全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 062567205
高藻胆蛋白钝顶螺旋藻新品系的选育及 RAPD 分析
黄　晖　汪志平　张巧生　刘艳辉　李雪斌　徐步进
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,农业部核农学重点开放实验室 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :测得可用于工厂化生产的 9 株钝顶螺旋藻的藻蓝蛋白 PC、别藻蓝蛋白APC和藻胆蛋白 PBP 的含
量依次为 10174 %～16126 %、3167 %～5155 %和 14142 %～21181 % ,PC 与 APC 的比值在 2187 与 3105 之
间。以 PBP 含量最高的 Sp2CH为出发品系 ,用组织匀浆破碎和离心沉降法制得其单细胞或原生质球 ,
并先以 016 % EMS 处理 30mim 再用 214 kGy 的60 Coγ射线辐照 ,经藻丝单体分离培养、PBP 含量检测及实
验室与生产培殖试验 ,筛选到 1 株 PC、APC 和 PBP 含量依次比 Sp - CH 的约高 36 %、89 %和 50 % ,PCΠ
APC为 1191～2123 的突变株 ,命名为 Sp2CH32。RAPD 分析结果显示 ,随机引物 S38 对该突变株与 Sp -
CH基因组 DNA 扩增 ,得到的扩增产物中显示出多态性差异。Sp - CH32 经连续 3 年的工厂化培殖 ,表
现出生产性状好、PBP 高产特性稳定 ,目前已用于大规模养殖与产业化开发。
关键词 :钝顶螺旋藻 ;藻胆蛋白 ;突变体 ;育种 ;RAPD
SELECTION AND RAPD ANALYSIS OF A NEW SPIRULINA PLATENSISSTRAIN
WITH HIGH PHYCOBILIPROTEINS CONTENTS
HUANG Hui 　WANG Zhi2ping 　ZHANG Qiao2sheng 　LIU Yan2hui 　LI Xue2bing 　XU Bu2jin
( Zhejiang University , Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Key Laboratory of Chinese Ministry of Agriculture
for Nuclear2Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang 　310029)
Abstract :The contents of phycocyanin (PC) , allo2phycocyanin (APC) , phycobiliproteins (PBP) and the ratio of PC and APC
(PCΠAPC) of nine Spirulina platensis strains used in pilot plant cultivation were 10174 %～16126 % , 3167 %～5155 % ,
14142 %～ 21181 % and 2187 ～ 3105 , respectively. By mechanical grinding and sedimentation , the single cells or
spheroplasts of Sp2CH , whose PBP contents was highest in the nine tested strains , were obtained. They were treated by 016 %
EMS for 30min and 214 kGy 60 Coγ2rays , and then cultured by the single filament separating , a high PBP content strain
named as Sp2CH32 was obtained. The contents of PC , APC and PBP of Sp2CH32 were about 36 % , 89 % and 50 % , higher
than that of Sp2CH , respectively. And the PCΠAPC of Sp2CH32 were 1191～21231 Moreover , RAPD analysis showed that the
amplifcation bands of primers S38 revealed significant polymorphisms in Sp2CH32 and Sp2CH. The pilot plant cultivation in 3
consecutive years showed that Sp2CH32 was a perfect high PBP content strain with excellent characteristics , and has been
applied in mass cultivation and industrialization.
