全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032193206
棉铃虫线粒体 cox2 基因的克隆、序列及系统学分析
魏兆军1 　陈复生2 　尹　姣3 　张海如4 　罗建平1
(11 合肥工业大学生物与食品工程学院 ,安徽 合肥　230009 ;21 安徽省农业科学院蚕桑研究所 ,安徽 合肥　230036 ;
31 中国农业科学院植物保护研究所 , 北京　100094 ; 41 河北省衡水市安平县农业局 , 河北 衡水　052600)
摘 　要 :利用兼并性引物克隆出棉铃虫线粒体细胞色素氧化酶亚基 Ⅱ基因 ( cox2) , cox2 基因编码框包含
682 个核苷酸 ,编码 227 个氨基酸的蛋白质 ; 起始密码子为 ATG, 终止密码子仅有一个 T 组成。利用
GenBank 数据库搜索了其他 12 种昆虫的线粒体 cox2 基因序列 ,通过同源性比较 ,发现棉铃虫的 cox2 与
鳞翅目 4 种蚕的 cox2 同源性最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到 85 %～88 %和 9310 %～
9417 %。同时 ,根据 cox2 核苷酸和编码的氨基酸序列进行了 13 种昆虫的分子系统学分析的探讨 ,发现
分子系统树与形态分类基本一致 ,但略有差异。
关键词 :线粒体 DNA ; 棉铃虫 ; cox2 基因 ; 分子系统学
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT Ⅱ
GENE OF MITOCHONDRIAL DNA FROM Helicoverpa armigera
WEI Zhao2jun1 　CHEN Fu2sheng2 　YIN Jiao3 　ZHANG Hai2ru4 　LUO Jian2ping1
(1 . School of Biotechnology and Food Engineering , Hefei University of Technology , Hefei ,Anhui 　230009 ;
21 Sericultural Research Institute , Anhui Academy of Agricultural Sciences , Hefei , Anhui 　230036 ;31 Institute of Plant protection ,
Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100094 ;41 Ping County Burean of Agriculture , Hengshui , Hibei 　052600)
Abstract :Mitochondrial cytochrome oxidase Subunit Ⅱgene ( cox2) of Helicoverpa armigera was cloned and sequenced. The
open reading frame of cox2 gene contains 682 nucleotides , encoding a putative protein of 227 amino acids. The initial codon
of mtcox2 of Helicoverpa armigera is ATG. The mtcox2 gene uses an incomplete termination codon , T , which can generate a
complete termination codon , TAA , by polyadenylation of the transcripts. Compared with other cox2 , the Helicoverpa armigera
cox2 shows high identity with four cox2 from silkmoth , 85 %～88 % in nucleotide sequence and 9310 %～9417 % in amino
