全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 022183205
用 ISSR 分析四川苎麻品种 (系)间的遗传关系及
雄性不育分子标记的建立
丁明忠1 　潘光堂1 　张中华2 　杨　燕2 　李立安2
(11 四川农业大学玉米研究所 , 四川 雅安　625014 ; 21 达州市农业科学研究所 ,四川 达州　635000)
摘　要 :本文从 100 条 ISSR 引物中筛选出 21 条引物 ,对 8 个四川苎麻品种 (系) 间的遗传关系进行了分
析。PCR 扩增结果表明 ,21 条引物在 8 份材料中共扩增出 86 条带 ,平均每条引物扩增出 411 条 , 其中
多态性位点 71 个 ,各引物扩增出的位点数 3～8 个不等 ,平均每条引物可以检测到 314 个多态性位点。
聚类分析和遗传距离分析结果表明 ,供试品种川 7、川 8 与其亲本遗传距离较远。3 个杂交品种 (川 7、川
8、川 9)均表现特有的偏父本遗传现象。此外 ,本研究用 ISSR 引物 U835 筛选到了 1 个雄性不育分子标
记 ,并将其扩增产物克隆测序 ,结果表明该序列大小为 658bp。根据该序列 ,此标记被转化成稳定的
SCAR 标记 ,可用于苎麻雄性不育分子标记辅助育种。
关键词 :苎麻 ;品种 (系) ; ISSR ;聚类分析 ;雄性不育分子标记
GENETIC RELATION ANALYSIS OF Boehmeria nivea CULTIVARS OR LINES FROM SICHUAN WITH ISSR
AND CONSTRUCTION OF THE MOLECULAR MARKERS LINKED TO MALE STERILE GENG
DING Ming2zhong1 　PAN Guang2tang1 　ZHANG Zhong2hua2 　YANG Yan2 　LI Li2an2
(11Maize Research Institute of Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan 　625014 ;
21 Dazhou City Agricultural Research Institute , Dazhou Sichuan 　635000)
Abstract :Inter2simple sequence repeat ( ISSR) is an effective molecular marker developed on the basis of microsatellite or
simple sequence repeat (SSR) . In this study 21 ISSR primers , which was screened from 100 ISSR primers , were used to
analyze and identify the relationship of 8 cultivars of Boehmeria nivea . PCR amplification showed that 86 clear and repeatable
bands were obtained , in which 71 bands appeared to be polymorphic (8215 %) . Genetic distance and cluster analysis
indicated that the genetic relationships between hybrids and their parents were not equal ,the male parent transfer more genetic
loci to their descendants , which indicated that hybrids inherited more genetic information from the male parent . In addition , a
specific DNA segment was amplified only in the fertile cultivars using the primer U835 , and the ISSR2marker was converted
into SCAR marker. Which could be used as a male sterile molecular marker2assisted selection of Boehmeria nivea breeding.
Key words : Boehmeria nivea ; cultivars (lines) ; ISSR ; cluster analysis ; molecular markers of male sterile gene
收稿日期 :2007207220 接受日期 :2007210216
基金项目 :国家 863 计划 (项目编号 :2004AA241210)项目资助
作者简介 :丁明忠 (19712) ,男 ,四川峨眉人 ,在职博士 ,研究方向为植物遗传与分子生物学。Tel :028285505452 ; E2mail :dingmzh @1631com