Key words : Spirulina platensis ; phycobiliproteins ; mutant ; breeding ; RAPD
收稿日期 :2007203220
基金项目 :浙江省科技计划重点项目 (2007C23052) ,国家自然科学基金项目 (30000010)
作者简介 :黄晖 (19822) ,男 ,浙江义乌人 ,硕士研究生 ,主要从事核技术应用与生物物理学研究。E2mail : Elvis206 @hotmail . com
通讯作者 :汪志平 (19682) ,男 ,浙江建德人 ,博士 ,副研究员 ,主要从事核技术应用、生物物理学、微藻生物技术研究。E2mail :zhpwang @zju. edu. cn　　藻胆蛋白 (phycobiliproteins ,PBP)是存在于蓝藻、红藻、隐藻和甲藻中特有的光合天线色素蛋白[1 ] 。螺旋藻 ( Spirulina) 是一种古老的原核丝状光合放氧蓝藻 , 也是当前全球开发规模最大的经济微藻[1 ,2 ] 。螺旋藻中 PBP 主要由藻蓝蛋白 (phycocyanin , PC) 和别藻蓝蛋白 (allo2phycocyanin ,APC)组成 ,其含量在目前广泛用于
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商业化开发的钝顶螺旋藻 ( S . platensis) 和极大螺旋藻
(S . maxam ) 这两个种中约占细胞干重的 10 %～
20 %[1 ,3～6 ] 。众多研究和临床实践证明 ,螺旋藻 PBP 不
仅是一种理想的天然食用色素 ,同时因其具有稳定、高
效的荧光活性而被开发成新型分子荧光探针和肿瘤激
光治疗光敏剂 ,另外它还具有抗氧化、抗菌、抑制肿瘤
和促进细胞生长等生理活性 ,因此当前有关 PBP 的研
发深受国内外广泛关注[1 ,3～6 ] 。螺旋藻的 PBP 生物合
成与累积受基因与环境综合影响 ,国内外在通过优化
培殖与干燥加工条件、改良转基因表达技术等提高
PBP 产量方面已作了一些研究 ,其成果对生产实践具
有重要的指导与推动作用[1 ,3～7 ] ,但有关高产 PBP 新品
种 (系)选育及产业化开发利用方面的报道还较少[8 ] 。
本试验以 PBP 含量较高的钝顶螺旋藻为出发品系 ,利
用诱发突变与分子标记技术育成了 1 株生产性状好、
PBP 含量高达 30 %的新品系。
1 　材料与方法
111 　供试材料
9 株钝顶螺旋藻分别为 Sp2NCS1、Sp2T、Sp2YE15、
Sp2CH、Sp2HUF01、Sp2IDF、Sp2WSY、Sp2J FR 和 Sp2CSH ,
均保存于浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与
分子工程实验室 ,均可用于工厂化生产。
112 　方法
11211 　培养条件 　采用 Zarrouk’s 培养液培养[9 ] 。实
验室培养在全自动温控光照培养箱中进行 ,光照强度
为4000 lx ,光照时间为 12 hΠd ,光照时温度为 28 ℃,黑
暗时温度为 20 ℃;工厂化培养试验在本实验室江苏微
藻试验基地进行 ,养殖池呈跑道型、盖有塑料薄膜、面
积为 300～800m2 ,培养液深约 30cm、流速约 15mΠmin。
11212 　诱变处理及突变体筛选 　诱变处理及突变体
筛选参照汪志平等[10 ] 、崔海瑞等[11 ] 的方法进行。用组
织匀浆破碎和离心沉降法制得其单细胞或原生质球 ,
先以 016 % EMS 处理 30mim ,再用 214 kGy 的60 Coγ射
线辐照 ,经藻丝单体分离培养、PBP 含量检测及培养试
验进行筛选。
113 　测定
11311 　藻胆蛋白含量测定 　参照朱广廉等[12 ] 的方法
并略作改进。将培养至对数生长期的待测藻液约
20ml 摇匀后分成等体积的 2 份 ,分别置于垫有滤纸的
布氏漏斗上抽滤 ,并用蒸馏水清洗 3 次。1 份藻泥置
于 50 ℃恒温干燥箱中烘至恒重 ,称得干藻重 (设为
Mmg) ,用于计算藻胆蛋白的百分含量 ;另 1 份藻泥移
入 10ml 带盖离心管中 ,加入 10mmolΠL 磷酸缓冲液
