全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 052502204
62BA 对大豆子叶节再生的影响
李文霞1 　宁海龙2 　李文滨2 　吕文河1
(11 东北农业大学农学院 ,黑龙江 哈尔滨　150030 ; 21 东北农业大学大豆研究所 ,国家教育部大豆生物学重点试验室 ,黑龙江 哈尔滨　150030)
摘 　要 :以大豆品种黑农 35 的子叶节为材料 ,研究 62BA 对子叶节再生三个阶段即无菌苗萌发、丛生芽诱
导、丛生芽伸长的影响。结果表明 :添加 1mgΠL 62BA 的萌发培养基上萌发的无菌苗适合作为外植体的
来源 ;丛生芽诱导培养基中 62BA 的最适浓度为 117mgΠL ;丛生芽伸长的四因素正交试验表明丛生芽诱导
阶段的继代培养基中降低 62BA 的浓度对其伸长的影响效应最大 ,水平为继代培养基中 0134mgΠL 62BA
浓度 ,为原来的 1Π5。
关键词 :大豆 ;子叶节 ;62BA ;丛生芽 ;再生系统
EFFECT OF 62BA ON REGENERATION OF SOYBEAN COTYLEDONARY NODE
LI Wen2xia1 　NING hai2long2 　LI Wen2bin2 　LU Wen2he1
(11 College of Agrionomy , Northeast Agricultural University , Harbin , Heilongjiang 　150030 ; 21Soybean Research Institute ,
Northeast Agricultural University , Key Laboratory of Soybean Biology in Chinese Ministry of Education , Harbing , Heilongjiang 　150030)
Abstract :Effect of 62BA on regeneration of cotyledonary node including germination of seedlings , multiple shoots induction
and shoots elongation from soybean cultivars“heinong 35”were studied. The results indicated that germinate seedlings which
addition of 110mgΠL 62BA to germination medium were suitable as explants. The optimal concentration of 62BA in multiple
shoots induction medium was 117mgΠL. Orthogonal design showed that decreasing. the concentration of 62BA in subculture
shoots medium had biggest effect on shoots elongation. And concentration of 62BA in subculture medium for shoot induction
was dropped to 1Π5 of the preceding shoot induction medium.
Key words :soybean ; cotyledonary node ; 62BA ; multiple shoots ; regeneration systems
收稿日期 :2007201213
基金项目 :黑龙江省科技攻关项目“大豆、马铃薯抗病和抗虫基因工程的研究”( GB04B101)
作者简介 :李文霞 (19742) ,女 ,黑龙江人 ,讲师 ,博士 ,研究方向为植物分子生物学。E2mail :wxlee2006 @yahoo. com. cn
宁海龙 (19752) ,男 ,黑龙江人 ,副教授 ,博士 ,研究方向为大豆遗传育种研究。E2mail :ninghailong1975 @1631com
李文霞和宁海龙对本研究有同等贡献。
通讯作者 :李文滨 ,E2mail :wenbinli @yahoo. com ;吕文河 ,E2mail :whlu @mail . neau. edu. cn　　建立良好的再生系统是实现基因转化的先决条件 ,关系到基因转化的成败[1 ,2 ] 。大豆再生系统已有较多报道 ,如大豆体细胞胚发生再生系统[3 ,4 ] ,大豆不定芽器官发生再生系统和原生质体再生系统[5 ,6 ] 。相对于其他再生系统 ,大豆子叶节系统获得再生植株的时间短、不可育的再生植株少、外植体来源不受时间限制[7 ,8 ] ,并且其外植体内已存在的分生组织和有分化潜力的表皮、亚表皮细胞都可作为遗传转化的靶组织[9 ] ,因此子叶节做为外植体被认为再生效果最好[10 ] 。目前大豆的再生频率依然较低 ,是制约大豆转化的主要原因之一 ,影响再生频率的许多因素仍需深入探讨。 王萍等[11～13 ]对大豆子叶节丛生芽形成的因素 ,特别是激素对丛生芽诱导的影响进行了研究 ,但关于 62BA 对无菌苗萌发和丛生芽伸长的影响研究很少。子叶节丛生芽再生系统受基因型的限制[7 ,14 ] ,笔者在建立大豆子叶节再生系统时筛选了 22 个大豆基因型 ,对分化率高的基因型进行易感性鉴定 ,发现黑农35 不仅丛生芽分化率高 ,而且对农杆菌具有高度的易感性。Lazzeri 等[15 ]提出在丛生芽诱导培养基中添加 1～3 mgΠL 62BA ,加或不加 IBA ,可用于多种基因型大豆的培养。因此本研究采用黑农 35 为试验材料。