acid sequence respectively. Based on the alignment of nucleotide and amino acid sequences , the phylogenetic tree of 13 insect
cox2 genes is constructed. The molecular phylogenetic tree is similar with morphology tree.
Key words :mitochondrial DNA ; Helicoverpa armigera ; cox2 gene ; molecular phylogenetic
收稿日期 :2005-07-06
基金项目 :国家自然科学基金资助 (30500374) ,安徽省重点科研计划项目 (05021003)
作者简介 :魏兆军 (19702) ,男 ,安徽肥东人 ,理学博士 ,副教授 ,研究方向为昆虫生物化学与分子生物学。Email : weizhaojun @hotmail . com　　动物线粒体是能量生成场所 ,是参与脂肪酸及部分蛋白质合成的真核细胞内的重要细胞器。线粒体具有自身的遗传控制系统 ,受到细胞染色体 DNA 的控制 ,具有较高的内外源诱变因素以及错误复制和不完善的修复机制。线粒体基因组长度大都在 16kb 左右 ,是共价闭合的环状双链 DNA ,结构比较简单、稳定 ;线粒体基因组在遗传上具有自主性 ,每个细胞中有 1000 ～10000 个拷贝 ,基因组中不含间隔区和内含子 ,无重复序列和不等交换 ,在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变 ,替换率比核 DNA 高 5～10 倍 ,并且遵守严格的母系遗传方式 ,个体内的线粒体 DNA 具有高度的均一性 ,一般无组织特异性 ,容易从组织中提纯 ,重复性好 ,便于进行结果分析。因此 ,依据线粒体基因组基因进行动物分子系统学研究越来越受到重视[1 ] 。
391　核 农 学 报　2006 ,20 (3) :193～198Journal of Nuclear Agricultural Sciences
依据线粒体 DNA 序列进行分子系统学研究国内
外报道较多。例如 ,Burbrink[2 ] 等通过对北美 ratsnake
的线粒体系统学研究 , 认为它不属于一个亚种。
Hasegawa[3 ]研究认为 ,长臂猿、猩猩、大猩猩、黑猩猩与
人类祖先分歧的时间分别为 13130、10186、3167 和 2168
百万年以前。Brehm[4 ] 根据蜥螅的线粒体核甘酸序列
分析了 Mabuya spp、Reptilia 和 Scincidae 3 个亚种的进
化关系。Bermingham[5 ]讨论了热带淡水鱼与中美洲鱼
的起源和进化。
张亚平等[6 ] 利用线粒体基因分子系统学研究证
实 ,全世界的狗具有相同的遗传基因 ,都起源于东亚 ,
之后才逐渐扩散到世界各地 ,并使它们今天的认知能
力远远超过其他物种。同时 ,他依据线粒体基因特点 ,
深入研究灵长类、食肉类、兔形类和啮齿类的进化 ,在
国际上建立了第一个较为全面的熊超科分子系统树 ,
阐述了大熊猫等的进化地位[7 ,8 ] 。陆剑等[9 ] 依据线粒
体 cox II基因序列进行了金色果蝇复合种的 5 个姊妹
种及其近缘种的分子系统分析 ,并推算出它们的分化
时间。鲍蕾等[10 ]依据线粒体 cox I 基因部分序列进行
了 4 种臂尾轮虫的系统发育关系分析 ,认为中方形臂
尾轮虫和壶状臂尾轮虫的亲缘关系最近 , 矩形臂尾轮
虫次之 , 萼花臂尾轮虫最远。陈晓芳等[11 ]依据线粒体
细胞色素 b 基因序列对 12 种鸟类进行了分子系统发
育关系分析 ,包括蒙古沙、环颈、大杓鹬、白腰杓鹬、中
杓鹬、红脚鹬、林鹬、翘嘴鹬、翻石鹬、大滨鹬、反嘴鹬和
砺鹬 ,分子系统分析的结果验证并补充了形态学的分
析结果。笔者曾对蓖麻蚕线粒体基因组细胞色素氧化
酶亚基 Ⅱ( cox2) 和亚基 Ⅲ( cox3) 基因进行克隆和测
序[12 ,13 ] ,结果表明 mtDNA cox2 和 cox3 核苷酸和氨基
酸序列的分子系统树可反映一组物种亲缘关系的昆虫
的分子系统演化。
目前 ,棉铃虫线粒体基因的结构特点还未见报道 ,
本文根据 Hwang 等[14 ] 的方法 ,利用兼并性引物嵌套
