全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 052336204
辐照对青菜芽再生及转化频率的影响
范正琪1 ,2 　崔海瑞1 3
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江杭州　310029 ; 　21 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江富阳　311400)
摘 　要 :以青菜带柄的子叶为外植体 ,在 MS 培养基上附加 5mgΠL 62BA、015mgΠL NAA 和 5mgΠL
AgNO3 ,能使再生频率明显提高。无菌苗和处理中的外植体经过 1～215Gy 的γ射线低剂量辐
照处理后 ,都能促进不定芽的再生 ,10Gy 以上再生频率急剧降低。在共培养期经 1～715Gy 的
低剂量辐照后 , gus 基因瞬时表达频率提高 ,但预培养期间进行辐照没有明显效果。
关键词 :青菜 ;再生 ;转化 ;辐照
EFFECTS OF IRRADIATION TREATMENT ON SHOOT REGENERATION AND TRANSFORMATION
FREQUENCY OF CHINESE CABBAGE( Brassica campestris SSP . Chinensis L)
FAN Zheng2qi1 ,2 　CUI Hai2rui1
(11 Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 　310029 ;
2. Research Institute of Subtropical Forestry , China Forestry Academy , Fuyang , Zhejiang , 　311400)
Abstract :Cotyledons with petiole were cultured on MS basic medium containing 5mgΠL BA , 015mgΠL NAA , 5mgΠL
AgNO3 , and produced adventitious buds with higher frequency. Induction frequency of adventitious buds could be
increased by irradiation treatment ofγ2rays with the lower dose of 1～215Gy to seedlings and explants in culture ,
but decreased dramatically when the dose was higher than 10 Gy. Irradiation treatment in co2culture with lower dose
of 1～715 Gy also promote transient expression frequency of gus gene , while irradiation treatment in pre2culture did
not show obvious effect on transient expression of gus gene.
Key words :Chinese cabbage ; regeneration ; transformation ; irradiation
收稿日期 :2002207201
基金项目 :国家科技部九五重点科技攻关 (962015201)和合肥市政府专项资助项目 ( I20106)
作者简介 :范正琪 (1976～) ,女 ,浙江桐乡人 ,硕士研究生 ,主要从事植物生物技术研究。3 通讯作者青菜 ( Brassica campestris SSp. chinensis L. )俗称小白菜 ,十字花科芸薹属植物 ,是我国重要的食叶蔬菜之一。长期以来 ,造成青菜严重减产的原因之一就是虫害的经常发生。培育抗虫品种是解决这一问题的根本途径 ,利用转基因技术培育的玉米、棉花、马铃薯已实现商品化。目前 ,在所有转基因技术中 ,农杆菌介导法是最为成熟、应用最广泛的方法。我们试图通过农杆菌介导法将 Bt 杀虫晶体蛋白基因导入青菜。对于青菜的离体再生和农杆菌介导转化研究 ,已取得了一定的进展[1 ] ,但普遍存在着再生频率和转化频率较低的现象[2～5 ] 。所以 ,为了提高获得转基因青菜的效率 ,有必要对其再生体系和转化体系进行改进。为此 ,我们采用γ射线对青菜无菌苗和培养中的外植体进行辐照 ,以期提高其再生频率和转化效率。
633　 核 农 学 报　2003 ,17 (5) :336～339Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
1 　材料与方法
111 　材料
供试青菜品种为矮抗青、上海青、苏州青 ,从杭州市良种引进公司采购。
112 　方法
11211 　无菌苗的培养 　将参试青菜种子用 70 %酒精表面消毒 ,用 011 %升汞灭菌 15～20min ,经无菌水
彻底漂洗后接种在不加激素的 1Π2MS 培养基上 ,于 25 ℃、16h 光照Π8h 黑暗下培养。
11212 　分化培养基的选择 　取 4d 左右的无菌苗 ,切下带柄的子叶 ,将基部插入到培养基中 ,培养基为
各种不同激素配比、不同 AgNO3 浓度 ,从中选择再生频率最高的培养基。
11213 　农杆菌菌株与转化 　所用农杆菌菌株为 EHA105 ,携带的质粒为 p KUB ,该质粒上有卡那霉素抗
性基因 kan、潮酶素抗性基因 hpt、报告基因 gus 和杀虫晶体蛋白质基因 cry1Ab。离心收集活化培养的
菌液 ,重新悬浮于添加 100μM AS(乙酰丁香酮) 和 50mgΠL 潮霉素的 MS 液体培养基 (pH516) 至 OD600 约
015 ,然后将预培养 3～4d 的子叶浸泡于此菌液中 10～15min ,取出多余菌液 ,接种于添加 AS 100μM 和激
素的 MS 固体培养基上 ,共培养 3d 后按 Jefferson 等[6 ]的方法进行 gus 活性检测 ,以叶柄染为蓝色的个体