通讯作者 :潘光堂 (19562) ,男 ,重庆巴县人 ,博士 ,教授 ,研究方向为玉米育种与分子生物学。Tel :083522882714 ; E2mail :pangt @sicau. edu. cn　　苎麻 ( Boehmeria nivea) 为多年生宿根性草本植物 ,属荨麻科苎麻属 ,是我国主要的纺织纤维作物之一。随着人们对苎麻产品需求的扩大 ,苎麻的产量和品质受到更大的关注。上世纪末 ,我国在苎麻雄性不育杂种优势利用上取得重要的研究进展 ,选育出优质、高 产、分离变异小的杂交组合 ,并用于生产[1 ] 。近年来 ,张中华等[2 ,3 ]利用雄性不育系培育了一系列产量高、品质优的苎麻新品种 ,并在生产上大面积推广应用。长期以来 ,对苎麻品种资源的整理、雄性不育与杂种优势利用的研究主要是依据形态学特征、生育特性
381　核 农 学 报　2008 ,22 (2) :183～187Journal of Nuclear Agricultural Sciences
和经济性状等[4 ] 。也有学者将随机扩增多态性 DNA
(randomly amplified polymorphic DNA , RAPD) 、微卫星
DNA (microsatellite DNA , SSR) 等分子标记技术用于分
析苎麻品种间亲缘关系[5 ,6 ] ,但 RAPD 稳定性差 , SSR
多态性差。随后基于微卫星序列发展的简单重复序列
(inter2simple sequence repeat ,ISSR) 技术 ,因其具有重复
性好、多态性高、操作简便等优点 ,被广泛用于作物遗
传多样性研究、种质资源的鉴定和重要农艺基因的定
位与遗传作图上[7 ] ,但用于苎麻研究相对较少。本研
究在对苎麻雄性不育生理生化特性初步研究的基础
上[8 ] ,利用 ISSR 技术分析了四川部分苎麻品种及其亲
本的遗传关系 ,筛选并建立了 1 个雄性不育的分子标
记 ,旨在为品种的鉴定、保护和苎麻雄性不育分子标记
辅助育种提供理论指导。
1 　材料与方法
111 　试验材料
表 1 是用于本研究的 8 份苎麻材料的名称及来
源。其中 ,5 份即 B8、B16、C4、C13、C26 为苎麻品系 ,3
份即川苎 7 号 (川 7) 、川苎 8 号 (川 8) 、川苎 9 号 (川 9)
为苎麻品种。试验材料均为成熟植株的幼嫩叶片。
表 1 　供试材料
Table 1 　Materials in present paper
材料名称 来源
B8 湘苎 3 号自交一代选育
B16 江西白麻与大竹线麻杂交一代选育
C4
雄性不育资源材料 C19 与品系 53 号 (红皮小麻自
交一代选育)杂交选育而成
C13 雄性不育材料 C19 与川苎 4 号的杂交后代
C26 雄性不育资源材料 C7 与湘苎 5 号的杂交后代
川苎 7 号 (川 7) C13 ×B8
川苎 8 号 (川 8) C26 ×B8
川苎 9 号 (川 9) C4 ×B16
112 　ISSR 引物的筛选及 PCR 产物的检测
分别选取供试 (表 1) 植株的幼嫩叶片适量 ,用液
氮研磨成粉 ,利用 SDS 法[9 ] 提取苎麻总 DNA。试验中
采用的 100 条 ISSR 引物由上海申能博彩生物科技有
限公司合成。PCR 反应体系体积 25μl ,包括 10 ×PCR
Buffer 215μl , 25mmolΠL MgCl2 115μl , 10μmolΠL 引物 1μl ,
2mmolΠL dNTP 1μl , ddH2O 1617μl , 5UΠμl Tag 酶 013μl
和模板 DNA 2μl (50ng) 。扩增仪为 BIO2RAD 公司生产
的 MyCycleTM Thermal Cycler , 扩增程序为 94 ℃预变性
3min ; 94 ℃变性 1min ,52 ℃～54 ℃复性 1min ,72 ℃延伸
2min ,40 个循环 ;72 ℃延伸 10min。取扩增产物 15μl 加
入 3μl 溴酚蓝 ,在含 EB 的 1 % 琼脂糖凝胶、1 ×TAE 缓
冲液中电泳 ,最后在 GDS2Gel Dol 2000 紫外凝胶成像
系统下 (Bio2RAD 公司)扫描照相。
113 　PCR 产物条带统计分析方法
根据电泳结果记录清晰可重复的 ISSR 条带。对
于同一条引物的扩增产物 ,迁移率相同的条带记为一
个位点 ,扩增阳性赋值为 1 ,阴性赋值为 0。扩增结果
中的任一位点若有一个个体不同于其他个体即为一个
多态性位点。计算其扩增带总数和特异带总数 ,并将
0 ,1 矩阵图输入计算机。数据采用 NTSYSpc22102 a 软
件处理 ,计算出各材料间的遗传距离 (genetic distance ,
GD) ,UPGMA 聚类分析。
114 　川苎 8 号后代的育性调查与连锁分析
在苎麻开花时期 ,对川苎 8 号的自交后代单株进
行育性调查 (方法参见文献 [ 2 ]) 和 ISSR 扩增 , 并对育
性调查与扩增结果进行连锁分析。重组率计算公式
为 :重组率 = 重组型植株数/ 总株数 ×100 %。
115 　特异 ISSR 分子标记的克隆与序列测定
获得的与雄性不育相关的 ISSR2PCR 扩增产物 ,经
1 %的琼脂糖凝胶电泳后用 DNA 回收试剂盒 (上海申
能博彩公司) 进行回收。并将回收产物连接到载体
pMD182T( TaKaRa 公司 ) , 将连接产物转化 E. coli
DH5α感受态细胞后 ,涂布于含 IPTG、X2gal、Amp 的 LB
固体培养基上 ,37 ℃培养过夜后进行兰白斑筛选。随
机挑选 6 个左右的白色单菌落接种到含 Amp 的 LB 液
体培养基里 37 ℃振荡培养。以提取的质粒为模板 ,通
用引物 M13F、M13R 进行 PCR 扩增 ,筛选得到的阳性
克隆送上海英骏公司测序。