PCR 克隆出含棉铃虫线粒体 cox2 基因的片段 ,并利用
GenBank 数据库 ,检索了其他 12 种昆虫的 cox2 序列 ,
进行了同源性比较和分子系统学方面的探讨。
1 　材料与方法
111 　材料
棉铃虫品种为 SUS2 ,由南京农业大学提供 ,在本
实验室常规饲养 ;克隆用载体为 pMD2T 购于 TaKaRa
公司 ,宿主菌为 XL21。
112 　方法
11211 　棉铃虫线粒体 DNA 的制备 　参考沈兴家
(2000) [15 ]抽提家蚕线粒体 DNA 的方法并稍加改进。
11212 　棉铃虫线粒体细胞色素氧化酶亚基 Ⅱ基因的
克隆 　根据家蚕、柞蚕、野蚕、果蝇和冈比亚按蚊的
mtcox1 和 mtcox2 的序列 ,设计两对兼并性引物 ,其中
P3 和 P4 为嵌套引物 ,如图 1。
图 1 　克隆策略及引物示意图
Fig. 1 　Strategy of cloning and primers
　　先用 P1 和 P2 为引物 ,棉铃虫线粒体 DNA 为模
板 ,进行一次 PCR 反应 ,条件为 : 94 ℃,40s ;50 ℃,40s ;
72 ℃,2min ;30 个循环。取 1μl 一次 PCR 产物的回收片
段为模板 ,以 P3 和 P4 为引物进行嵌套 PCR 反应 ,条
件为 : 94 ℃, 40s ; 55 ℃, 40s ; 72 ℃, 115min ; 30 个循环。
PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳 ,回收其中的目的片
段 ,与 pMD2T 载体进行连接、转化。再用酶切方法筛
选重组子 ,经鉴定后 ,送 TaKaRa 公司进行序列测定。
11213 　棉铃虫 mtcox2 的序列分析及分子系统学分
析 　根据棉铃虫 mtcox2 的序列 ,在 GenBank 数据库中
有选择性检索出其他 12 种昆虫的 mtcox2 ,共 13 种。
利用 Dnastar 软件对获得的基因序列按无脊椎动物线
粒体基因组遗传密码进行阅读框分析、氨基酸序列的
推定 ,并利用 Clustalw 软件与其他 12 种昆虫 mtDNA 的
cox2 基因氨基酸进行同源性比较和分子系统学的探
讨。
2 　结果与分析
211 　棉铃虫线粒体 cox2 基因的克隆
利用碱变性方法抽提棉铃虫线粒体 DNA 作为模
板 ,先用兼并性引物 P1 和 P2 进行 PCR 扩增 ,获得的
491 核　农　学　报 20 卷
产物经电泳鉴定 ,在约 2080 bp 处有一较亮条带 ,同时
还有一些非特异性条带 ,把该条带切下 ,胶回收后作为
模板。以 P3 和 P4 进行嵌套 PCR 扩增 ,产物经电泳鉴
定 ,获得一约 1300bp 的条带 ,根据其他物种的报道 ,分
析该条带为目的片断 ,结果见图 2。把该带切下回收
DNA ,然后利用 PMD2T 载体进行克隆 ,鉴定阳性克隆
后进行序列测定。
图 2 　棉铃虫线粒体 cox2 PCR 产物电泳示意图
Fig. 2 　The band of PCR results
M: 核酸分子量标记 ; 1 :引物 P1 和 P2 的 PCR 产物 ;
2 : 引物 P3 和 P4 的 PCR 产物
M: DNA marker ; 1 : the PCR result using primer
P1 and P2 ; 2 : the PCR result using primer P3 and P4
212 　棉铃虫线粒体 cox2 基因的序列分析
序列测定后得到 1276 bp 的序列 ( GeneBank
Accession NO. DQ059302) 。经分析 ,564～1244 bp 为细
胞色素氧化酶亚基 Ⅱ( cox2) 基因的全序列 ,其上游含
有细胞色素氧化酶亚基 I ( cox1) 基因的部分片段和
tRNA2Leu 基因的全长。利用 Dnastar 软件 ,按照无脊椎
动物线粒体氨基酸编码特点 ,把细胞色素氧化酶亚基
Ⅱ的碱基序列翻译为氨基酸序列 ,结果见图 3。棉铃
虫 mtDNA cox2 基因的编码框包含 682 个核苷酸 ,编码
227 个氨基酸的蛋白质 ;起始密码子为 ATG,终止密码
子仅有一个 T组成 ,这种不完整的终止密码子是在转