205　 核 农 学 报　2007 ,21 (5) :502～505Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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1 　材料与方法
111 　材料
11111 　植物材料 　大豆品种黑农 35 ,由东北农业大学
大豆研究所提供。
11112 　培养基 　萌发基本培养基和丛生芽诱导基本
培养基 :B5 盐 ,MS 铁盐 ,B5 有机 ,3 %蔗糖 ,018 %琼脂
粉 ,pH 518 ;继代芽诱导培养基 :62BA 浓度降为 0185、
0134 和 0117mgΠL ,其他同丛生芽诱导培养基 ;丛生芽
伸长基本培养基 :MS 盐 ,MS 铁盐 ,B5 有机 , 011mgΠL
IAA ,10mgΠL 硝酸银 ,3 %蔗糖 ,018 %琼脂粉 ,pH 518。
112 　方法
11211 　无菌苗的萌发 　挑选健康无病害的大豆种子
进行氯气消毒处理后 ,接种于萌发培养基上 ,62BA 设 0
和 110mgΠL 两个浓度 ,3 次重复 ,取萌发 5～7d 的无菌
苗 ,将两片子叶从子叶节处纵向切开 ,用解剖刀切去萌
发的顶芽和侧芽 ,每粒种子获得两个子叶节外植体 ,外
植体诱导 14d 后统计每个处理的分化率和芽数。
11212 　丛生芽的诱导 　将子叶节按近轴面朝上插入
芽诱导培养基中 ,培养基中添加的 62BA 设为 115、116、
117、118、119、210mgΠL 6 个浓度梯度 ,3 次重复 ,14d 后
统计每个处理的分化率和每个外植体的芽数。
11213 　丛生芽的伸长 　待丛生芽可见时 ,将外植体转
入芽伸长培养基中 ,对影响丛生芽伸长的主要因素继
代芽诱导培养基中 62BA 浓度 (A) 、芽伸长培养基中谷
氨酸 ( Glu)浓度 (B) 、芽伸长培养基中 GA3 浓度 (C) 、芽
伸长培养基中玉米素 ( ZT) 浓度 (D) 及 3 个水平进行
L9 34 正交试验 ,各因素的水平见表 1。转接时切去子
叶以及下胚轴基部的老化组织 ,每 10d 继代 1 次。
表 1 　影响丛生芽伸长的因素水平表
Table 1 　Factors and levels influencing
multiple shoots elongation (mgΠL)
水平
levels
继代芽诱导
培养基中 62
BA 浓度
(A 因素)
62BA in 2nd
SIM(A factor)
芽伸长培养基
中 Glu 浓度
(B 因素)
Glu in SEM
(B factor)
芽伸长培养基
中 GA3 浓度
(C因素)
GA3 in SEM
(C factor)
芽伸长培养基
中 ZT浓度
(D 因素)
ZT in SEM
(D factor)
1 0185 0 010 015
2 0134 50 015 110
3 0117 100 110 115
Note: SIM means Shoots Induction Medium ; SEM means Shoots Elongation
Medium
11214 　统计分析方法 　使用软件 SAS 812 对试验数
据进行分析。
2 　结果与分析
211 　萌发培养基中 62BA 对丛生芽分化的影响
由图 1 可见 ,添加 62BA 的萌发培养基上萌发的无
菌苗子叶节区及下胚轴相对粗大 ,比较幼嫩 ,与未添加
62BA 的相比 ,同样苗龄没有须根的出现 ,顶芽也没有
延伸到超过子叶的长度。图 2 为添加 62BA 的萌发培
养基上萌发的无菌苗获得的大豆子叶节诱导的丛生
芽 ,可见 ,这样的无菌苗子叶节处分生细胞生长旺盛 ,
适合作为外植体的来源。从表 2 可以看出 ,添加 62BA
的萌发培养基分化率显著高于未添加 62BA ,并能提高
每个外植体的芽数从 3109 到 5176 个。
图 1 　62BA 对无菌苗萌发的外观影响
Fig. 1 　Appearance effect of 62BA on
germination of seedling
A 和 B 分别为添加 0 和 110 mgΠl 62BA 的
萌发培养基上萌发的无菌苗
A and B show the seedlings from germination medium with out
addition of 0 and 110 mgΠL 62BA , respectively
图 2 　大豆子叶节在添加 1. 0mgΠL 62BA培养基上诱导的丛生芽
Fig. 2 　Multiple shoots induced in soybean cotyledonary
node at 1. 0mgΠL 62BA germination medium
212 　62BA 浓度对子叶节丛生芽分化的影响
从表 3 可以看出 ,随 62BA 浓度提高 ,丛生芽分化
率略有提高 ,每个外植体的出芽数则显著提高。分化
率差异不显著 ,说明这个浓度范围适合丛生芽分化。
丛生芽之间有相互抑制作用 ,在伸长阶段并不是所有
的丛生芽都能够伸长 ,本研究发现 ,在 62BA 浓度为
305　5 期 62BA 对大豆子叶节再生的影响