2 　结果与分析
211 　引物筛选的结果与 ISSR 分子标记的多态性
以混合 DNA 1 (B8、B16、C4、C13) 和混合 DNA 2
(C26、川 7、川 8、川 9) 为模板筛选 100 条 ISSR 引物。
其中有 56 条引物可以扩出条带 ,21 条引物 (表 2) 扩增
效果相对较好。再利用筛选出的 21 条 ISSR 引物进行
扩增 ,供试的 8 份材料中扩增出 86 条带 ,平均每条引
物扩增出的条带数为 411 条。其中多态性位点 71 个 ,
各引物扩增出的位点数在 3～8 个不等 ,平均每条引物
可以检测到 314 个多态性位点。各引物对 8 份材料的
扩增条带也有所不同。
212 　供试材料间的遗传距离分析
481 核　农　学　报 22 卷
表 2 　本研究中所用的 21 条 ISSR 引物
Table 2 　21 ISSR primers used in this study
引物
primer
序列
sequence (5′→3′)
引物
primer
序列
sequence (5′→3′)
U822 TCT CTC TCT CTC TCT CA U848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG
U823 TCT CTC TCT CTC TCT CC U853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT
U824 TCT CTC TCT CTC TCT CG U854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG
U826 ACA CAC ACA CAC ACA CC U855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT
U829 TGT GTG TGT GTG TGT GC U856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA
U835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC U857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG
U836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA U859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC
U841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC U886 VDV CTC TCT CTC TCT CT
U842 GAG AGA GAG AGA GAG AYGU888 BDB CAC ACA CAC ACA CA
U843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA U889 DBD ACA CAC ACA CAC AC
U845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG
　　根据获得的 ISSR 条带 ,计算材料间的遗传距离
( GD)共得到 29 个 GD 值 (表 3) 。各材料间的 GD 值变
异范围为 :01114～31500。川 7 与川 8 之间的 GD 值最
小 (01114) ,表明二者遗传关系最近。C26 与 B8、B16、
C13、川 7、川 8、川 9 间及 C4 与 B8 间 GD 值最大
(31500) ,说明它们遗传关系最远。
表 3 　8 份材料的遗传距离矩阵
Table 3 　Distance matrix of 8 materials
B8 B16 C4 C13 C26 川 7 川 8 川 9
B8 0
B16 01308 0
C4 31500 01830 0
C13 01347 01253 11275 0
C26 31500 31500 01289 31500 0
川 7 01219 01389 01896 01308 31500 0
川 8 01203 01327 01830 01368 31500 01114 0
川 9 01203 01157 01830 01253 31500 01203 01253 0
213 　聚类分析
聚类分析结果 (图 1)显示 8 份苎麻材料聚为两大
类。其中第一大类又分为两小类 ,分别包括 B8、川 7、
川 8 和 B16、川 9、C13 ;C4、C26 聚为第二大类。
图 1 　8 份供试材料间的遗传相似关系聚类图
Fig. 1 　Polygenetic tree of 8 cultivars (lines)
of Boehmeria nivea
214 　苎麻育性调查与 ISSR 分子标记
对 60 株川 8 的自交后代进行育性调查 ,发现有 42
株可育、18 株不育 ,其比例接近 3 :1。在 ISSR 引物的
筛选中发现 U835 可从川 8 的亲本 C26 和B8 中扩增出
一条 700bp 左右的差异带 ,该条带仅存在于可育亲本
B8 中 ,这一结果表明这条差异带可能是与育性相关的
ISSR 标记 (图 2) 。
图 2 　引物 U835 扩增图 (箭头标明差异带)
Fig. 2 　The result of ISSR amplification of primer U835