(pH618) 5ml 并摇匀 ,放入 - 30 ℃的低温冰箱中冻成冰
后 ,取出置暗处 ,室温下解冻 ,如此反复冻、融 3～4 次 ,
至藻细胞破碎、溶液呈深蓝色。用 UNIVERSAL2320R
离心机 (Hettich)于 12000rmp 离心 10min ,离心后所得上
清液 (设体积为 Vml ) 在紫外 - 可见分光光度仪
(UltroSpec2000 ,Amersham phamacia) 上作 200～750 nm
波长的吸收光谱扫描。螺旋藻干粉中 ,藻蓝蛋白 PC
的含量 (gΠ100g) = (1817A620nm - 819A652nm ) ×VΠM、别蓝
蛋白 APC 的含量 (gΠ100g) = (1916A652nm - 411A620nm ) ×
VΠM。其中 ,A620nm和 A652nm分别为藻蓝蛋白和别蓝蛋白
的特征吸收峰。藻胆蛋白 PBP 含量 ( %) 为上述所测
PC和 APC含量之和。利用 SAS v910 软件对数据作显
著性差异等统计分析。
11312 　RAPD 分析及显微形态学观察 　参照李晋楠
等[13 ]与汪志平等[14 ] 的方法进行。用 CTAB 法提取螺
旋藻基因组 DNA ,所用的 23 条随机引物购自上海生工
Sangon(Canada)生物工程技术服务有限公司 ,编号依次
为 S23 、S24 、S31 、S33 、S35 、S38 、S40 、S53 、S59 、S66 、S69 、S70 、S73 、
S78 、S80 、S82 、S88 、S90 、S91 、S99 、S112 、S118 、S119 。
2 　结果与讨论
211 　出发品系的确立
表 1 列出了 9 株应用于工厂化生产的钝顶螺旋藻
优良品系的藻蓝蛋白 PC、别藻蓝蛋白 APC、藻胆蛋白
PBP在干藻粉中的含量以及它们的 PC 与 APC 比值。
9 株钝顶螺旋藻的 PC、APC 和 PBP 的含量分别为
10174 % ～ 16126 %、3167 % ～ 5155 % 和 14141 % ～
21181 %。3 种蛋白质含量均以 Sp2CH 的为最大 , Sp2
IDF 的为最小。9 株品系的 PCΠAPC 在 2187 与 3105 之
间。
国内外有关螺旋藻的 PC、APC、PBP 含量已有许多
报道 ,结果因研究者所用的品种 (系) 、培殖与加工条
件、测定与计算方法等不同而有所差异。Sarada 等[1 ]
报道 1 株可用于工厂化培殖的钝顶螺旋藻品系 CFTRI
的 PC含量可高达其细胞干重的 1914 % ; Zhang 等[3 ] 研
究发现钝顶螺旋藻在自养条件下 ,PC 含量随培养时间
的延长变化不大 ,在 13 %～14 %之间 ,而当以葡萄糖
为碳源进行混养培养时 , PC 含量在培养之初降至
5 % ,尔后随时间延长升至 10 % ;张少斌等[4 ] 在研究 1
株藻丝变直的钝顶螺旋藻突变株 SP2Dz 时发现 ,其
PBP 含量随温度变化幅度为 14 %～22 %。表 1 中所测
的 9 株钝顶螺旋藻是在标准自养培养条件下的 PC、
865 核　农　学　报 21 卷
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APC、PBP 含量 ,与国内外报道的结果相近。从表 1 还
可看出 ,9 株螺旋藻间的 PC、APC、PBP 含量 ,除某些藻
株间的较相近外 ,多数藻株间的差异达到显著水平。
同时 , 9 株螺旋藻 PC 和 APC 含量间的相关系数为
01984 ,PBP 与 PC 和 APC 含量间的相关系数分别达
01999 和 01991。螺旋藻中 PC和 APC含量之间的高正
相关性 ,也可从各藻株间 PCΠAPC 的高相近性得以体
现。利用高分辨率的 X 射线衍射和结构解析研究螺
旋藻和多管藻等蓝藻的 PBP 晶体表明 ,不同来源 PBP
的晶体结构十分相似 ,从而提示蓝藻 PBP 的空间结构
及其组成蛋白 PC 和 APC 的比例是相当稳定的 ,只有
在某些特定生长条件下或发生遗传变异时才可能发生
变化[3 ,5 ,6 ] 。综合表 1 中的测定结果及各藻株在大规模
培殖中的生产性状 ,确定以 PBP 含量最高的 Sp2CH 为