数占处理总数的百分数表示转化率。
11214 　γ射线辐照处理 　为考察60 Coγ射线处理对再生的影响 ,采用了两种处理方式 :一种是对种子萌
发 3d 的无菌苗进行处理 ,第 2d 切下带柄的子叶接入培养基 ;另一种是先把培养 4d 的无菌苗的带柄子
叶切下 ,接种到培养基后再进行辐射处理。两种处理方式所用辐照剂量设置相同 ,均为 1、215、5、715、
10、15、25、50、75、100 和 150Gy。
在研究γ射线处理对转化率的影响时 ,也采用了两种处理方式 ,一种是对预培养 3d 的外植体辐照 ,
另一种则是对共培养当天的外植体辐照 ,处理时所用剂量均同上。
2 　结果与分析
211 　青菜再生体系的建立
在诱导不定芽的过程中 ,培养基中外加的植物激素起着关键的作用。本实验采用 62BA 和 NAA 两
种激素 ,并对它们的配比进行了测验。培养基中不加任何激素时 ,不定芽的再生频率很低 ,而随着 62BA
浓度的增加 ,不定芽的再生频率也相应提高。62BA 与 NAA 的配合使用更能促进不定芽的再生 ,当 62BA
为 5mgΠL、NAA 为 015mgΠL 时 ,所用的 3 个基因型矮抗青、苏州青和上海青的不定芽再生频率均达到最
高 ,分别为 21 %、24 %和 19 %。
在确定了激素及其配比的基础上 ,对添加 AgNO3 的效应进行了研究。当 AgNO3 浓度在 5mgΠL 以下
时 ,3 个供试基因型的不定芽再生频率都随着 AgNO3 浓度升高而提高。当 AgNO3 浓度达到 5mgΠL 时 ,3
个材料的再生频率都达到最高 ,苏州青提高到 66 % ,上海青提高到 47 % ,矮抗青提高到 53 %。可见 ,添
加适当浓度的 AgNO3 对青菜不定芽的再生具有明显的促进作用 ,这与其它文献报道的结果是一致
的[7 ,8 ] 。
213 　辐照对青菜离体再生的影响
从试验结果看来 ,辐射处理对青菜的离体再生有明显的影响。对照的子叶再生频率较低 ,只有
5417 %。然而经过辐照处理后 ,不管是处理无菌苗还是处理培养中的外植体 ,再生频率都有变化 (图
1) 。低剂量 (1～5Gy)处理对再生的促进效果最为明显 ,剂量高于 5Gy 时 ,再生频率逐渐降低 ,剂量达到
25Gy 以上基本没有不定芽的发生 ,甚至开始褐化死亡。对无菌苗进行辐射处理时 ,剂量为 215Gy 时再
生频率最高 ,达 6913 % ;对培养中的带柄子叶进行处理 ,则剂量为 1Gy 时效果最好 ,再生频率为 6817 %。
相对而言 ,处理培养的外植体效果略优于处理无菌苗。该试验的结果说明 ,在进行青菜的组织培养时 ,
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辅以低剂量的γ射线处理可以提高再生频率。
图 1 　辐照对不定芽诱导频率的影响
Fig. 1 　Effect of irradiation on induction frequency of adventitious buds
214 　辐射处理对 gus 瞬时表达频率的影响
子叶与农杆菌共培养后 ,不经过辐射处理的 gus 瞬时表达频率有 56 %。在预培养期间进行辐射处
理 ,剂量在 1～5Gy 时 , gus 瞬时表达频率比对照降低 ,但有上升的趋势 ;剂量达到 715Gy 时 ,与对照持平 ;
除 15Gy 外 ,在 10、25、150Gy 时比对照稍高 ,其余都能保持 50 %的表达频率。对共培养时期的子叶进行
辐射处理 ,剂量低于 715Gy 瞬时表达频率比对照略高 ,最高是 215Gy 的 63 %。但超过 10Gy 后表达频率
急剧降低 (图 2) 。两个阶段的处理在剂量超过 25Gy 之后子叶柄切口处都出现褐化现象 ,剂量提高褐化
更严重。
图 2 　辐照对 gus 基因瞬间表达频率的影响
Fig. 2 　Effect of irradiation on transient expression frequency of gus gene
该试验的结果表明 ,两种处理方式的效果不同 ,预培养阶段的处理效果不明显 ,而共培养期处理的
效果较好 ,适宜的剂量为 215Gy 左右。
3 　讨论
62BA 与 NAA 配合使用下都能产生不定芽 ,其中最适合的是培养基附加 5mgΠL 的 62BA 与 015mgΠL
的 NAA。由于 AgNO3 能干扰乙烯对组织产生的生长抑制作用[7 ,8 ,9 ] ,在此基础上添加 5mgΠLAgNO3 更能
促进不定芽的再生。
辐射处理与组织培养相结合已形成了植物离体诱变的技术 ,但这方面的研究一般都用于获得突变
体[10 ,11 ] 。目前 ,在青菜中还没有将组织培养与辐射处理相结合的研究报道。本研究首次采用γ射线处
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理无菌苗或培养中的外植体 ,结果表明 ,低剂量 (215Gy) 处理可以提高青菜带柄子叶的再生频率。这可
能与低剂量的射线处理刺激了细胞的分生能力有关。对于青菜这种再生频率较低或者是再生相对困难
的植物来说 ,低剂量的辐射处理则可以作为提高再生频率的一个辅助手段。
作为植物育种工作的一个重要辅助手段 ———诱变技术 ,特别是其中的核技术 ,如何为更好地与生物
技术紧密结合起来 ,是当今和今后需要进一步研究的课题。Kohler 等[12 ]曾报道 ,利用低剂量的 X射线处
理烟草、矮牵牛、菜豆和黑芥等的原生质体 ,可使转化频率提高 6～7 倍。本试验采用低剂量γ射线进行
了两种不同方式的处理 ,发现在共培养时处理可以提高 gus 瞬时表达的频率。刘智宏等[13 ] 也报道 ,在
大豆的基因枪介导转化中 ,辅以 5Gy 的γ辐射处理可以明显提高抗性愈伤组织数。这些结果都表明 ,在
不同的转化方法中 ,采用低剂量的辐射处理均可以提高转化的成功率。因此 ,在青菜的遗传转化中 ,可
以将其作为提高转化频率的一个途径。尽管目前青菜的遗传转化中尚没有这方面的报道 ,但本研究的
结果就是一个很好的证明。
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