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　　　　 表 2 　萌发培养基中 62BA 对丛生芽分化的影响
Table 2 　Effect of 62BA at germination medium on the differentiation of multiple shoots
62BA 浓度
62BA concentration
(mgΠL) 接种外植体数 (个)No. of total explants 分化率differentiation rate ( %) 芽数Π外植体 (个)No. of shootsΠexplantⅠ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均 mean Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均 mean
0 30 30 31 4617 6010 5418 5318 ±6170b 3117 2176 3134 3109 ±0130b
110 29 28 30 8612 9219 9010 8917 ±3136 a 5132 5169 6127 5176 ±0148a
注 : Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代表重复 ;不同小写字母代表 5 %的显著水平差异 ,多重比较采用新复极差法。下同。
Note : Ⅰ, Ⅱ、Ⅲmeans replicates ; the same small letter means significant difference at 5 % level by LSR ; The same as following tables.
表 3 　62BA 浓度对子叶节丛生芽分化的影响
Table 3 　The influence of concentration of 62BA on the differentiation of multiple shoots
62BA 浓度
62BA
(mgΠL) 接种外植体数 (个)No. of total explants 分化率differentiation rate ( %) 芽数Π外植体No. of shootsΠexplantⅠ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均 mean Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均 mean
115 29 28 30 8612 9219 9010 8917 ±3136 a 5132 5169 6127 5176 ±0148 d
116 30 30 30 8617 9010 9617 9111 ±5110 a 5163 6111 6106 5193 ±0126 cd
117 30 31 30 9617 9315 8617 9213 ±5111 a 6147 6118 5198 6121 ±0125 cd
118 30 30 29 9010 9313 9616 9313 ±3130 a 7119 617 6145 6178 ±0138 bc
119 27 30 30 9216 9617 9313 9412 ±2119 a 8113 6187 6175 7125 ±0176 b
210 30 30 30 9617 9617 9313 9516 ±1196 a 8178 8143 7172 8131 ±0154 a
117mgΠL 时 ,有 4～6 个伸长的丛生芽生长较为健壮 (图
3) 。基于此 ,确定丛生芽诱导培养基中 62BA 最适浓度
为 117mgΠL。
213 　影响丛生芽伸长的几个主要因子的正交试验
图 3 为在丛生芽伸长培养基上 ,丛生芽被诱导伸
长。影响丛生芽伸长的各因素分析见表 4。由表 4 可
见 ,A、B、C、D 各因素的 F 值均达到显著水平 ,说明这四
个因素对丛生芽伸长都有很强的效应 ,此外 ,四因素中
F 值 A > C > D > B ,说明丛生芽诱导阶段的继代培养基
中降低 62BA 的浓度对丛生芽伸长的影响效应最大。
表 4 　丛生芽伸长的主要因子对丛生芽伸长影响的方差分析
Table 4 　Analysis of variance for four factors that affect
the elongation of multiple shoots
变异来源 source DF SS MS F
A 2 4321143 2160172 1658131 3
B 2 50106 25103 19121 3
C 2 1786156 893128 685158 3
D 2 116138 58119 44166 3
误差 error 18 23145 1130
总变异 total variation 26 6297188
注 : DF 代表自由度 ,SS代表平方和 ,MS代表方差 ,F 代表 F 测验 ; 3 代表
5 %的差异显著水平。A、B、C、D 同表 1。下表同。
Note :DF means degree of freedom , SS means sum of squares , MS means mean
square , F means F2test , 3 means significant difference at 5 %. A、B、C、D are
same as Table 11The same as following Table.