选育高产 PBP 新品系的出发株。
表 1 　9 株螺旋藻的藻胆蛋白含量比较( gΠ100g 干藻粉)
Table 1 　Comparison of phycobiliproteins contents in Spirulina platensis (gΠ100g dry powder)
株系
strains
藻蓝蛋白
phycocyanin , PC
别藻蓝蛋白
allophycocyanin , APC
藻胆蛋白
phycobiliproteins , PBP
PCΠAPC
Sp2NCS1 14186 ±0108 C 5109 ±0112 BC 19195 ±0120 C 2192 ±0105 AB
Sp2T 15122 ±0113 B 5130 ±0107 AB 20152 ±0120 B 2187 ±0101 B
Sp2YE15 15124 ±0117 B 5121 ±0116 B 20145 ±0106 B 2193 ±0112 AB
Sp2CH 16126 ±0112 A 5155 ±0118 A 21181 ±0130 A 2193 ±0107 AB
Sp2HUF01 14132 ±0107 D 4170 ±0102 D 19102 ±0106 D 3105 ±0102 AB
Sp2IDF 10174 ±0106 G 3167 ±0105 F 14141 ±0107 G 2193 ±0104 AB
Sp2WSY 13183 ±0104 E 4153 ±0103 D 18136 ±0105 E 3105 ±0102 A
Sp2JFR 14158 ±0110 CD 4181 ±0106 CD 19139 ±0105 D 3103 ±0106 AB
Sp2CSH 12141 ±0119 F 4119 ±0104 E 16160 ±0121 F 2196 ±0104 AB
　　注 :同一列中不同字母表示差异达到显著水平 (0105) 。
Note :Different letters in the same column mean significat difference at 0. 05 level .
图 1 　Sp2CH32 及其亲本 Sp2CH的显微形态特征
Fig. 1 　The morphological characteristic of mutant Sp2CH32 and its parent Sp2CH
A :Sp2CH( ×10) ;B :Sp2CH single cells or spheroplasts( ×4000) ;C :Sp2CH32 ( ×1000)
212 　高产 PBP 新品系的选育及工厂化培殖试验
将处于对数生长期的 Sp2CH(图 12A) 藻丝体用组
织匀浆法制备成单细胞或原生质球 (图 12B) ,经 016 %
的 EMS 和 214 kGy 的60 Coγ射线复合诱变处理后 ,涂到
预先配置好的无菌琼脂固体培养基上进行培养 ;对长
出的藻落进行显微形态观察及藻丝单体分离与培养
后 ,分别测定各候选株的 PC、APC和 PBP 含量。经过 2
年多的实验室、小试、中试及生产性培殖试验 ,于 2004
年选育出 1 株 PC、APC和 PBP 含量依次比其出发品系
Sp2CH约高 36 %、89 %和 50 %的突变株 ,因其在藻丝单
体分离培养过程中的编号为 32 ,故命名为 Sp2CH32 (图 12C) 。为进一步考察 Sp2CH32 在工厂化生产中的遗传稳定性和生产性状 ,从 2004 年 8 月至 2006 年 11月对 Sp2CH32 作了 9 个批次工厂化培殖 ,并测定了各批次的 PC、APC 和 PBP 含量 , 其平均值依次为22105 %、11149 %和 32154 %(表 2) 。如图 1 所示 ,Sp2CH 藻丝一般为 2～4 个螺旋 ,长度 150～200μm。与大多数蓝藻一样 ,螺旋藻细胞外层具鞘 ,细胞壁由 4 层构成、呈革兰氏阴性菌的典型结构。因其细胞结构的特殊性 ,很难制得如高等植物细胞壁被完全除净的原生质体 ,而只能得到残有部分细胞壁、类似于原生质体的原生质球[15 ] 。图 1 中呈方形
965　6 期 高藻胆蛋白钝顶螺旋藻新品系的选育及 RAPD 分析