M: Marker ; 1 : 川 7 ; 2 : 川 8 ; 3 : 川 9 ;
4 : C13 ; 5 : B16 ; 6 : C4 ; 7 :B8 ; 8 : C26
215 　序列测定与 SCAR 标记的建立
对引物 U835 扩增得到的大片段进行克隆测序得
其全长为 658bp (图 3) ,命名为 U835658 ,其中 AT含量高
达 62 % ,是一个富含 AT的序列。在 NCBI中对 U835658
的核苷酸序列进行 Blast 比对 ,未发现与 U835658具有较
高同源性的片段 ;用 BlastX比对 ,也未查到高同源性蛋
白序列 ;用 Biodit 软件分析该序列 ,发现其中有多次
CTCTCTCTCT的重复 ,因此我们推测 U835658 可能不属
于编码序列 ,而是一类包含微卫星的低拷贝重复序列。
为了获得与 C26 育性相关序列 U835658 的特异分
子标记 ,本研究以 U835658 的核苷酸序列为基础 ,设计
了 1 对 特 异 性 PCR 引 物 U2F ( 5′2
CTGTCACGTGGCTTCCTATG23′) 和 U2R ( 5′2
GAGAGGTCTGGCCAAAAAGTC23′) ,预测目的片段大小
为 535bp ,设计的引物位置见图 3 划横线处。利用 U2F
和 U2R 对育性分离群体进行扩增 ,验证 U835658的特异
性 (图 4) ,结果发现退火温度在 55 ℃～60 ℃之间均能
扩增出目标片段。其中不育材料 C26、不育单株混合
池和绝大部分不育单株不能扩增出目标片段 ,可育亲
本 B8、可育单株混合池及绝大部分可育单株均能扩增
出目标片段。此外 ,对所获得的 60 个育性分离后代进
行分析 ,发现仅有 2 个重组体 ,重组率为 313 %。据此 ,
认为 U835658建立的引物序列完全可以作为苎麻育性
跟踪的分子标记。
581　2 期 用 ISSR 分析四川苎麻品种 (系)间的遗传关系及雄性不育分子标记的建立
图 3 　U835658核苷酸序列
Fig. 3 　The nucleotide sequence of U835658
方框代表 ISSR 引物 U835 序列。下划线代表特异引物 U2F 和 U2R
图 4 　引物 U2F、U2R 对育性分离后代材料的分析
Fig. 4 　Analysis on DNA from male2sterile individuals in population with primer U2F and U2R.
B : B8 ; C : C26 ; F : 雄性可育单株 ; S :雄性不育单株
3 　讨论
本研究利用 ISSR 技术对 8 份四川苎麻材料进行
分析 ,构建了供试材料间的遗传相似关系聚类图 (图
1) 。聚类结果进一步印证了品种川 7、川 8、川 9 的亲
缘关系。说明 ISSR 技术除了可以用于遗传作图、基因
定位、进化和系统发育研究外 ,还可以用来建立一套品
种鉴定体系即品种 ISSR 指纹图 ,以实现品种保护。此
外 ,从聚类结果还可以看出川 7、川 8、川 9 与它们父本
(恢复系) 的遗传相似程度高于与它们母本 (不育系)
的 ,表现出优良苎麻杂交种特有的偏父本 (恢复系) 遗
传特性。这种现象是由苎麻本身的遗传机制所造成 ,
还是由品种选育所造成 ,尚待进一步研究。
杂种优势主要来源于杂合基因间的相互作用 ,其
遗传学基础在于双亲间的遗传差异。目前 ,许多学者
利用分子标记来分析亲本间遗传距离与杂种优势的关
系 ,进而指导育种实践。孙传清等[10 ] 研究表明以双亲
在基因组上的差异来研究或预测杂种优势要优于表型
性状。罗小金等[11 ]的研究认为在总体水平上 ,在一定
的遗传距离范围内 ,F1 产量或其超亲优势有随双亲遗
传差异的扩大而增加的趋势 ,但并非所有的材料都有
这一趋势。本研究所用的品种川 7、川 8、川 9 亲本间
的遗传关系差异较大 ,体现出杂种优势 ,并表现出偏父
本 (恢复系)遗传。所以对苎麻来说 ,可以利用遗传关
系较远 ,且恢复系性状优良、遗传力强的亲本来选配杂
交组合。
雄性不育现象在自然界中广泛存在 ,并在育种中
得到广泛应用。关于雄性不育的分子机理 ,在玉米、高
粱、水稻、烟草和向日葵等物种中研究的比较深入[12 ] ,
但在苎麻中的研究则相对较少 ,最近侯思名等[13 ] 对选
育的苎麻细胞质不育系 GS1421 (A) 的线粒体中与育性
相关的基因进行了分子标记。张中华等[2 ]利用优良雄
性不育系 C26 和恢复系 B8 配制的两系杂交苎麻组合
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川 8 ,表现出显著的杂种优势 ,但对不育系 C26 雄性不
育的遗传机制未作研究。本研究对 60 株川 8 的自交
后代进行育性调查得出可育和不育的比例接近 3∶1 ,
故苎麻雄性不育基因受到 1 对主效的隐性基因控制。
标记辅助选择是新发展的研究热点。它不受环境
条件的限制 ,能实现苗期选择 , 因而可减少工作量 ,
缩短育种周期。本研究利用 ISSR 的方法 ,建立了 C26
雄性不育基因的分子标记 ,其重组率较低 ,并且已转化
成 SCAR 标记 ,可以快速地鉴定单株的育性 ,从而降低
选择的工作量 ,提高选择效率。因此 ,建立苎麻育性分
子标记辅助选择系统为有效利用不育资源 ,加快杂交
品种的选育进程创造了条件。
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