常用的载体蛋白 ,本试
验采用 BSA 做为免疫原载体 ,OVA 做为间接 ELISA 的
包被原载体。恩诺沙星分子上含有一个羧基 ,可做为
与载体蛋白相偶联的位点。文献报道的偶联方法有活
性酯法和氯甲酸异丁酯法[5 ,6 ,15 ] ,活性酯法采用 EDC和
NHS ,首先活化小分子的羧基 ,然后与载体蛋白上的氨
基形成肽键而连接 ;氯甲酸异丁酯法采用三丁胺和氯
甲酸异丁酯形成混合酸酐 ,然后与载体蛋白上的氨基
形成肽键而连接。本试验采用两种方法分别偶联 ,并
且对偶联的时间、反应物的浓度等参数做了不同的设
计 ,均偶联成功 ,经紫外扫描法估算其偶联比 ,氯甲酸
异丁酯法的偶联比最高为 1∶29 ,活性酯法偶联物得到
偶联比分别为 1∶16、1∶10、1∶5 的偶联物。将 4 种偶联
比的偶联物分别免疫小鼠 ,对 4 免后的小鼠血清抗体
进行间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 试验 ,偶联比为 1∶
10 的小鼠组的效价最高且对药物的竞争效果最好 ,其
效价达 1∶10000 以上 , IC50约为 10μgΠL。所以 ,选择此
组小鼠做细胞融合 (试验结果待发表) 。本试验从细胞
融合之前对小鼠血清抗体的监测非常严谨 ,定期采血
分离血清 ,采用间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 相结合 ,
筛选有抗恩诺沙星抗体的小鼠。同时对小鼠的多抗做
交叉反应试验 ,对其特异性做初步判断。为排除桥抗
的干扰 ,采用不同偶联方法的包被原分别试验 ,经过严
谨的前期试验 ,选出的融合小鼠是合格的。
312 　杂交瘤细胞株的筛选和竞争 ELISA的建立
小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞在 PEG作用下进行细
胞融合 ,在 HAT选择培养基条件下 ,7d 后未融合的脾
细胞和骨髓瘤细胞会死亡 ,只有融合的杂交瘤细胞才
得以存活。本试验的细胞融合率高于 90 % ,抗体阳性
率高于 15 %。对融合成功的细胞克隆采用间接 ELISA
和间接竞争 ELISA 相结合的方法 ,层层筛选 ,经多次有
限稀释克隆选择 ,获得 2 株效价高、亲和力好、敏感性
好、特异性强的杂交瘤细胞株。其中 4G12B3 株的 ENR
mAb 间接 ELISA 效价为 1∶1024000 ,亲和常数 ( Ka) 为 9
×1010LΠmoL ,其竞争 ELISA 标准曲线的线性检测范围
为 0105～10116μgΠL ,半数抑制浓度 ( IC50 ) 为 111μgΠL ,
与其他化合物的交叉反应率 ( CR %) 均小于 0101 %。
为验证所建方法的准确性 ,对多种样品做了药品添加
回收试验。由于恩诺沙星在家禽细菌性疾病及支原体
病的防治中应用广泛 ,质检部门对禽类产品的检验中 ,
其监测是重要一环 ;同时 ,恩诺沙星在奶牛乳腺炎的治
疗中起到非常重要的作用 ,故恩诺沙星在牛奶中残留
的监测也非常重要 ;另外 ,近年来恩诺沙星在水产养殖
中得到广泛应用 ,也使恩诺沙星成为水产品药残检测
的重要一项。基于这些原因 ,本试验在 ENR 回收试验
中选用了鸡肉、鸡肝、牛奶和鱼肉等样品。在样品的前
处理中 ,牛奶样品是将原奶用 PBS 做 2 倍稀释后检测 ,
可得到 86 %～99 %的回收率 ;鸡肉、鸡肝和鱼肉的处
理稍复杂一点 ,采用甲醇和 PBS(VΠV = 1∶1) 做为提取
液 ,离心后再用 PBS 做 1∶10 稀释 ,从而降低了甲醇对
209 核　农　学　报 22 卷
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检测结果的影响 ,回收率在 78 %～95 %之间。检测所
有样品的平均变异系数均小于 10 % ,并且不同基质中
添加标准品所建立的标准曲线非常相似 ,对检测结果
影响小。所以本试验建立的竞争 ELISA 方法可以对恩
诺沙星在多种动物性产品中的残留进行检测 ,符合国
家的检测标准。
S. Bucknall 采用氯甲酸异丁酯法合成恩诺沙星免
疫原 ,免疫绵羊制备多抗 ,建立了 ELISA 检测方法 ,其
IC50为 1319μgΠL [6 ] ; Hiroo Watanabe 制备了恩诺沙星单
抗并建立了 ELISA 检测方法 , 对牛奶的检测限是
1μgΠL ,对鸡肉的检测限是 10ug/ kg ,牛奶和鸡肉的添加
回收率分别是 8410 %～9910 %和 7214 %～9210 %[5 ] ;
刘红制备了恩诺沙星单抗 ,其标准曲线在 01423～
1000μgΠL 之间线性关系良好 , IC50 为 33. 76μgΠL [15 ] 。与
这些研究相比 ,本试验所制备的单抗建立的竞争
ELISA 检测方法具有更高的灵敏性 ,半数抑制浓度 IC50
达 111μgΠL , 竞争 ELISA 线性检测范围为 0105 ～
10116μgΠL ,该检测灵敏度已达到国际标准 ,能够满足
实际应用的要求。恩诺沙星的免疫学检测与色谱法相
比 ,最大优势就是快速、灵敏、前处理简单 ,如若能够利
用制备的单抗研制成胶体金检测试纸条 ,则更适合基
层的应用和对大批量样品的检测 ,但其需要高灵敏性
的单抗 ,所以本试验制备的高灵敏性、高特异性恩诺沙
星单抗 ,为后续试纸条的研制奠定了基础。
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