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表 2 　Sp2CH32 在工厂化养殖中不同采收批次的
藻胆蛋白含量( gΠ100g 干藻粉)
Table 2 　Phycobiliproteins contents of Sp2CH32 in
mass cultivation (gΠ100g dry powder)
采收时间
time of harvest
藻蓝蛋白
Phycocyanin ,
PC
别藻蓝蛋白
allophyco2
cyanin ,APC
藻胆蛋白
phycobilipr2
oteins ,PBP
PCΠAPC
2004 - 08 - 23 21136 10120 31157 2109
2004 - 09 - 17 20121 9167 29187 2109
2004 - 10 - 06 22176 10146 33122 2118
2004 - 10 - 27 21156 9198 31154 2116
2005 - 04 - 18 22134 10117 32151 2120
2005 - 05 - 13 23152 12130 35182 1191
2005 - 07 - 17 20185 9174 30159 2114
2006 - 06 - 24 23104 11169 34173 1197
2006 - 11 - 23 22177 10121 32198 2123
平均值 average 22105 10149 32154 2111
的为 Sp2CH的单细胞 ,圆或椭圆形的为原生质球 (图 12
B) 。螺旋藻完整藻丝体具有很强的抗辐射能力 ,而当
制备成单细胞或原生质球后 ,辐射敏感性即显著提高 ,
有利于诱变处理及突变体筛选[10 ,16 ] 。因尚未确立与螺
旋藻高 PBP 含量相关、可用作目标突变体选择压力的
因子 ,本实验室经 2 年多的试验 ,根据藻丝与细胞形态
及色泽等表观特性 ,结合繁重的单藻丝体克隆培养及
PBP等生理生化指标检测 ,获得了目标突变体。Sp2
CH32 的藻丝呈 5～7 个螺旋 ,长度 400～600μm ,为其亲
本 Sp2CH的 2～3 倍 ,极大地克服了 Sp2CH在工厂化培
殖中因藻体较难快速过滤采收而影响品质和产量的问
题。由表 2 可知 ,Sp2CH32 在 3 年多的工厂化养殖中 ,
PBP 的含量虽也会受生长温度和营养状况等诸多因素
影响 ,但在全年的生产周期内 (冬季因气温低一般停
产)均能保持在 30 %左右 ,比 Sp2CH 等普通藻株高约
50 %。值得进一步指出的是 ,Sp2CH32 中 PC 和 APC 含
量与 Sp2CH等相比 ,虽均有大幅度提高 ,但 APC 的增
幅是 PC 的近 215 倍 ,这也就导致了表 2 中 Sp2CH32 9
个批次的 PCΠAPC 为 1191～2123 ,平均值为 2111 ,比表
1 中 Sp2CH等藻株减小了近 30 %。事实上 ,不管是实
验室还是工厂化培养中 ,Sp2CH32 藻体和藻粉的色泽
均比 Sp2CH 等藻株的更显墨绿色 ,这与 Sp2CH32 中
PBP 含量大幅度提高 ,特别是 APC 含量大幅度提高密
切相关。前面已讨论过 ,一般情况下 ,大多数藻株 PBP
结构及 PC 和 APC 比例非常稳定[3 ,5 ,6 ] ,Sp2CH32 中 PC
和 APC含量的大幅度提高及其比例的显著变化 ,是否
会引起 PBP 及由其装配成的藻胆体的结构 ,其在光合
作用中电子传递等方面的功能是否会发生相应变化等
问题 ,目前正在研究之中。
213 　Sp2CH32 的 RAPD 分析
以 Sp2CH32 及其亲本 Sp2CH 的基因组 DNA 为模
板 ,李晋楠等[13 ]筛选出的 23 条对螺旋藻 DNA 作 PCR
具清晰电泳条带、明显多态性的 102mer 寡核苷酸为随
机引物 , 进行 RAPD ( Randomly Amplified Polymorphic
DNA ,随机扩增多态性 DNA) 分析 ,以检测 Sp2CH32 与
Sp2CH在分子遗传水平的差异性。如图 2 所示 ,除 S38
扩增产物的电泳图谱中 Sp2CH32 比 Sp2CH多了 2 条约