　　A 因素 62BA 浓度的不同水平对丛生芽伸长的影
响见表 5。由表 5 可见 ,将 62BA 的浓度降为丛生芽诱
导培养基中 62BA 浓度的 1Π5 ,即 0134mgΠL 时 ,丛生芽
的伸长显著高于其他两个水平 ,因此 0134mgΠL 的 62BA
最适合丛生芽伸长。
图 3 　丛生芽的伸长
Fig. 3 　Shoot elongated in shoot elongation medium
表 5 　A 因素不同水平对丛生芽伸长率的影响
Table 5 　Effect of different levels of A factor on
percentage of multiple shoots elongation
水平 level A
1 22111 c
2 53100 a
3 35140 b
注 :水平 1、2、3 同表 1。
Note :level 1 ,2 ,3 are same as Table 11
3 　讨论
本研究探讨了 62BA 对大豆子叶节再生系统不同
阶段的影响 ,以平衡激素 62BA 与植株再生的关系 ,为
建立高效稳定的大豆子叶节再生系统提供依据。
405 核　农　学　报 21 卷
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62BA 被认为可刺激子叶节内源分裂素的产生 ,促
使分生组织分裂并打破顶端优势 ,促使子叶节膨大及
不定芽的形成。由于不定芽多数为多细胞起源 ,形成
嵌合体的苗最大可能是来自原有腋芽的分生组织区即
由原来芽的芽原基组织增生而来 ,农杆菌侵染转化的
就是这些已有雏形的芽组织 ,所以 ,不可避免会形成嵌
合体转化[16 ] 。要使转化开始于可形成芽的单细胞 ,就
要在侵染之前 ,为转化提供较多的分生细胞。大豆子
叶节再生的报道较多 ,但关于种子萌发阶段的培养条
件对子叶节出芽的影响研究较少[17 ] 。本研究发现添
加 62BA 的萌发培养基上萌发的无菌苗比较幼嫩 ,这是
因为细胞分裂素 62BA 刺激子叶节处潜在的分生细胞 ,
使其不断分裂并打破顶端优势 ,因此子叶节区居间分
生组织旺盛生长 ,促使子叶节膨大增粗及以后不定芽
的形成 ,对丛生芽分化有明显的促进作用。
62BA 浓度的高低极大地影响分化率和每个外植
体的芽数[7 ,14 ,18 ] 。继Lazzeri 等[15 ]将丛生芽诱导培养基
中 62BA 浓度确定为 1～3mgΠL 以后 ,许多研究者对生
芽诱导培养基中 62BA 浓度进行了探讨 ,本研究借鉴了
有关报道[19 ,20 ] 的成熟条件 , 将 62BA 浓度在 115 ～
210mgΠL 之间进行细分。从理论上讲 ,62BA 浓度越高 ,
分化率越高 ,每个外植体的丛生芽数越多 ,再生率及转
化率也就越高。但丛生芽之间的保护相互抑制作用导
致丛生芽不易伸长 ,叶片生长一段时间就发黄、脱落。
实际遗传转化操作时 ,连续的分割外植体会造成抗生
素对切口的极大伤害 ,从而褐化死亡。刘莉等[21 ] 认为
一般以丛生芽数少于 5 个为宜 ,本研究发现 4～6 个伸
长的丛生芽生长较为健壮 ,因此 62BA 浓度并非越高越
好。本研究结合 62BA 对分化率和丛生芽数两方面的
影响确定最佳的 62BA 浓度为 117mgΠL。
大豆子叶节转化后丛生芽不抽茎长高 ,目前尚未
见到分析这一现象机理的深入报道。邱承祥等[22 ] 认
为从激素调节来看 ,子叶节培养中不同浓度的 62BA 影
响丛生芽的诱导率、不定芽的数量和芽的伸长。低浓
度的 62BA 有利于芽的伸长 ,但芽的数量少 ,丛生芽诱
导率低 ;高浓度的 62BA 可提高丛生芽诱导率 ,但诱导
的芽数量过多 ,生长慢 ,易黄化脱落。本研究在无菌苗
萌发阶段添加了 62BA ,子叶节外植体中该激素的积累
会对以后丛生芽的诱导和伸长产生影响。基于此 ,本
研究设计的正交试验将丛生芽诱导阶段中继代培养的
62BA 浓度作为一个因素 ,当其浓度降为原来的 1Π5 时 ,
丛生芽伸长率最高 ,这样在第 1 次丛生芽诱导培养基
中高浓度的 62BA 能够保证丛生芽诱导率和芽数量 ,继
代培养的低浓度 62BA 能够促进丛生芽伸长。本研究
将激素 62BA 对无菌苗萌发、丛生芽诱导、丛生芽伸长
三个阶段的影响作为一个整体进行试验设计 ,以平衡
激素 62BA 与植株再生的关系。
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