录过程中需经添加 polyA 后才形成终止子。棉铃虫的
tRNA2Leu 基因全长 67 个碱基 ,按 Sprinzal 等[16 ] 划分线
粒体基因 tRNA 二级结构的方法 ,推定了棉铃虫线粒
体 tRNA2Gly 基因的二级结构 ,见图 4。
213 　棉铃虫线粒体 cox2 基因与其他物种的同源性
比较
检索 GenBank 数据库 ,搜索了已发表的 12 种其他
昆虫线粒体 cox2 基因 ,进行同源性比较。这 12 种昆
虫包括鳞翅目的蓖麻蚕、柞蚕、家蚕和野蚕 ;双翅目的
亚库巴果蝇、黑腹果蝇、四斑按蚊和冈比亚按蚊 ;膜翅
目的蜜蜂 ;直翅目的东亚飞蝗 ;半翅目的臭虫以及虱目
的澳洲虱子。其分类和 GenBank 登陆号见表 1。
表 1 　13 种昆虫的分类学位置及 GenBank 登陆号
Table 1 　Classification of 13 insects and the
GenBank accession number
昆虫类别
insect
所属的目
order
登陆号
accession No
棉铃虫
Helicoverpa armigera
鳞翅目Lepidoptera DQ059302
蓖麻蚕
Samia cynthia ricini
鳞翅目Lepidoptera AY382605
柞蚕
Antheraea pernyi
鳞翅目Lepidoptera NC-004622
家蚕
Bombyx mori
鳞翅目Lepidoptera AY048187
野蚕
Bombyx mandarina
鳞翅目 Lepidoptera AB070263
亚库巴果蝇
Drosophila yakuba
双翅目 Diptera X03240
黑腹果蝇
Drosophila melanogaster
双翅目 Diptera U37541
四斑按蚊
Anopheles quadrimaculatus
双翅目 Diptera L04272
冈比亚按蚊
Anopheles . gambiae
双翅目 Diptera L20934
蜜蜂
Apis mellifera 膜翅目 Hymenoptera L06178
东亚飞蝗
Locusta migratoria
直翅目 Orthoptera X80245
臭虫
Triatoma dimidiata
半翅目 Hemiptera AF301594
澳洲虱子
Heterodoxus macropus
虱 目 Phthiraptera AF270939
　　利用 Clustal 软件进行 mtcox2 基因核苷酸和氨基
酸同源性比较 ,结果见表 2。与其他 12 种昆虫 mtcox2
基因同源性比较结果表明 ,无论从核苷酸水平或氨基
酸水平 ,棉铃虫与鳞翅目的其他 4 种蚕类的同源性最
高 ,核苷酸水平同源性达到 85 %～88 % ,氨基酸水平
的同源性达到 9310 %～9417 % ,氨基酸水平的同源性
高于核苷酸水平 ,说明了棉铃虫 cox2 基因编码的蛋白
是相对保守的。棉铃虫与澳洲虱子 ( H. macropus) 的
同源性最低 ,核苷酸水平为 5719 % ,氨基酸水平为
5312 %。从上面的同源性比较可看出 ,昆虫 mtDNA
cox2 基因是相对保守的 ,因此 ,可以利用他们之间的
同源性差异进行分子系统方面的分析。
213 　棉铃虫线粒体 cox2 序列在系统学分析中的应用
利用 Clustal method 方法 ,绘制线粒体 cox2 基因的
分子系统树 (图 5、6) ,分子系统学结果基本上与昆虫
的形态分类学一致 ,但与形态学的系统树也稍有差别。
591　3 期 棉铃虫线粒体 cox2 基因的克隆、序列及系统学分析
图 3 　棉铃虫线粒体 DNA cox2 基因序列和氨基酸序列
Fig. 3 　Nucleotide and amino acid sequences of Helicoverpa armigera mtDNA cox2 gene
用方框标明的 ATG是 cox2 基因的起始密码子 ,背景有黑影的序列为编码 tRNA2Leu 基因的序列
The suggested start codon ATGof cox2 gene is indicated in boxes. The tRNA2Leu gene is shaded.