700 和 1470 bp 的条带 ,S65、S78、S58 和 S53 等其他 22
条引物对 Sp2CH32 和 Sp2CH扩增的电泳条带均相同。
RAPD 技术可以简便、灵敏地检测基因组 DNA 的
多态性 ,已广泛应用于包括螺旋藻在内的许多生物的
分子标记与鉴定及分类学研究[13 ,17 ] 。虽有学者指出
RAPD 方法的灵敏度高而重复性较差 ,但我们经多次
重复试验表明 ,RAPD 结果的重复性主要与试验条件
和操作者熟练程度等有关。只要操作熟练 ,保持反应
条件、反应体系所用的试剂来源和浓度一致 ,并确保反
应程序中各环节和各参数的稳定性 ,重复的结果是不
难得到的。此外 ,对试验中可能出现的假阳性条带给
统计分析带来干扰的问题 ,可通过设置阴性对照 (图
2) 、改善反应条件或增大样本分析数目等方法来解决。
图 2 　Sp2CH32 与其亲本 Sp2CH的 RAPD 电泳图谱
Fig. 2 　RAPD electrophoresis map of Sp2CH32
and Sp2CH
M:DNA marker ;1 :Sp2CH32 ;2 :Sp2CH;CK:control
本实验室已将 RAPD 技术成功用于螺旋藻的种质
鉴定与分类学研究[13 ] 。图 2 中 23 条有效引物对 Sp2
CH32 和 Sp2CH进行扩增时仅 1 条有显著的多态性差
异 ,而其他的则完全一致 ,既反映了 Sp2CH32 和 Sp2CH
分子遗传背景的高度统一性 ,又表明 Sp2CH32 确为 Sp2
CH在 DNA 水平发生变异的突变体。目前本实验室正
从上述 RAPD 差异条带序列分析及相关基因克隆等方
面开展研究 ,以明确 Sp2CH32 突变位点并阐明其 PBP
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高产及 PCΠAPC发生巨变的分子机理。
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关于离子辐射生物效应研究中的几个物理量的说明
近年来离子 (或粒子)辐射育种的研究报道逐渐增多 ,但在一些来稿中 ,我们发现有些作者在有关物理量的表
述上常混淆概念 ,故请我刊审稿专家唐掌雄老师对这几个主要物理量作以下说明 :
1. 剂量 D(dose) :现在常采用剂量代表吸收剂量 (absorber dose) 。辐射授与单位质量物质的平均能量称作吸
收剂量 ,其单位为戈瑞 ( Gy) 。生物体接受辐射引起的生物效应变化与吸收剂量有着紧密的相关性。γ辐照、电子
束辐照和离子辐照的吸收剂量单位均用 Gy。
2. 粒子辐射的能量 :单位为兆电子伏 (MeV)或兆电子伏Π核 (MeVΠu) 。例 :加速能量为 220 MeV 的12 C 粒子 ,也
可以除以 12 ,用 1813 MeVΠu 12 C粒子来表示。
3. 粒子注量Φ(fluence) :单位截面球体内的粒子量称作粒子注量 ,其单位为“粒子数Πcm2”,在过去也被称为
流量或通量。注量有时会被误标为剂量。
4. 传能线密度LET(liener energy fransfer) :其单位为千电子伏Π微米 (keVΠμm) 。LET是带电粒子局部授与物体
的能量 ,它在介质中单位长度路径由于碰撞而造成的能量损失也可称作阻止本领 ,它与带电粒子的能量、电荷和
物质的密度等相关。
5. 吸收剂量与LET的关系 :粒子 (或离子) 辐照物体时其吸收剂量 (D) 与粒子的 LET ,粒子的注量 (Φ) 和物质
密度 (ρ)有关 ,公式如下
D = (116 ×10 - 9 ) ×LET ×Φ ×1Πρ
例 :能量同为 10 MeVΠu 的质子 (1 P) 、12 C和16O 离子的LET分别为 416、162 和 290 keVΠμm ,在相同的注量时 ,它们与
物体的相互作用产生的吸收剂量相差甚大 ,而引起的生物效应也有很大的差异。
《核农学报》编辑部
175Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (6) :567～571
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