从依据 cox2 基因的核苷酸和编码的氨基酸两种分子
系统均可以看出 ,棉铃虫与鳞翅目的蚕类聚为一类 ;双
翅目的 2 种蝇类和 2 种蚊子聚为一类 ;直翅目的东亚
飞蝗和半翅类的臭虫关系较近 ,聚为一类 ,在氨基酸水
平上 ,它们先与双翅目聚为一大群 ,然后再与鳞翅目的
5 种昆虫聚在一起 ,然而 ,从核苷酸水平来看 ,它们并
没有先与双翅目聚为一群。澳洲虱子与其他昆虫关系
最远 ,蜜蜂次之 ,这说明这两种昆虫的进化速率比其他
几种昆虫快。
3 　讨论
本研究参考 Hwang[14 ] 的方法 ,利用兼并性引物嵌
套 PCR 克隆出含棉铃虫线粒体 cox2 基因的片段 ,然后
691 核　农　学　报 20 卷
表 2 　13 种昆虫线粒体 DNA cox2 基因核苷酸和氨基酸同源性比较
Table 2 　Comparison of identity ( %) among cox2 from insect mtDNA
昆虫 insect 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 T. dimidiata 333 7512 5118 7315 7512 7310 7216 7315 7310 5519 7315 6614 7216
2 A . gambiae 6912 333 5518 7513 9615 7518 7513 8219 8116 5312 7617 6617 7514
3 A . mellifera 5211 5817 333 5419 5315 5419 5419 5414 5315 5010 5518 4610 5311
4 A . pernyi 6617 7315 6012 333 7513 9318 9314 7715 7814 5411 9413 6615 9610
5 A . quadrimaculatus 6716 8716 5814 7118 333 7513 7419 8210 8017 5312 7612 6612 7514
6 B . mandarina 6917 78 6212 8717 7517 333 9916 7617 7715 5415 9417 6615 9310
7 B . mori 6716 77 6214 8516 7413 9616 333 7612 7711 5415 9413 6611 9215
8 D. melanogaster 6511 7717 5816 7512 7618 7517 7419 333 9812 5316 7810 6612 7712
9 D. yakuba 6417 7619 5917 7514 7517 76 7415 9311 333 5312 7810 6518 7811
10 H. macropus 5414 5618 5813 5614 5318 5816 5816 5518 5512 333 5312 4717 5415
11 H. armigera 6812 7511 64 85 7512 88 87 7418 7512 5719 333 6615 9310
12 L . migratoria 6214 6715 5712 6316 6912 6813 6619 6618 67 5216 6813 333 6518
13 S . cynthia ricini 6518 7411 6112 89 7311 8516 8515 7516 7618 5819 8513 6416 333
注 :表中对角线上部为氨基酸同源性 ,下部为核苷酸同源性 ;第 1 行中的数字代表昆虫 ,昆虫名与第 1 列中相同数字后的名称相同。
Note : The data in the upper of diagonal are based on the amino acid sequences of mtcox2 gene , and the other are based on the nucleotide sequences. The numbers in the
1st line represent insects , the name of insects are same with the name after the same number in the 1 st row.
图 4 　棉铃虫线粒体 DNA 的 tRNA2Leu 基因可能的二级结构
Fig. 4 　Possible second structure of Helicoverpa armigera
mitochondrial tRNA2Leu gene
图 5 　基于 13 种昆虫基于线粒体 DNA cox2 核苷酸序列的分子系统树
Fig. 5 　A phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of mtDNA cox2
进行序列分析。结合笔者克隆蓖麻蚕线粒体 cox2 基
因的经验 ,说明利用兼并性引物嵌套 PCR 克隆线粒体
基因是一个简单方便的方法。同时 , 我们利用
GenBank 数据库 ,搜索了其他 12 种昆虫的线粒体 cox2
基因序列 ,并进行了分子系统演化的探讨。
进行分子系统学分析关键看所选择的目的基因 ,
目前一般认为线粒体上编码蛋白的基因是比较理想的
结果 ,笔者在这方面也曾做了一些尝试。从本次研究
结果看 ,根据线粒体 cox2 基因的核苷酸和氨基酸的序
列构建的分子系统树 ,与从形态学角度的系统分类在
大的方面是一致的[17 ] ,但也略有差异。主要表现在膜
翅目的蜜蜂与其他物种关系较远 ,笔者在以前依据蓖
麻蚕 cox3 基因的系统分析中也发现这点 ,这可能与线
粒体 DNA 严格的母性遗传方式和蜜蜂的群体繁育模
式有关。本次研究中发现澳洲虱子在这 13 种昆虫中
线粒体 cox2 基因计划速率最快 ,这与以前的结果稍有
差别 ,还需要我们进一步分析。
791　3 期 棉铃虫线粒体 cox2 基因的克隆、序列及系统学分析
图 6 　13 种昆虫基于线粒体 DNA cox2 氨基酸序列的分子系统树
Fig. 6 　A phylogenetic tree based on the amino acid sequences of mtDNA cox2
　　在我国 ,棉铃虫是危害棉花最大的害虫 ,每年都要
耗费大量的人力和物力进行防治。线粒体基因组上编
码一些调控生物氧化呼吸链的关键蛋白 ,同时线粒体
编码蛋白与昆虫的抗药性有一定的关系 ,因此对其线
粒体编码基因进行研究具有非常重大的意义。本研究
中明确了棉铃虫线粒体 cox2 基因的分子结构 ,为我们
进一步研究 cox2 基因的表达和应用奠定了基础。
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